Methodenartikel

Analyse von Motilitätsmustern von Stentor während und nach der oralen Apparateregeneration mittels Zellverfolgung

DOI:

10.3791/62352

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26. April 2021

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1W. M. Keck Science Department, Scripps, Pitzer, and Claremont McKenna of The Claremont Colleges, 2W. M. Keck Science Department, Pitzer College, 3W. M. Keck Science Department, Scripps College, 4Department of Biochemistry and Biophysics, School of Medicine, University of California at San Francisco

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir stellen ein Protokoll zur Charakterisierung der Motilität und des Verhaltens einer Population von hundert Mikro- bis Millimeterzellen mittels Hellfeldmikroskopie und Zellverfolgung vor. Dieser Assay zeigt, dass Stentor coeruleus bei der Regeneration eines verlorenen oralen Apparates vier verhaltensunterschiedene Phasen durchläuft.

Zusammenfassung

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Stentor coeruleus ist ein bekannter Modellorganismus zur Erforschung der einzelligen Regeneration. Die transkriptomische Analyse einzelner Zellen ergab Hunderte von Genen - von denen viele nicht mit dem oralen Apparat (OA) assoziiert sind -, die während des gesamten Regenerationsprozesses in Phasen unterschiedlich reguliert werden. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese systemische Reorganisation und Mobilisierung zellulärer Ressourcen für das Wachstum einer neuen OA zu beobachtbaren Veränderungen in Bewegung und Verhalten führen wird, die im Laufe der Zeit den Phasen der differentiellen Genexpression entsprechen. Die morphologische Komplexität von S. coeruleus erforderte jedoch die Entwicklung eines Assays zur Erfassung der Statistiken und der Zeitskala. Ein benutzerdefiniertes Skript wurde verwendet, um Zellen in kurzen Videos zu verfolgen, und Statistiken wurden über eine große Population (N ~ 100) zusammengestellt. Mit dem Verlust der OA verliert S. coeruleus zunächst die Fähigkeit zur gerichteten Bewegung; Dann, beginnend bei ~ 4 h, zeigt es einen signifikanten Rückgang der Geschwindigkeit bis ~ 8 h. Dieser Assay bietet ein nützliches Werkzeug für das Screening von Motilitätsphänotypen und kann für die Untersuchung anderer Organismen angepasst werden.

Einleitung

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Stentor coeruleus (Stentor) ist ein bekannter Modellorganismus, der aufgrund seiner Größe, seiner Fähigkeit, mehreren mikrochirurgischen Techniken standzuhalten, und der einfachen Kultivierung in einem Labor zur Untersuchung der einzelligen Regenerationverwendet wurde 1,2,3. Frühe Regenerationsstudien konzentrierten sich auf das größte und morphologisch deutlichste Merkmal in Stentor - die OA -, die vollständig nach chemischem Schock 4,5,6 ausgeschieden wird.

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Protokoll

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HINWEIS: Eine Population von etwa hundert S. coeruleus-Zellen wurde gemäß einem zuvor veröffentlichten JoVE-Protokoll8 kultiviert.

1. Probenvorbereitung

  1. Schneiden Sie ein Stück 250 μm dickes Silikon-Abstandshalterblatt (Table of Materials) etwas kleiner in Höhe und Breite als ein Objektträger. Erstellen Sie mit einem 5/16 "Locher kreisförmige Vertiefungen. Achten Sie darauf, genügend Platz zwischen benachbarten Brunnen zu lassen, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten.
    HINWEIS: Ein Abstand von 3 mm zwischen benachbarten Brunnen wurde als ausreichend befunden. Mit etwas Übung k....

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Ergebnisse

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Das Ziel dieses Assays ist es, die allmähliche Veränderung von Bewegungsmustern und die schrittweise Erhöhung der Bewegungsgeschwindigkeit von Zellen innerhalb einer großen (N ~ 100) regenerierenden Stentor-Population zu quantifizieren. Um die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern, generiert der in diesem Protokoll enthaltene benutzerdefinierte Code zwei Arten von Diagrammen: eine Überlagerung aller Zellbewegungsspuren in einem Satz von Videodaten (Abbildung 1C-F und Abbildung S1<.......

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Diskussion

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Derzeit gibt es viele Partikel- und Zellverfolgungsalgorithmen, von denen einige völlig kostenlos sind. Kosten und Benutzerfreundlichkeit sind oft Kompromisse, die Kompromisse erfordern. Darüber hinaus sind viele der bestehenden Zellverfolgungsprogramme so konzipiert, dass sie die langsame Kriechbewegung von Gewebekulturzellen verfolgen, anstatt die schnelle Schwimmbewegung von Stentor, die sich während des Schwimmens dreht und plötzliche Richtungsänderungen erfahren kann. Nach dem Testen vieler dieser Optionen .......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch das Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS) unterstützt. Wir danken Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo und Skylar Widman für ihre Hilfe bei einigen der vorläufigen Analysen und Codetests. Wir danken Mark Slabodnick für die Diskussion und Anregungen. WFM bestätigt die Unterstützung durch den NIH-Zuschuss R35 GM130327.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 mm dicke SilikonplatteGrace Bio-LabsCWS-S-0,25
24 x 50 mm, #1,5 DeckglasFisher ScientificNC1034527Wie in der Diskussion erwähnt, kann kleineres Deckglas verwendet werden, wenn weniger Probenvertiefungen auf einem Objektträger platziert werden.
CCD-KameraWir haben Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT StammChlamydomonas Resource CenterCC-125
MATLABMATHWORKS
MATLAB Image Processing ToolboxMATHWORKSfür TrackCells.m und CleanTraces.m benötigt

Referenzen

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  1. Lillie, F. R. On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
  2. Morgan, T. H. Regeneration of proportionate....

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Schlagwörter

Stentor coeruleuseinzellige RegenerationZeitraffermikroskopieZellmotilit tsassaySpaghetti PlotsHoldfast Anheftungsynchronisierte Regeneration

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