Methodenartikel

Ein magnetperlenbasiertes Moskito-DNA-Extraktionsprotokoll für die Sequenzierung der nächsten Generation

DOI:

10.3791/62354

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15. April 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Florida Medical Entomology Laboratory, Department of Entomology and Nematology, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, 2U. S. Fish and Wildlife Service, Pacific Islands Fish and Wildlife Office, 3Department of Entomology and Nematology, University of California Davis

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier wird ein DNA-Extraktionsprotokoll mit magnetischen Perlen beschrieben, um qualitativ hochwertige DNA-Extraktionen aus Moskitos herzustellen. Diese Extraktionen eignen sich für einen nachgelagerten Next-Generation-Sequencing-Ansatz.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein kürzlich veröffentlichtes DNA-Extraktionsprotokoll mit magnetischen Perlen und einem automatisierten DNA-Extraktionsinstrument deutete darauf hin, dass es möglich ist, qualitativ hochwertige und quantitativ DNA aus einer gut erhaltenen einzelnen Mücke zu extrahieren, die für die nachgelagerte Sequenzierung des gesamten Genoms ausreicht. Die Abhängigkeit von einem teuren automatisierten DNA-Extraktionsinstrument kann jedoch für viele Labore unerschwinglich sein. Hier liefert die Studie ein budgetfreundliches magnetperlenbasiertes DNA-Extraktionsprotokoll, das für niedrigen bis mittleren Durchsatz geeignet ist. Das hier beschriebene Protokoll wurde erfolgreich mit einzelnen Aedes aegypti Mückenproben getestet. Die reduzierten Kosten, die mit einer qualitativ hochwertigen DNA-Extraktion verbunden sind, werden die Anwendung der Hochdurchsatzsequenzierung in ressourcenbeschmierten Laboren und Studien erhöhen.

Einleitung

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Die jüngste Entwicklung eines verbesserten DNA-Extraktionsprotokolls1 hat viele hochwirbende nachgelagerte Studien mit der Sequenzierung des gesamten Genoms2,3,4,5,6ermöglicht. Dieses auf magnetischen Perlen basierende DNA-Extraktionsprotokoll bietet eine zuverlässige DNA-Ausbeute aus einzelnen Mückenproben, was wiederum die Kosten und den Zeitaufwand reduziert, die mit der Gewinnung einer ausreichenden Anzahl von Proben aus Feldsammlungen verbunden sind.

Jüngste Fortschritte in der Populations- und Landschaftsgenomik stehen in direktem Zusammenhang mit sinkenden Kosten für die Sequenzierung des gesamten Genoms. Obwohl das vorherige DNA-Extraktionsprotokoll1 die Effizienz im Zusammenhang mit der Hochdurchsatzsequenzierung erhöht, können kleinere Labore / Studien ohne die Mittel die Verwendung dieser neuen leistungsstarken Landschafts- und Populationsgenomik-Tools aufgrund der Kosten für die Implementierung des Protokolls (z. B. Kosten für spezialisierte Instrumente) ablehnen.

Hier wird ein modifiziertes DNA-Extraktionsprotokoll vorgestellt, das einen ähnlichen magnetischen Perlenextraktionsschritt wie Neiman et al.1 verwendet, um hochreine DNA zu erhalten, aber nicht auf kostenintensive Instrumente für die Gewebelyse und DNA-Extraktion angewiesen ist. Dieses Protokoll eignet sich für Experimente, die >10 ng hochwertiger DNA erfordern.

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Protokoll

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1. Allgemeine Probenlagerung und Vorbereitung vor der DNA-Extraktion

  1. Hydratisieren Sie die Probe in 100 μL PCR-Wasser für 1 h (oder über Nacht) bei 4 °C, wenn die Probe in >70% Alkohol gelagert wurde, um das Gewebe weicher zu machen.

2. Unterbrechung der Probe

  1. Stellen Sie einen Inkubator oder Schüttelwärmeblock auf 56 °C ein.
  2. Machen Sie Proteinase K (PK) Puffer / Enzym-Mix. Für jede einzelne Mückenextraktion werden 2 μL Proteinase K (100 mg/ml) und 98 μL Proteinase K Buffer (insgesamt 100 μL) benötigt. Um einen Master-Mix für mehrere Proben vorzubereiten, erhöhen Sie die Gesamtmenge (kombiniert für alle Einzelproben) um ~ 15%, um die Verfügbarkeit eines ausreichenden Volumens zu gewährleisten.
  3. Wenn die Proben vor der Extraktion hydratisiert wurden, entsorgen Sie Wasser aus jedem Probenröhrchen.
  4. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Mückengewebe 100 μL PK-Puffer/Enzym-Mix hinzufügen.
  5. Homogenisieren Sie das Gewebe mit Mikrozentrifugen-Schlauchstößel.
  6. Zentrifugiert die Proben für 1 min bei 9.600 x g bei Raumtemperatur.
  7. Inkubieren Sie die Probe für 2-3 h bei 56 °C.
  8. Bereiten Sie während der Inkubation die anderen Reagenzien mit dem DNA-Extraktionsschritt (Schritt 3) vor.

3. DNA-Extraktion

  1. Machen Sie eine magnetische Perlen-Master-Mischung. Mischen Sie für jede Probe 100 μL Lysepuffer, 100 μL Isopropanol und 15 μL magnetische Perlen (insgesamt 215 μL). Um eine Mastermischung für mehrere Reaktionen vorzubereiten, erhöhen Sie die Gesamtmenge (kombiniert für alle Einzelproben) um ~ 20%, um die Verfügbarkeit eines ausreichenden Volumens zu gewährleisten.
  2. Nach der Inkubationszeit (Schritt 2.7) wird jedes Lysat mittels Pipette in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen oder eine Mikroplattenbohrung gegeben.
  3. Zu jeder Probe werden 100 μL Lysat und 215 μL der magnetischen Perlen-Mastermischung hinzugefügt.
  4. Verwenden Sie eine Pipette, um es für 10-20 s gut zu mischen und lassen Sie es dann für 10 min bei Raumtemperatur stehen. Schütteln Sie die Röhre gelegentlich vorsichtig, um die Bindung von Magnetischen Perlen und DNA zu maximieren.
  5. Legen Sie das Rohr/die Platte auf den magnetischen Perlenabscheider und warten Sie, bis die Lösung klar ist.
  6. Entsorgen Sie die Flüssigkeit aus dem Rohr/der Platte mit einer Pipette. Versuchen Sie beim Entfernen des Überstands, die magnetischen Perlen, die die DNA halten, nicht zu berühren oder zu stören.
  7. Bewegen Sie das Rohr/die Platte vom magnetischen Perlenabscheider weg und fügen Sie 325 μL Waschpuffer 1 zu jeder Vertiefung hinzu.
  8. Gründlich durch Pipettieren mischen und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.6.
  10. Bewegen Sie das Rohr/die Platte vom magnetischen Perlenabscheider weg und fügen Sie 250 μL Waschpuffer 1 zu jeder Vertiefung hinzu.
  11. Gründlich durch Pipettieren mischen und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  12. Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.6.
  13. Bewegen Sie das Röhrchen/die Platte vom magnetischen Perlenabscheider weg und fügen Sie jeder Probe 250 μL Waschpuffer 2 hinzu.
  14. Gründlich mischen und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  15. Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.6.
  16. Bewegen Sie das Rohr/die Platte vom magnetischen Perlenabscheider weg und fügen Sie 250 μL Waschpuffer 2 zu jeder Vertiefung hinzu.
  17. Gründlich mischen und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  18. Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.6.
  19. Bewegen Sie das Rohr/die Platte vom magnetischen Perlenabscheider weg und fügen Sie jeder Vertiefung 100 μL Elutionspuffer hinzu.
  20. Gründlich mischen und 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  21. Bewegen Sie das Rohr/ die Platte auf den magnetischen Perlenabscheider und warten Sie, bis die Lösung klar ist.
  22. Pipetetten Sie den Überstand in eine neue saubere 0,5-Mikrozentrifugenröhre oder Mikroplatten-Vertiefung.
  23. Lagern Sie DNA-Proben bei 4 °C (bis zu 1 Woche) oder -80 °C.  Wenn eine Mikroplatte verwendet wird, bedecken Sie sie mit Parafilm.
  24. Bestimmen Sie die DNA-Ausbeute mit einer geeigneten Methode.
    HINWEIS: In dieser Studie wurden DNA-Fluorometer-Messwerte und Absorption bei 260/280 nm verwendet.

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Ergebnisse

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Die durchschnittliche DNA-Ausbeute pro einzelnem Mückenkopf/Thoraxgewebe betrug 4,121 ng/μL (N = 92, Standardabweichung 3,513), gemessen mit einem Fluorometer, wenn es mit 100 μL Elutionspuffer eluiert wurde. Dies ist ausreichend für die 10-30 ng genomischen DNA-Eingangsanforderungen, die für den Aufbau der gesamten Genombibliothek erforderlich sind1,7. Die Menge an DNA kann zwischen 0,3-29,7 ng / μL variieren, abhängig von der Körpergröße der Mücke und den Konse...

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Diskussion

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Das hier beschriebene Protokoll kann für andere Insektenarten angepasst werden. Die ursprüngliche Version des in Nieman et al.1 eingeführten Protokolls wurde an mehreren Arten getestet, darunter Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta und Keiferia ...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch das Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases, das von den U.S. Centers for Disease Control and Prevention (Cooperative Agreement 1U01CK000516), cdc grant NU50CK000420-04-04,04, dem USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch project 1025565), UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory Fellowship an Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II Grant (AWD05009_MOD0030) und Florida Department of Health (Contract CODQJ) finanziert wird. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in diesem Artikel sind die des Autors /der Autoren und geben nicht unbedingt die Ansichten des U.S. Fish and Wildlife Service an.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AE PufferQiagen19077Elutionspuffer
AL PufferQiagen19075Lysepuffer
AW1 PufferQiagen19081Waschpuffer 1
AW2 PufferQiagen19072Waschpuffer 2
MagAttract Suspension GQiagen1026901magnetische Kügelchen
Magnetischer Bead-SeparatorEpigentekQ10002-1
NanotropfenThermoFisherND-2000Mikrovolumen-Spektralphotometer
PK PufferThermoFisher4489111Proteinase K Puffer
Proteinase KThermoFisherA25561
QubitInvitrogenQ33238Fluorometer

Referenzen

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  1. Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314(2015).
  2. Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204(2019).
  3. Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425(2020).
  4. Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473(2019).
  5. Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
  6. Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303(2016).
  7. Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211(2016).
  8. Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
  9. Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
  10. Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
  11. Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).

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