Analyse der Lipidzusammensetzung von Mykobakterien mittels Dünnschichtchromatographie

Summary

Es wird ein Protokoll vorgestellt, um den Gesamtlipidgehalt der Zellwand einer Vielzahl von Mykobakterien zu extrahieren. Darüber hinaus werden Extraktions- und Analyseprotokolle der verschiedenen Arten von Mykolsäuren gezeigt. Ein dünnschichtchromatographisches Protokoll zur Überwachung dieser mykobakteriellen Verbindungen wird ebenfalls bereitgestellt.

Abstract

Mykobakterienarten können sich in der Wachstumsrate, dem Vorhandensein von Pigmentierung, der koloniemorphologischen Auf festen Medien sowie anderen phänotypischen Merkmalen voneinander unterscheiden. Sie alle haben jedoch den relevantesten Charakter von Mykobakterien gemeinsam: ihre einzigartige und hochhydrophobe Zellwand. Mykobakterien-Arten enthalten einen membrankovalenten Komplex, der Arabinogalactan, Peptidoglycan und lange Ketten von Mykolsäuren mit Typen umfasst, die sich zwischen mykobakterienarten unterscheiden. Darüber hinaus können Mykobakterien auch Lipide produzieren, die sich nicht kovalent auf ihren Zelloberflächen befinden, wie Phthiocerol-Dimycocerosate (PDIM), phenolische Glykolipide (PGL), Glykopeptidolipide (GPL), Acyltrehalose (AT) oder Phosphatidil-Inositol-Mannosiside (PIM). Einige von ihnen gelten als Virulenzfaktoren in pathogenen Mykobakterien oder kritische antigene Lipide in der Wirt-Mykobakterien-Interaktion. Aus diesen Gründen besteht ein erhebliches Interesse an der Untersuchung von mykobakteriellen Lipiden aufgrund ihrer Anwendung in verschiedenen Bereichen, vom Verständnis ihrer Rolle bei der Pathogenität von Mykobakterieninfektionen bis hin zu einer möglichen Implikation als immunmodulatorische Mittel für die Behandlung von Infektionskrankheiten und anderen Pathologien wie Krebs. Hier wird ein einfacher Ansatz zur Extraktion und Analyse des Gesamtlipidgehalts und der Mykolsäurezusammensetzung von Mykobakterienzellen vorgestellt, die in einem festen Medium unter Verwendung von Mischungen organischer Lösungsmittel gezüchtet wurden. Sobald die Lipidextrakte erhalten sind, wird eine Dünnschichtchromatographie (TLC) durchgeführt, um die extrahierten Verbindungen zu überwachen. Das Beispielexperiment wird mit vier verschiedenen Mykobakterien durchgeführt: dem schnell wachsenden Mycolicibacterium brumae und Mycolicibacterium fortuitum, dem abgeschwächten langsam wachsenden Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) und dem opportunistischen Erreger Mycobacterium abscessus, was zeigt, dass die im vorliegenden Protokoll gezeigten Methoden bei einer Vielzahl von Mykobakterien eingesetzt werden können.

Introduction

Mycobacterium ist eine Gattung, die pathogene und nicht-pathogene Arten umfasst, die sich durch eine hochhydrophobe und undurchlässige Zellwand auszeichnen, die durch ihre eigenartigen Lipide gebildet wird. Insbesondere enthält die mykobakterielle Zellwand Mykolsäuren, α-Alkyl- und β-Hydroxyfettsäuren sind, bei denen der α-Zweig in allen Mykolsäuren (mit Ausnahme der Länge) konstant ist und die β-Kette, die Meromykolatkette genannt, eine lange aliphatische Kette ist, die verschiedene funktionelle chemische Gruppen enthalten kann, die zusammen mit der Literatur beschrieben werden (α-, α'-, Methoxy-, κ-, Epoxid-, Carboxy- und ω-1-Methoxy-Mykolaten), die daher ....

Protocol

1. Extraktion der gesamten nicht-kovalenten Lipide aus Mykobakterien (Abbildung 1)

1. 0,2 g Mykobakterien aus einem festen Medium zerkratzen und mit einem Polytetrafluorethlen (PTFE)-Liner-Schraubverschluss in ein Glasrohr geben. Fügen Sie eine Lösung hinzu, die aus 5 ml Chloroform und 10 ml Methanol (Chloroform: Methanol, 1: 2) besteht.
   HINWEIS: Wenn organische Lösungsmittel verwendet werden, sollte nur Glasempfänger verwendet werden. Kunststoffbehälter sind nicht erlaubt. Darüber hinaus werden PTFE-Liner-Schraubverschlüsse für Flaschen benötigt.
   ACHTUNG: Chloroform ist eine potenziell giftige und extrem gefährliche Substanz....

Results

Mit dem Ziel, eine breite Palette von Lipiden in verschiedenen Mykobakterienarten zu zeigen, wurde M. bovis BCG ausgewählt, da es sich um raue und langsam wachsende Mykobakterien handelt. Die rauen und schnell wachsenden M. fortuitum und M. brumae wurden in das Verfahren aufgenommen und schließlich wurde auch der glatte Morphotyp von M. abscessus einbezogen. Diese vier Arten ermöglichen es uns, ein breites Spektrum von mykobakterienbasierten Lipiden wie Acyltrehalose (AT), GPLs, PDIM, .......

Discussion

Ein einfaches Protokoll, das als Goldstandardmethode für die Extraktion von nichtkovalent verknüpften Lipidverbindungen aus der mykobakteriellen Zellwand gilt, wird vorgestellt. Weitere Visualisierungen durch ein- und zweidimensionale TLCs aus den extrahierten Lipiden von vier verschiedenen Mykobakterien werden gezeigt.

Zwei aufeinander folgende kombinierte Mischungen von Chloroform und Methanol zur Wiederherstellung des Lipidgehalts von Mykobakterienzellen ist die am weitesten verbreitete Lös.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Essigsäure	Merck	100063	VORSICHT. Wasserfrei für die Analyse EMSURE® ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Aceton	Carlo Erba	400971N	VORSICHT. ACETON RPE-ACS-ISO FÜR DIE ANALYTIK ml 1000
Anthrone	Merck	8014610010	Anthrone für die Synthese.
Benzol	Carlo Erba	426113	VORSICHT. Benzol RPE - Für die Analyse - ACS 2,5 l
Kapillarglasrohr	Merck	BR708709	MARK®   Einweg BLAUBRAND®   Mikropipetten, intraMark
Chloroform	Carlo Erba	412653	VORSICHT. Chloroform RS - Für HPLC - Isokratische Qualität - Stabilisiert mit Ethanol 2,5 L
Trockenblockheizung	J.P. Selecta	7471200
Dicloromethan	Carlo Erba	412622	VORSICHT. Dichlormethan RS - Für HPLC - Isokratische Qualität - Stabilisiert mit Amylen 2,5 L
Diethylether	Carlo Erba	412672	VORSICHT. Diethylether RS - Für HPLC - Isokratische Qualität - Nicht stabilisiert 2,5 L
Ethylacetat	Panreac	1313181211	VORSICHT. Ethylacetat (Reag. USP, Ph. Eur.) für die Analyse, ACS, ISO
Ethylalkohol Absolute	Carlo Erba	4146072	VORSICHT. Ethanol absolut wasserfrei RPE - Für die Analyse - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L
Glastrichter	VidraFOC	DURA.2133148 1217/1
Glasrohr	VidraFOC	VFOC.45066A-16125	Glasrohr mit PTFE-Rückgewinnungskappe
Methanol	Carlo Erba	412722	VORSICHT. Methanol RS - Für HPLC - GOLD - Ultragradient Grade 2,5 L
Molybdatophosphorsäurehydrat	Merck	51429-74-4	VORSICHT.
Molybdänblaues Sprühreagenz, 1,3%	Sigma	M1942-100ML	VORSICHT.
n-Hexan	Carlo Erba	446903	VORSICHT. n-Hexan 99% RS - ATRASOL - Für die Spurenanalyse 2,5 L
n-Nitroso-n-Methylharnstoff	Sigma	N4766	ACHTUNG
Orbitale Schüttelplattform	DDBiolab	995018	NB-205L Tisch-Schüttelinkubator
Petrolether (60-80º C)	Carlo Erba	427003	VORSICHT. Petrolether 60 - 80°; C RPE - Für die Analyse 2,5 L
Sprühgerät	VidraFOC	712/1
Natriumsulfat wasserfrei	Merck	238597
Schwefelsäure 95-97%	Merck	1007311000	VORSICHT. Schwefelsäure 95-97% DC-Kammer
	Merck	Z204226-1EA	Rechteckige DC-Entwicklungstanks, komplett L × H &mal; B 22 cm & mal; 22 cm & mal; 10 cm
TLC Platte	Merck	1057210001	TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u
TLC Plate Heater	CAMAG	223306	CAMAG TLC Plate Heater III
Toluol	Carlo Erba	488551	ACHTUNG. Toluol RPE - Für die Analyse - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L
Vortex	Fisher Scientific	10132562	IKA  Agitador IKA v&oakute; rtex 3
1-Naphthol	Sigma-Aldrich	102269427	VORSICHT.