Isolierung von braunen Adipozyten aus murinem interskapulärem braunem Fettgewebe für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse

Sowohl Mäuse als auch Menschen haben zwei Arten von Fettgewebe: weißes Fettgewebe (WAT) und braunes Fettgewebe (BAT)¹. WAT speichert Energie in Form von Triglyceriden in weißen Adipozyten, und die braunen Adipozyten (BAs) von BAT leiten chemische Energie als Wärme² ab. Basierend auf ihrem Entwicklungsursprung werden BAs weiter kategorisiert in klassische BAs (cBAs), die während der Embryonalentwicklung entstanden sind, und aus weißen Adipozyten gewonnene BAs (beige/brite Zellen, die unter Stressbedingungen aus weißen Adipozyten umgewandelt werden)³. BAs sind multilokulär und exprimieren das thermogene Proteinentkopplungsprotein 1 (UCP1)⁴. Das interskapuläre BAT-Depot (iBAT) ist eines der primären cBAs-Depots bei kleinen Säugetieren⁵, während beige Zellen innerhalb von WAT⁶ dispergiert sind.

Aufgrund ihrer Art der Energieableitung haben BAs als therapeutisches Ziel zur Verringerung von Fettleibigkeit viel Aufmerksamkeit erhalten⁷. Um BAs zur Behandlung von Fettleibigkeit zu nutzen, ist es wichtig, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die die Funktion, das Überleben und die Rekrutierung von BAs steuern. Fettgewebe einschließlich BAT und WAT sind heterogen. Abgesehen von Adipozyten enthält Fettgewebe viele andere Zelltypen wie Endothelzellen, mesenchymale Stammzellen und Makrophagen⁸. Obwohl genetische Werkzeuge zur spezifischen Depletion von Kandidatengenen in Mäuse-BAs verfügbar sind, wie UCP1::Cre Linie⁹, sind Techniken zur Reinigung von BAs von BAT oder WAT begrenzt, was es schwierig macht, BAs auf Einzelzellebene zu untersuchen. Darüber hinaus wird ohne reine BAs die Beziehung zwischen BAs und Nicht-BAs nicht klar abgegrenzt. Zum Beispiel wurde der von Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktorrezeptor alpha (PDGFRα) als Marker für undifferenzierte mesenchymale Zellen verwendet und wird in den endothelialen und interstitiellen Zellen von BAT exprimiert. In kalt gestressten BAT entstehen durch PDGFRα-positive Vorläuferzellen neue BAs¹⁰. PDGFRα wird durch seinen Liganden PDGF aktiviert, einen Wachstumsfaktor, der das Wachstum und die Proliferation von mesenchymalen Zellen reguliert¹¹; Es ist jedoch unklar, ob BAs das Verhalten von PDGFRα-positiven Vorläuferzellen beeinflussen, indem sie PDGF sezernieren.

Vor kurzem wurde ein BAs-Isolationsprotokoll veröffentlicht, das auf Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS)¹² basiert. In diesem Protokoll wurde 3% ige Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung verwendet, um BAs von Nicht-BAs zu trennen, und die angereicherten BAs wurden durch FACS weiter gereinigt. Die Anwendung dieses Protokolls ist durch die Anforderung des FACS-Prozesses begrenzt, der sowohl auf Geräten als auch auf FACS-Betriebserfahrungen beruht. In dieser Studie wurde ein neues Protokoll zur Isolierung von BAs aus BAT entwickelt. Die durch dieses Protokoll isolierten BAs können direkt für Gen- und Proteinexpressionsstudien verwendet werden. Darüber hinaus deuten Daten aus dieser Studie darauf hin, dass BAs eine wichtige PDGF-Ressource sind.

Alle Mäuse wurden unter pathogenfreien Bedingungen gehalten, und alle Verfahren wurden vom Masonic Medical Research Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. UCP1::Cre⁹ und Rosa 26^{tdTomato-Mäuse} der Linien¹³ wurden zuvor berichtet. Alle Mäuse wurden bei Raumtemperatur mit einem 12 h Hell-Dunkel-Zyklus gehalten.

1. Herstellung der Lösungen und des braunen Fettgewebes (BVT)

1. Aufschlusslösung und Trennlösung in 15 ml Zentrifugenröhrchen vorbereiten.
2. 10 ml BAT-Aufschlusslösung: Zu 10 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) werden 3,5 mg/ml Dispase II, 1 mg/ml Kollagenase II und 10 mM CaCl₂ hinzugefügt, um eine BAT-Aufschlusslösung herzustellen.
3. 10 mL 12%ige Iodixanollösung (Trennlösung): Mischen Sie 1 ml 10x PBS, 2 ml 60% Iodixanol, 0,01 ml 1 M MgCl2, 0,025 ml 1 M KCl, 0,1 ml 0,2 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 6,865 ml_ddH2O, um₁₂% Iodixanol zu erhalten.
4. Euthanasieren Sie eine erwachsene Maus mit CO₂ -Überdosis. Füllen Sie den Mauskäfig kurz mit 100% CO₂ bei einer Verdrängungsrate von 10-30% Käfigvolumen pro min. 5 min später, bestätigen Sie den Tod, indem Sie auf das Fehlen einer sichtbaren Atmung prüfen.
5. Sezieren Sie das Tier und sammeln Sie interskapuläre BAT. Entfernen Sie WAT und Muskelschichten unter einem Stereomikroskop.
6. Für eine ausreichende Verdauung schneiden Sie jeden BAT-Lappen in ~ 3 mm³ Teile und legen Sie sie in einen sauberen 50-ml-Kolben mit einem Metallrührstab und 5 ml Aufschlusslösung. Lassen Sie den Kolben mit BAT und Aufschlusspuffer vor Beginn der Verdauung 1 h auf Eis ruhen.
   HINWEIS: In den folgenden Schritten wurden etwa 80 mg BAT zur Isolierung brauner Adipozyten verwendet.

2. Isolationsverfahren für BAs

1. Stellen Sie den Kolben auf einen Magnetrührer, der in einem Inkubator eingeschlossen ist. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 60 U/min bzw. die Temperatur des Inkubators auf 35 °C ein. Die Verdauung dauert ca. 30 min. Wenn die BAT-Scheiben während der Verdauung Klumpen um den Rührstab bilden, verwenden Sie eine 1-ml-Pipettenspitze, um das aggregierte Gewebe zu stören.
2. Legen Sie einen 70-μm-Siebfilter auf ein sauberes 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie etwa 4 ml Zellsuspension durch das Sieb. Waschen Sie das Sieb mit 4 ml 12% iger Jodixanollösung. Pipettieren Sie auf und ab, um die Zellen und die Jodixanollösung zu mischen. Die Zellmischung wird in zwei klare 5 mL Polystyrol-Reagenzgläser überführt.
   HINWEIS: Am Ende der Verdauung sollte die Verdauungslösung trüb sein, was auf eine ausreichende Verdauung hinweist. Verwenden Sie jedes Mal frische Verdauungslösung. Nach der Zubereitung sollte die Aufschlusslösung innerhalb von 2 h verwendet werden.
3. Wiederholen Sie die Schritte 2.2 und 2.3 noch einmal, wenn die Verdauung nicht ausreicht.
4. Lassen Sie die klaren Polystyrolröhrchen mit Trennlösung und BAs 1 h auf Eis. Die BAs bilden eine Schicht auf der Oberseite.
5. Nehmen Sie 20 μL der isolierten BAs zur mikroskopischen Untersuchung heraus.

3. RNA- und Proteinisolierung aus BAs

1. Pipettieren Sie die BAs-Schicht in zwei 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zur RNA- und Proteinisolierung. Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Jodixanollösung, ohne die BAs-Schicht zu stören.
2. Fügen Sie 1 ml Trizol hinzu, um gleichzeitig RNA, DNA und Protein in die Zelllösung zu isolieren. Ausreichend mischen, um die Zellen zu lysieren.
3. Fügen Sie 200 μL Chloroform hinzu, um die Phasen zu trennen.
4. Zentrifugieren Sie das Röhrchen für 9.981 x g für 10 min bei 4 °C.
5. Verwenden Sie nach der Zentrifugation die wässrige Phase zur RNA-Isolierung. In dieser Studie wurde die Gesamt-RNA für die reverse Transkription verwendet, und die quantitative RT-PCR wurde mit Real-Time PCR durchgeführt. Primer-Sequenzen sind in der Materialtabelle aufgeführt.
6. 300 μL der organischen Phase in ein 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
7. Zur organischen Phase 2,5 Volumen 100% Ethanol und Wirbel für 10 s hinzufügen.
8. Fügen Sie 200 μL 1-Bromo-3-chlorpropan und Wirbel für 10 s hinzu.
9. Fügen Sie 600 μL doppelt destilliertes Wasser und Wirbel für 10 s hinzu.
10. Lassen Sie die Mischlösung 10 min bei Raumtemperatur stehen.
11. Zentrifugieren bei 9.981 x g für 10 min bei 4 °C. In diesem Schritt werden die Phasen getrennt. Die Proteinphase ist in der mittleren Schicht lokalisiert.
12. Entfernen Sie die obere wässrige Lösung. Geben Sie 1 ml 100% Ethanol in die restliche Lösung.
13. Zentrifuge für 10 min, 9.981 x g, 4 °C. Nach der Zentrifugation bildet sich das Proteinpellet. Verwerfen Sie den Überstand.
14. Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 100% Ethanol.
15. Zentrifuge für 10 min, 9981 x g, 4 °C. Speichern Sie das Pellet und entsorgen Sie den Überstand.
16. Trocknen Sie das Pellet 10 min bei Raumtemperatur an der Luft.
17. Messen Sie das Gewicht des nassen Pellets. Fügen Sie 1% ige SDS-Lösung in einem Verhältnis von 20 μL / mg Pellet hinzu.
18. Lösen Sie das Pellet auf, indem Sie das Röhrchen in einen erhitzten Shaker geben. Stellen Sie die Temperatur auf 55 °C und die Geschwindigkeit auf 11 x g ein. Es dauert normalerweise 5-10 Minuten, um das Proteinpellet vollständig aufzulösen.
    HINWEIS: Die Konzentration des gelösten Proteins kann mit dem BCA-Assay¹⁴ gemessen werden.

Herstellung von interakapular BAT zur Isolierung brauner Adipozyten
Der Isolationsprozess für braune Adipozyten (BAs) ist in Abbildung 1A dargestellt. Der gesamte Prozess, von der Herstellung von BVT und Aufschluss-/Trennlösungen bis zur Gewinnung isolierter BAs, dauert etwa 4 Stunden.

Bei erwachsenen Mäusen gibt es reichlich BAT in der interskapulären Region. Diese interskapuläre BAT (iBAT) wird von Muskelschichten und WAT bedeckt (Abbildung 1B). Vor Beginn des Verdauungsvorgangs müssen die Muskelschichten und WAT entfernt werden, um sauberes iBAT zu erhalten (Abbildung 1C). In einem veröffentlichten BAs-Isolationsprotokoll wurde gehacktes BAT für BAs-Isolierung12 verwendet. In dieser Studie ergab der Aufschluss von BAT der Größe 3 mm3 (Abbildung 1D) mehr BAs als gehackte BVT.

Trennung von BAs von Nicht-BAs mit 3% BSA-Lösung
Nach dem iBAT-Aufschluss wurden dissoziierte BAs mit Nicht-BAs im Aufschlussprodukt gemischt. Da BAs Lipidtröpfchen enthalten, ist ihre Dichte niedriger als bei Nicht-BAs. Die Dichte der BAs ist jedoch nicht niedrig genug, um sie effizient an die Spitze einer regulären PBS-Lösung schwimmen zu lassen. PBS mit 3% Rinderserumalbumin (BSA) wurde verwendet, um BAs von Nicht-BAs12 zu trennen, was in dieser Studie erfolgreich wiederholt wurde (Abbildung 2A).

Rosa 26 tdTomato ist eine Reportermauslinie, die nach Cre-vermittelter Rekombination13 starkestdTomato (tdTom) Fluoreszenzprotein exprimiert. Ucp1::Cre-transgene Mäuse exprimieren Cre-Rekombinase in den BAs9. Die Ucp1::Cre-Mauslinie wurde mit Rosa 26 tdTomato-Mäusen gekreuzt, um BAs genetisch mittdTom zu markieren (Abbildung 2B). Zur Validierung des BAs-Isolationsverfahrens wurde iBAT von Ucp1::Cre;tdTom/+ Mäusen dissoziiert. Die meisten Zellen, die in der obersten Schicht der BSA-Lösung angereichert waren, waren himbeerförmig und enthielten multilokuläre Lipidtröpfchen. Darüber hinaus waren die meisten dieser Himbeerformzellen tdTom-positiv (Abbildung 2C), was bestätigt, dass es sich um braune Adipozyten handelt.

Trennung von BAs von Nicht-BAs mit 6%iger Jodixanollösung
3% BSA-Trennlösung angereicherte BAs. Es war unklar, ob diese isolierten BAs für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse verwendet werden können. RNA und Protein wurden dann aus den angereicherten BAs extrahiert. Die RNA-Extraktion wurde erfolgreich nach dem Standard-RNA-Isolierungsverfahren durchgeführt. Das Standard-Trizol-Proteinisolationsprotokoll, auch bekannt als Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Methode (GTPC-Methode), funktionierte jedoch nicht gut, was mühsam war und eine sehr geringe Proteinausbeute aufwies. Daher wurde eine verbesserte Proteinisolierungsmethode angewendet, um Protein aus Trizol-lysierten BAs zu extrahieren.

In diesem verbesserten GTPC-Protokoll wurden Ethanol, Bromchlorpropan und Wasser zur Extraktion von Protein aus der organischen Phase15 verwendet. Nach Zugabe von Ethanol, Bromchlorpropan und Wasser in die organische Phase und nach Zentrifugation bildete sich zwischen der wässrigen Phase und der organischen Phase ein Proteinpellet (Abbildung 3A). Das Proteinpellet wurde dann mit 100% Ethanol gewaschen und in 1% SDS gelöst. Diese verbesserte GTPC-Methode wurde verwendet, um Protein aus iBAT- und BSA-lösungsangereicherten BAs zu extrahieren. Obwohl das BAT-Proteinpellet leicht in 1% SDS gelöst werden konnte, war der größte Teil des isolierten BAs-Proteinpellets nicht löslich. Anschließend wurde das gelöste Protein mit SDS-PAGE Gel untersucht. Wie in einem Coomassie-blau gefärbten SDS-PAGE-Gel (Abbildung 3B) gezeigt, war eine massive Proteinbande um 60 kDa in den isolierten BAs, aber nicht in den BAT-Proben vorhanden. Da das Molekulargewicht von BSA 66 kDa beträgt und reichlich BSA in der BAs-Trennlösung vorhanden ist, sollte diese dominante Proteinbande BSA sein. Diese Daten deuten darauf hin, dass das BSA aus der BAs-Trennlösung die Proteinextraktion stört.

Iodixanol ist ein nichtionisches und iso-osmotisches Gradientenmedium16 , das häufig für die Reinigung von Zelle17 und des adenoassoziierten Virus (AAV)18 verwendet wurde. Um BSA-Interferenzen bei Proteinexpressionsstudien zu vermeiden, wurde Iodixanol verwendet, um BSA in einer neuen BAs-Trennlösung zu ersetzen. 3% BSA-Lösung hat eine Dichte von 1,03, die mit 6% Jodixanol ähnlich ist. In 6%iger Iodixanollösung schwammen BAs in 30-60 min nach oben (Abbildung 3C). Die mit dieser Lösung isolierten BAs zeigten eine typische Himbeerform und enthielten multilokuläre Lipidtröpfchen (Abbildung 3D). Proteine, die aus diesen isolierten BAs extrahiert wurden, wurden in SDS-PAGE-Gel gut getrennt (Abbildung 3E).

Um zu überprüfen, ob die 6% ige Iodixanol-Lösung BAs effizient von Nicht-BAs trennte, markierten wir die BAs genetisch mit tdTom und untersuchten die Zellen, die sich in der klaren 6% Iodixanol-Lösung befanden. Nach der Trennung der BAs von Nicht-BAs (Schritt 2.4) wurde die 6%ige Iodixanollösung unterhalb der BAs-Schicht 6-mal mit PBS verdünnt und anschließend bei 600 x g für 5 min zentrifugiert. Nach der Zentrifugation bildete sich auf dem Boden ein kleines rotes Blutkörperchenpellet, bei dem es sich um stromale vaskuläre Fraktionszellen handeln könnte. Wie in Abbildung 3 gezeigt, waren Zellen aus der BAs-Schicht tdTom-positive Zellen (Abbildung 3F); Die aus dem Pellet gewonnenen Zellen waren jedoch tdTom-negativ (Abbildung 3G). Darüber hinaus waren keine offensichtlichen Lipidtröpfchen in den tdTom-negativen Zellen sichtbar. Diese Daten deuten darauf hin, dass unser neues Protokoll die BAs effizient von den fettfreien Zellen trennen kann.

Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die Isolierung von BAs mit 3% BSA-Lösung die nachfolgende biochemische Studien stört und darauf hindeutet, dass 6% Jodixanol-Lösung besser ist als 3% BSA-Lösung zur Isolierung von BAs.

Gen- und Proteinexpressionsanalyse mit isolierten BAs.
Zur Validierung dieses neuen BAs-Isolationsverfahrens auf molekularer Ebene wurde die Expression von drei Genen zwischen BAT und isolierten BAs verglichen: Ucp1, Pdgfa und Pdgfra. In BAT wird Pdgfra in Endothelzellen und interstitiellen Zellen exprimiert, und PDGFRα-positive Zellen sind mutmaßliche Vorläuferzellen10. Die mRNA-Spiegel von Ucp1 und Pdgfa waren in den isolierten BAs signifikant höher als in den BAT (Abbildung 4A,B). Im Gegenteil, die mRNA von Pdgfra wurde nur in BAT nachgewiesen (Abbildung 4B).

PPARγ ist ein transkriptioneller Faktor, der die Entwicklung von Fettgewebe steuert, UCP1 ist ein Mitochondrienprotein und PDGFRα ist ein Membranrezeptorprotein. Diese drei Proteine repräsentieren Proteine, die in verschiedenen zellulären Kompartimenten verteilt sind. Western Blots wurden durchgeführt, um zu testen, ob Proteine, die aus Trizol-lysierten BAs und BAT extrahiert wurden, für die Proteinexpressionsanalyse geeignet sind. UCP1 und PPARγ wurden sowohl in BAs als auch in BAT nachgewiesen (Abbildung 4C,D), was bestätigt, dass das Gesamtprotein, das aus den Trizol-lysierten BAs oder BAT isoliert wurde, für Western Blot geeignet ist. Darüber hinaus wurde das UCP1-Protein in Übereinstimmung mit den qRT-PCR-Ergebnissen in BAs angereichert (Abbildung 4C); während PDGFRα nur in BVT, nicht aber in reinen BAs nachgewiesen wurde (Abbildung 4D). Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass unsere neue BAs-Isolationsmethode effizient ist und legen nahe, dass BAs, die mit dieser Methode angereichert wurden, direkt für Gen- und Proteinexpressionsstudien verwendet werden können.

Abbildung 1: Vorbereitung von iBAT zur Isolierung brauner Adipozyten . (A) Arbeitsablauf des Isolationsverfahrens für braune Adipozyten. (B) Ventrale Ansicht des interskapulären Gewebes, das BVT, WAT und Muskelschichten enthält. c) Interskapuläre BAT (iBAT). Muskelschichten und WAT neben iBAT wurden entfernt. (D) Ein repräsentatives Bild von iBAT-Stücken, die zur Isolierung brauner Adipozyten verwendet werden. B-D, Maßstabsbalken = 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Trennung von braunen Adipozyten aus der Verdauungslösung. (A) Bilder von dissoziierten braunen Adipozyten vor und nach der Trennung. 3% BSA-Lösung wurde verwendet, um braune Adipozyten von nicht-braunen Adipozyten zu trennen. Maßstabsbalken = 1 cm. (B) Schematische Darstellung der genetischen Markierung brauner Adipozyten mit tdTomato-Fluoreszenzprotein. (C) Bilder von isolierten braunen Adipozyten. DIC, differentieller Interferenzkontrast. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Extraktion des Gesamtproteins aus lysierten braunen Adipozyten . (A) Trennung der Proteinphase von der organischen Phase. (B) Coomassie-Färbung von SDS-PAGE-Gel. Das Gesamtprotein wurde aus BAT oder 3% BSA-Lösung gereinigten braunen Adipozyten extrahiert. Die BSA-Proteinbande wurde durch einen Pfeil angezeigt. (C) Braune Adipozytenschicht gebildet auf 6% iger Jodixanollösung. Maßstabsbalken = 1 cm. (D) Braune Adipozyten isoliert mit 6%iger Jodixanollösung. Braune Adipozyten wurden durch gelbe Pfeile gekennzeichnet. Maßstabsbalken = 50 μm. (E) Coomassie-Färbung von SDS-PAGE-Gel. Das Gesamtprotein wurde aus BAT oder 6% mit Jodixanollösung angereicherten BAs extrahiert. (F) Bilder von tdTom-markierten braunen Adipozyten. (G) Bilder von Zellen, die aus der Jodixanollösung unterhalb der BAs-Schicht gewonnen wurden. F und G, Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Gen- und Proteinexpressionsanalyse isolierter brauner Adipozyten. Braune Adipozyten, die mit der Iodixanol-Methode isoliert wurden, wurden in diesen Gen- und Proteinexpressionsstudien verwendet. (A,B) qRT-PCR-Messung der Genexpression. Die mRNA-Spiegel wurden auf 36B4 normalisiert. N=3. Student t test, *, P<0.01; **, S<0.01. (C) Western Blotting von PPARγ und UCP1. (D) Western Blotting von PDGFRα. C und D, Ponceau S-gefärbte Membran wurde als Belastungskontrolle verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Nichts