Der Artikel stellt das μTongue-Gerät (Microfluidics-on-a-Tongue) für die funktionelle Geschmackszellbildgebung in vivo vor, indem die Mikrofluidik in ein intravitalen Bildgebungsfenster auf der Zunge integriert wird.
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Methodenartikel
μTongue: Eine mikrofluidikbasierte funktionelle Bildgebungsplattform für die Zunge in vivo
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die intravitale Fluoreszenzmikroskopie ist ein Werkzeug, das häufig verwendet wird, um die mehrzellige Dynamik bei einem lebenden Tier zu untersuchen. Es wurde jedoch nicht erfolgreich im Geschmackssinnsorgan eingesetzt. Durch die Integration der Mikrofluidik in das intravitaale Zungenbildgebungsfenster liefert die μTongue zuverlässige funktionelle Bilder von Geschmackszellen in vivo unter kontrollierter Exposition gegenüber mehreren Tastantien. In diesem Artikel wird eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verwendung des μTongue-Systems vorgestellt. Es gibt fünf Unterabschnitte: Vorbereitung von Lösungen, Aufbau eines mikrofluidischen Moduls, Probenmontage, Erfassung funktionaler Bilddaten und Datenanalyse. Einige Tipps und Techniken zur Lösung der praktischen Probleme, die bei der Verwendung der μTongue auftreten können, werden ebenfalls vorgestellt.
Einleitung
Das intravitale Fluoreszenzmikroskop wird häufig verwendet, um die raumzeitliche Dynamik an lebenden Geweben zu untersuchen. Forscher entwickeln schnell genetisch kodierte Sensoren, die spezifische und empfindliche Umwandlungen der biologischen Prozesse in Fluoreszenzsignale liefern - die mit fluoreszierenden Mikroskopen, die weit verbreitet sind, leicht aufgezeichnet werden können1,2. Obwohl die meisten inneren Organe bei Nagetieren mit dem Mikroskop untersucht wurden, war seine erfolgreiche Anwendung auf der Zunge noch nicht erfolgreich3.
Frühere Studien zu....
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Protokoll
Alle chirurgischen Eingriffe wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Sungkyunkwan University und der Seoul National University genehmigt.
1. Herstellung von Lösungen: künstlicher Speichel und Geschmacksstoffe
- Künstlichen Speichel durch Auflösen von 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0,25 mM CaCl2, 0,25 mM MgCl2, 0,12 mMK2HPO4, 0,12 mM KH2PO4und 1,8 mM HCl in destilliertem Wasser (>1 L) vorbereiten und den pH-Wert der Lösung auf 7 einstellen (siehe Materialtabelle)12.....
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Ergebnisse
Die Pirt-GCaMP6f-tdTomato Maus wurde verwendet, um ein Geschmacksknospenbild zu erhalten. Die Oberfläche der Mauszunge war mit autofluoreszierenden filiformen Papillen bedeckt. Geschmacksknospen sind spärlich über die Oberfläche der Zunge verteilt (Abbildung 4A). Die Bilder der Geschmacksknospen und ihrer Struktur wurden mit drei verschiedenen Filterdetektoren aufgenommen. Mit dem 607/70 nm Filterset wurde das tdTomato-Signal aus den Geschmackszellen für die ratiometrische Analyse erhalten (.......
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Diskussion
Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Anwendung von μTongue auf die Untersuchung funktioneller Aktivitäten von Geschmackszellen in vivo beschrieben. In diesem Protokoll wird die funktionelle Bildgebung an den Geschmackszellen mit genetisch kodierten Kalziumindikatoren durchgeführt. Neben der Verwendung transgener Mäuse kann die elektrophoretische Belastung von Calciumfarbstoffen (oder Spannungsmessfarbstoffen) auf die Geschmackszellen eine alternative Option sein.
Alle Geschmacksl.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären konkurrierende finanzielle Interessen: J. Han und M. Choi sind Erfinder der in diesem Artikel beschriebenen patentierten μTongue-Technologie, und das μTongue-System ist über SciTech Korea kommerziell erhältlich.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom Institute of Basic Science (IBS-R015-D1), dem von der koreanischen Regierung finanzierten Stipendium der National Research Foundation of Korea (NRF) (NRIT) (Nr. 2019M3A9E2061789) und von der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, das von der koreanischen Regierung (MSIT) finanziert wird (Nr. 2019M3E5D2A01058329). Wir danken Eunsoo Kim und Eugene Lee für ihre technische Unterstützung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Acesulfam K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Künstlicher Speichel / schmackhafte |
| Calciumchloridlösung | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Künstlicher Speichel / schmackhafte |
| Zitronensäure | Sigma Aldrich | C0759-100G | Künstlicher Speichel / schmackhaftes |
| Cycloheximid | Sigma Aldrich | 01810-5G | Künstlicher Speichel / schmackhaft |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Künstlicher Speichel / schmackhaft |
| Zahnkleber | Denkist | P0000CJT-A2 | Tierpräparation |
| Bild J | NIH | ImageJ | Datenanalyse |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Künstlicher Speichel / schmackhaft |
| Sofortklebstoff | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Tierpräparat |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Künstlicher Speichel / Geschmack |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Künstlicher Speichel / Geschmack |
| Ketamin Yuhan | Ketamin 50 | Tierpräparat | |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Künstlicher Speichel / Geschmack |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Künstlich Speichel / Geschmack |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Datenanalyse |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Künstlicher Speichel / Geschmack |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Künstlicher Speichel / Geschmack |
| Mutiphoton Mikroskop | Thorlab | Bergamo II | Mikroskop |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Künstlicher Speichel / Geschmack |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Künstlicher Speichel / Geschmack |
| Objektiv | Nikon | N16XLWD-PF | Mikroskop |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidische Steuerung |
| PC | LG | Lg15N54 | |
| PH-Messgerät | Thermowissenschaftliches | ORION STAR AZ11 | Künstlicher Speichel / Geschmack |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Sigma Aldrich | 806562 | Künstlicher Speichel / schmackhaftes |
| Chinin | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Künstlicher Speichel / schmackhafte |
| Spritzenpumpe | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Fluidische Steuerung |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Tierpräparat |
| Ultraschneller Faserlaser | Toptica | FFultra920 01042 | Mikroskop |
| Xylazin | Bayer Korea | Rompun | Tierpräparat |
Referenzen
- Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
