Natural Killer (NK) und CAR-NK Zellexpansionsmethode unter Verwendung der membrangebundenen IL-21-modifizierten B-Zelllinie

Natürliche Killerzellen (NK) sind eine wichtige Untergruppe von Lymphozyten, die CD56 exprimieren und denen die Expression des T-Zell-Markers CD3 ^1,2 fehlt. Konventionelle NK-Zellen werden als angeborene Immunzellen klassifiziert, die für die Immunüberwachung von viral infizierten Zellen und Krebszellen verantwortlich sind. Im Gegensatz zu T-Zellen erkennen NK-Zellen infizierte oder bösartige Zellen mithilfe von CD16 oder anderen aktivierenden Rezeptoren und benötigen nicht die Bildung eines Komplexes zwischen Antigenpeptiden und Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse I Molekülen ^3,4. Neuere klinische Untersuchungen mit chimären Antigenrezeptor (CAR)-NK-Zellen zur Behandlung rezidivierender oder refraktärer CD19-positiver Krebserkrankungen (Non-Hodgkin-Lymphom oder chronische lymphatische Leukämie [CLL]) zeigten die herausragenden Sicherheitsvorteile von CAR-NK-Zellen⁵. Zum Beispiel ist die CAR-NK-Zellinfusion mit minimaler oder vernachlässigbarer Graft-versus-Host-Krankheit (GVHD), Neurotoxizität, Kardiotoxizität und Zytokinfreisetzungssyndrom (CRS^{) assoziiert6,7,8,9,10}. Konventionelle Methoden zur Erweiterung humaner NK-Zellen zeigten jedoch erschöpfende Phänotypen mit starker brudermörderischer Tötung und Telomermangel, was eine große Herausforderung darstellt, eine ausreichende Anzahl funktioneller NK-Zellen für die adoptive Immuntherapie zu erhalten¹¹.

Um diese Herausforderungen zu meistern, wurde eine Methode entwickelt, um primäre NK-Zellen direkt aus unfraktionierten peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) oder Nabelschnurblut (CB) unter Verwendung einer bestrahlten und gentechnisch veränderten 721.221 (im Folgenden 221) Zelllinie, einer menschlichen B-lymphoblastoiden Zelllinie mit geringer Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen³, zu expandieren. Frühere Studien zeigten die Bedeutung von IL-21 für die NK-Zellexpansion; Daher wurde ein gentechnisch verändertes membrangebundenes IL-21 entwickelt, das eine Version der 721.221-Zelllinie (ab sofort 221-mIL-21) exprimiert 11,12,13,14,15. Die Ergebnisse zeigten, dass 221-mIL-21-Feeder-Zell-expandierte primäre NK-Zellen für etwa 2-3 Wochen auf ein durchschnittliches >40.000-faches mit anhaltend hoher NK-Zellreinheit erweitert wurden. Weitere Informationen zur Anwendung dieses Protokolls finden Sie in Yang et ^al.16.

Dieses Protokoll zielt darauf ab, das schrittweise Verfahren der neuartigen Expansion von PBNK-, CBNK-, Gewebe-abgeleiteten NK und CAR-NK-Zellen ex vivo zu demonstrieren.

Menschliches Gewebe und blutbezogene Arbeit in diesem Protokoll folgt den Richtlinien des Rutgers University Institutional Review Board (IRB)

1. NK-Zellexpansion aus Lebergewebe (Tag 0), wie in Abbildung 1 gezeigt.

HINWEIS: Die anfängliche Zellzahl und Lebensfähigkeit korreliert stark mit der Zeit seit der Organentnahme und der anfänglichen Gewebeprobenmenge. Wenn jedoch Gewebe in 30 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) gegeben und über Nacht auf Eis oder im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt werden, können NK-Zellen noch bis zu 24 Stunden später mit hoher Reinheit und Lebensfähigkeit expandiert werden.

1. Identifizieren Sie lebensfähige Gewebebereiche, um Lymphozyten aus Geweben und Schnitten mit sterilen chirurgischen Geräten zu erhalten.
2. Legen Sie Gewebe in 30 ml HBSS (ohne Kalzium oder Magnesium) und halten Sie es auf Eis, bis es bereit ist, sich auf die Isolierung vorzubereiten.
3. Zerkleinern Sie das Gewebe in <0,5 cm große Würfel mit sterilen Rasierklingen oder Scheren und Pinzetten in einer Biosicherheitswerkbank.
4. Bereiten Sie eine 1x Kollagenase-IV-Lösung (1 mg/ml) vor, indem Sie eine 10-fache Brühe in HBSS verdünnen (10x Kollagenase IV: 10 mg/ml oder ~200 U/ml).
5. Legen Sie die gehackten Gewebestücke in die Gewebedissoziatorröhrchen. Füllen Sie die Röhrchen mit nicht mehr als 4 g Gewebe und tauchen Sie die Gewebestücke in ~ 10 ml 1x Kollagenase IV.
   HINWEIS: Die Verwendung von DNase I wird nicht empfohlen, da dies die Lebensfähigkeit und den Ertrag von NK leicht verringern kann. Bitte beachten Sie die Materialtabelle für die spezifischen verwendeten Gewebedissoziatorschläuche.
6. Legen Sie die Gewebedissoziatorröhrchen in einen Gewebedissoziator und mischen Sie es bei 37 °C, um das Gewebe gründlich zu zerkleinern.
   HINWEIS: Bei Lebergewebe kann dies über 30 Minuten dauern. Für brüchigeres Gewebe können etwa 15 Minuten ausreichend sein. Bitte beachten Sie die Materialtabelle für spezifische Gewebedissoziatorröhrchen und den verwendeten Gewebedissoziator.
7. Entfernen Sie die Gewebedissoziatorschläuche und trituieren Sie mit dem Backend einer 5-ml-Spritze durch das 40-μm-Nylonzellsieb. Sammeln Sie das Elutionsmittel und entsorgen Sie die großen unverdauten Fragmente.
8. Das Elutionsmittel bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur herunterdrehen. Asspirieren Sie den Überstand.
9. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 30% Polyvinylpyrrolidon (PVP)-beschichteter Kieselsäure, um Fettzellen zu entfernen, die sonst die endgültige Lymphozytenfraktion kontaminieren.
   1. Um 1x PVP-beschichtete Kieselsäure herzustellen, verwenden Sie eine 9:1-Verdünnung von PVP-beschichteter Kieselsäure in 10x PBS.
      HINWEIS: Die verwendeten PVP-beschichteten Kieselsäuren finden Sie in der Materialtabelle .
   2. Um 30% PVP-beschichtete Kieselsäure herzustellen, verdünnen Sie 1x PVP-beschichtete Kieselsäure mit PBS/HBSS.
10. Das Zellpellet bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur herunterdrehen. Asspirieren Sie den Überstand.
11. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 9 ml R-10-Medien.
    HINWEIS: Informationen zur Zusammensetzung von R-10-Medien finden Sie in der Materialtabelle .
12. Schichten Sie die Zellsuspension vorsichtig über 4 ml Ficoll- oder Lymphozyten-Trennmedien, um Lymphozyten von roten Blutkörperchen und polymorphkernigen Zellen zu trennen.
13. Trennen Sie die Schichten durch Zentrifugieren bei 400 x g für 23 min bei Raumtemperatur bei ausgeschalteter Beschleunigung und Bremse oder bei der niedrigsten Stufe. Dekantieren Sie vorsichtig die obere mittlere Schicht und ernten Sie die Interphase, die gewebeinfiltrierende Lymphozyten enthält.
14. Spülen Sie die Zellen mit 10 ml Medien und fahren Sie mit Zellzählung, Durchflusszytometrie, Aliquotierung und Einfrieren von Zellen oder primärem NK-Expansionsprotokoll fort.

2. Primäre NK-Zellexpansion aus PBMCs (oder CB- oder Organgeweben) (Tag 0), wie in Abbildung 2 gezeigt.

1. Das gefrorene PBMC und die gefrorenen, bestrahlten Feederzellen in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen.
2. Waschen Sie die PBMC- und 100 gammabestrahlten (gy-bestrahlten) 221-mIL-21-Zellen durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 min mit 10 mL R-10-Medien separat.
3. Speichern Sie 1 x 10⁶ Zellen PBMC für die Durchflusszytometrie.
   HINWEIS: Die anfängliche NK-Zellreinheit ist ein wichtiger Faktor bei der Berechnung der NK-Zellexpansionsrate.
4. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml R-10-Medien. Zählen Sie die Zellen mit Trypan Blue.
5. Mischen Sie 5x 10 6 PBMC-Zellen mit 10 x 10 6 Zellen mit 100 Gy-bestrahlten 221-mIL-21-Zellen in einer speziellen^{6-Well-Platte} (siehe Materialtabelle).
6. Fügen Sie 30 ml R-10-Medien hinzu, ergänzt mit humanem IL-2 (200 U/ml) und humanem IL-15 (5 ng/ml) (siehe Materialtabelle).
7. Die spezielle 6-Well-Platte bei 37 °C mit 5%_CO2 inkubieren.
8. Ersetzen Sie die Medien durch R-10-Medien, die mit humanem IL-2 (200 U/ml) und humanem IL-15 (5 ng/ml) ergänzt sind, um die NK-Zellen alle 3-4 Tage zu erhalten.
   HINWEIS: Halten Sie weniger als 20 x 10⁶ Zellen pro Vertiefung für jede weitere Erweiterung bei jedem Medienwechsel bereit. Stellen Sie für die beste Lebensfähigkeit sicher, dass die Gesamtzahl der Zellen in jeder Vertiefung 100 x 10⁶ Zellen nicht überschreitet.
9. Zeichnen Sie die Gesamtzahl der Zellen und die Lebensfähigkeit auf und führen Sie alle 3-4 Tage eine Durchflusszytometrie durch, um die NK-Zellexpansionsrate zu berechnen.

3. Anheftung von 293T-Zellen (Tag 2), wie in Abbildung 2 dargestellt.

1. Teilen Sie 1,8 x 10⁶ 293T-Zellen in 11 ml D-10-Medien pro behandelter 100-mm-Platte auf.
   HINWEIS: Informationen zur Zusammensetzung der D-10-Medien finden Sie in der Materialtabelle .
2. Inkubieren Sie 293T-Zellen bei 37 °C mit 5%_CO2.

4. Retrovirus-Transfektion (Tag 3)

1. Mischen Sie in einem 1,7-ml-Röhrchen 470 μL reduzierte Serummedien mit 30 μL Transfektionsreagenz.
   HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie die spezifischen reduzierten Serummedien und das verwendete Transfektionsreagenz.
2. In einem separaten 1,7-ml-Röhrchen werden 2,5 μg pRDF-Plasmid, 3,75 μg Pegpam3-Plasmid und 2,5 μg CAR-Konstrukt im SFG-Vektor in das reduzierte Serummedium gegeben, so dass das Endvolumen 500 μL beträgt.
3. Mischen Sie die Lösungen in den Schritten 4.1 und 4.2 tropfenweise.
4. Inkubieren Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur für 15 min.
5. 1 ml der Mischung aus Schritt 4.4 bis 293T Zellplatte an Tag 1 tropfenweise zugeben.
6. Die Platte(n) werden bei 37 °C mit 5% CO2 für 48-72 h inkubiert.

5. Retronectin-Plattenbeschichtung (Tag 3)

1. Verdünnen Sie Retronektinprotein mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine Endkonzentration von 50-100 μg / ml.
2. Geben Sie 500 μL des verdünnten Retronektins in jede Vertiefung einer unbehandelten 24-Well-Platte (5 Vertiefungen pro CAR-Konstrukt). Die Platte mit Parafilm verschließen und über Nacht bei 4 °C inkubieren.

6. Transduktion (Tag 4)

1. Die Retronektinplatte bei 2103 x g 30 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.
2. Blockieren Sie jede Vertiefung der 24-Well-Platte mit 1 ml R-10-Medium.
3. Die Platte bei 37 °C mit 5%_CO2 für 1 h inkubieren.
4. Die Zentrifuge auf 32 °C vorwärmen, während die Retronektinplatte verstopft wird.
5. Sammeln Sie den Retrovirusüberstand, indem Sie die transfizierten 293T-Zellen mit einem 0,45-μm-Filter filtern.
6. Aliquot 2 ml des gefilterten Retrovirus-Überstands in jede Vertiefung.
7. Zentrifugieren Sie die 24-Well-Platte bei 2103 x g für 2 h bei 32 °C.
8. Während der Plattenzentrifugation sammeln Sie die expandierten PBNK-Zellen von Tag 0 und zählen Sie die Zellen mit Trypan Blue.
   HINWEIS: Erweitern Sie die PBNK-Zellen weiter, indem Sie R-10-Medien hinzufügen, die mit IL-2 (200 U / ml) und IL-15 (5 ng / ml) ergänzt werden.
9. Die expandierten PBNK-Zellen werden mit R-10-Medien, ergänzt mit IL-2 (200 U/ml) und IL-15 (5 ng/ml) auf 2,5 x 10 5-5 x 10 5 Zellen/ml (^0,5 x 10^6-1 x 10 ⁶ Zellen pro Vertiefung) verdünnt.
   HINWEIS: Notieren Sie die Gesamtzahl der Zelle, Lebensfähigkeit und speichern Sie 5 x 10⁵ expandierte PBNK-Zellen für die Durchflusszytometrie, da diese Werte für die Bestimmung der NK-Zellexpansionsrate wichtig sind.
10. Nach der Zentrifugation den Retrovirusüberstand aus jeder Vertiefung teilweise absaugen.
    HINWEIS: Aspirieren Sie nicht vollständig, d.h. lassen Sie etwa 100 μL Retrovirusüberstand pro Well, da dies die Transduktionseffizienz verringert.
11. Aliquot 2 ml der verdünnten expandierten PBNK-Zellen aus Schritt 6.8 zu jeder Vertiefung.
12. Zentrifugieren Sie die Platte bei 600 x g für 10 min bei 32 °C. Die Platte bei 37 °C mit 5% CO2 für 48-72 h inkubieren.
    HINWEIS: Schließen Sie die Platte nicht mit einem Parafilm ab.

7. CAR-NK-Zellentnahme (Tag 6 oder 7), wie in Abbildung 2 dargestellt.

1. Sammeln Sie die Zellen vorsichtig von der 24-Well-Platte und geben Sie die Zellen in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen
   HINWEIS: Versuchen Sie, keine Blasen zu erzeugen, da dies zu einer Abnahme der Zelllebensfähigkeit führt.
2. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 x g für 5 min.
3. Resuspendieren Sie das Pellet mit 1 ml R-10-Medien und zählen Sie die Zellen mit Trypan Blue.
   HINWEIS: Speichern Sie 5 x 10⁵ Zellen für die Durchflusszytometrie, um die Transduktionseffizienz zu bestimmen.
4. Die resuspendierten Zellen werden in eine spezielle 6-Well-Platte überführt, die 30 ml R-10-Medien enthält, ergänzt mit IL-2 (200 U/ml) und IL-15 (5 ng/ml).
5. Die spezielle 6-Well-Platte bei 37 °C mit 5%_CO2 inkubieren.
6. Ersetzen Sie R-10-Medien, die mit IL-2 (200 U / ml) und IL-15 (5 ng / ml) ergänzt wurden, um NK-Zellen alle 3 - 4 Tage zu erhalten.
   HINWEIS: Halten Sie weniger als 20 x 10⁶ Zellen pro Vertiefung bereit, um sie bei jedem Wechsel weiter auszudehnen. Stellen Sie für die beste Lebensfähigkeit sicher, dass die Gesamtzahl der Zellen in jeder Vertiefung 100 x 10⁶ Zellen nicht überschreitet.
7. Zeichnen Sie die Gesamtzahl der Zellen und die Lebensfähigkeit auf und führen Sie alle 3-4 Tage eine Durchflusszytometrie durch, um die NK-Zellexpansionsrate zu berechnen.
8. Verwenden Sie die Zellen für geeignete In-vitro - oder In-vivo-Assays .
   HINWEIS: Die ex vivo expandierten PBNK- und CAR-NK-Zellen können in einem 37 °C Inkubator für ca. 4 Wochen kultiviert werden.
9. Untersuchen Sie die NK-Zellzahl und -Reinheit an Tag 7, Tag 11, Tag 14, Tag 18 und Tag 21 durch Durchflusszytometrie.

Ein schematischer Workflow der gewebeinfiltrierenden NK-Zellisolierung und PBNK-Zellexpansion unter Verwendung der 221-mIL-21-Feederzellmethodik ist in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt. Expandierte PBNK-Zellen wurden alle 3 oder 4 Tage für die Durchflusszytometrie entnommen, um die Reinheit der NK-Zellen durch Färbung von Zellen mit Anti-Human-CD56 und Anti-Human-CD3 zu bestimmen. Das Experiment wurde mit zwei verschiedenen Donatoren wiederholt, um die Reproduzierbarkeit des Expansionssystems zu zeigen (Abbildung 3). PBNK-Zellen, die um 221-mIL-21 erweitert wurden, dehnten sich fast 5 × 104-fach aus (Abbildung 3A). Darüber hinaus wurde die Reinheit der NK-Zellen während der gesamten 21-tägigen Expansion mit rund 85% hoch gehalten (Abbildung 3B). Unter Verwendung des 221-mIL-21-Feeder-Zellexpansionssystems lag die NK-Zellreinheit unabhängig von den Spendern konstant zwischen 85% und 95% (Daten nicht gezeigt). Um die Robustheit des 221-mIL-21-Expansionssystems zu demonstrieren, wurden PBMCs vor der Expansion auf Anti-CD56 und Anti-CD3 gefärbt, was eine Zellreinheit von 7,09% für NK-Zellen und einen hohen Prozentsatz an T-Zellen zeigte (Abbildung 4A). PBMCs wurden mit 221-mIL-21 kokultiviert, um NK-Zellen zu erweitern; Die NK-Reinheit wurde vor der CAR-NK-Transduktion an Tag 4 überprüft (Abbildung 4A). CAR-NK-Zellen wurden gesammelt und für Anti-CD56, Anti-CD3 und Anti-hIgG(H+L) F(ab')2 gefärbt, was eine hohe NK-Zellpopulation (86,9 % an Tag 7) und eine hohe CAR-Transduktionseffizienz von etwa 70% zeigte (Abbildung 4). Höhere Transduktionseffizienzen (bis zu 95%) wurden auch mit dem Retrovirus-Verpackungssystem beobachtet. Insgesamt zeigen diese Daten, dass die 221-mIL-21-Feederzellen NK-Zellen erfolgreich expandieren und die NK-Zellreinheit ex vivo bewahren konnten.

Abbildung 1: Diagramm der NK-Zellexpansion aus festen menschlichen Organproben. Kurz gesagt, die erhaltenen menschlichen Leberproben werden für die mechanische Verdauung in kleine Würfel zerkleinert. Dissoziierte Zellen werden dann mit PVP-beschichtetem Siliziumdioxid und Lymphozyten-Trennmedien isoliert. Weiterhin werden die NK-Zellen unter Verwendung des in Abbildung 2 beschriebenen Expansionsprotokolls erweitert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Schematischer Workflow der CAR-NK-Zellgeneration aus PBMCs. Kurz gesagt, 221-mIL21-Feederzellen wurden bei 100 Gy bestrahlt, bevor sie am Tag 0 mit PBMCs kokultiviert wurden, die mit IL-2 und IL-15 ergänzt wurden. Parallel dazu wurden 293T-Zellen mit dem Retrovirus-Verpackungssystem transfiziert, um CAR-Retroviren zu erzeugen, die dann in Gegenwart von IL-2 und IL-15 in die expandierten PBNK-Zellen transduziert wurden. Primäre CAR-NK-Zellen wurden an Tag 7 geerntet und expandierten 21 Tage lang. Diese Zahl wurde von Yang et al.16 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Dynamische Zeitrafferexpansion von PBNK-Zellen. (A) Faltenexpansion von PBNK während eines 22-tägigen Zeitverlaufs. Die Zellen wurden an den angegebenen Tagen für die Durchflusszytometrie mit Anti-CD56 und Anti-CD3 gefärbt. Die Gesamtzahl der NK-Zellen wurde durch Multiplikation der NK-Zellreinheit mit der Gesamtzahl der Zellen bestimmt. Die Expansionsrate wurde wie folgt erzeugt: (Anzahl der NK-Zellen)Tn/(Anzahl der NK-Zellen)T0, wobei Anzahl der NK-Zellen = (Prozentsatz der NK-Zellreinheit) × (Gesamtzahl der Zellen),T0 die Anzahl der NK-Zellen zum Zeitpunkt Tag 0 und Tn die Anzahl der NK-Zellen zum Zeitpunkt Tag n ist. (B) NK-Zellreinheit während eines 22-tägigen Zeitverlaufs. Die NK-Zellexpansion wurde zweimal mit zwei verschiedenen Donatoren wiederholt. Fehlerbalken stellen ± REM dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Repräsentative durchflusszytometrische Analyse von CAR-NK-Zellen. (A) Repräsentative Punktdiagramme, die den dynamischen Zeitraffer der NK-Zellreinheit der CAR-NK-Zellen während eines 18-tägigen Kurses zeigen. Die Durchflusszytometrie-Analyse wurde bewertet, indem die Zellen zu angegebenen Zeitpunkten mit Anti-CD56 und Anti-CD3 gefärbt wurden. Tag 0 zeigt eine Vorerweiterung von PBNK an. Tag 4 zeigt eine Postexpansion von PBNK und eine Prätransduktion von CAR-NK-Zellen an. Tag 7 zeigt die Posttransduktion von CAR-NK-Zellen an. (B) Repräsentative Punktdiagramme, die die Transduktionseffizienz von CAR-NK-Zellen unter Verwendung des Retrovirus-Verpackungssystems zeigen. Die Zellen wurden mit Anti-CD56, Anti-CD3 und Anti-hIgG(H+L) F(ab')2 für die Durchflusszytometrie gefärbt. (C) Repräsentative Punktdiagramme, die den CAR-Ausdruck in verschiedenen Teilmengen zeigen, einschließlich CD56+CD3-, CD56-CD3+, CD56+CD3+ und CD56-CD3- an Tag 18. Die Zellen wurden mit Anti-CD56, Anti-CD3 und Anti-hIgG(H+L) F(ab')2 (CAR-Expression) für die Durchflusszytometrie angefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.