In dieser Studie wird beschrieben, wie der endolymphatische Sack aus dem Innenohr der Maus in verschiedenen Altersstufen präpariert werden kann. Das Ergebnis einer ähnlichen Dissektion ist in einem Slc26a4-null-Mausmodell der Vergrößerung des endolymphatischen Sacks gezeigt. Eine transgene Maus mit einem fluoreszierenden Reporter, der im endolymphatischen Sack exprimiert wird, wird als Modell zur einfachen Visualisierung des endolymphatischen Sacks und als Lehrmittel vorgestellt.
Methodenartikel
Dissektion des endolymphatischen Sacks von Mäusen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Untersuchung mutierter Mausmodelle für menschliche Hör- und Gleichgewichtsstörungen hat viele strukturelle und funktionelle Veränderungen aufgedeckt, die zu den menschlichen Phänotypen beitragen könnten. Obwohl wichtige Fortschritte im Verständnis der Entwicklung und Funktion der neurosensorischen Epithelien der Cochlea und Vestibula erzielt wurden, sind nur begrenzte Kenntnisse über die Entwicklung, die zelluläre Zusammensetzung, die molekularen Signalwege und die funktionellen Eigenschaften des endolymphatischen Sacks verfügbar. Dies ist zum großen Teil auf die Schwierigkeit zurückzuführen, dieses Gewebe zu visualisieren und zu mikrodissezieren, bei dem es sich um ein Epithel handelt, das nur aus einer Zellschicht besteht. Die hier vorgestellte Studie beschreibt einen Ansatz zur Erschließung und Mikrodissektion des endolymphatischen Sacks aus dem Innenohr der Wildtyp-Maus in verschiedenen Altersstufen. Das Ergebnis einer ähnlichen Dissektion zeigt sich in einem Pendrin-defizienten Mausmodell zur Vergrößerung des vestibulären Aquädukts. Vorgestellt wird eine transgene Maus mit einem fluoreszierenden endolymphatischen Sack. Mit dieser Reportermaus kann der endolymphatische Sack mit begrenzter Dissektion leicht sichtbar gemacht und seine Größe bestimmt werden. Es kann auch als Lehrmittel verwendet werden, um zu lehren, wie man den endolymphatischen Sack präpariert. Diese Präparierungsverfahren sollten die weitere Charakterisierung dieses wenig untersuchten Teils des Innenohrs erleichtern.
Einleitung
Das Innenohr von Säugetieren besteht aus der Cochlea, dem Sacculus, dem Utriculus, drei Bogengängen und dem endolymphatischen Sack (Abbildung 1A). Diese Organe bestehen aus einem durchgehenden, flüssigkeitsgefüllten Epithel, das als membranöses Labyrinth bezeichnet wird, mit benachbarten Organen, die direkt oder durch kleine Kanalstrukturen wie den Ductus reuniens, den Ductus saccularis, den Ductus utricularis oder den Ductus endolymphatic verbunden sind. Im Vergleich zu anderen Organen des Innenohrs hat der endolymphatische Sack einzigartige Eigenschaften. Erstens fehlen ihm sensorische Epithelzellen. Stattdessen befinden sich im endolymphatischen Sack Zellen, die auf den Ionentransport spezialisiert sind. Zweitens, obwohl das membranöse Labyrinth vom knöchernen Labyrinth umschlossen ist, stellt der endolymphatische Sack eine Ausnahme dar, der teilweise aus dem Felsenknochen herausragt und in die Hirnhöhle hineinragt. Diese Morphologie scheint während der Evolution des Innenohrs stark konserviert zu sein. Drittens ist der endolymphatische Sack die erste Struktur, die sich aus der Otozyste in einem frühen embryonalen Stadium entwickelt, bevor sich andere Organe bilden. Darüber hinaus wurden mehrere Pathologien mit einem vergrößerten endolymphatischen Sack oder einem abnormalen endolymphatischen Kompartiment in Verbindung gebracht. Das Vorhandensein pathogener Varianten in SLC26A4 (auch als Pendrin-Gen bekannt) führt zu einer vergleichsweise häufigen Form des Schallempfindungsschwerhörigkeitsverlusts, die durch die Vergrößerung des endolymphatischen Sacks in Verbindung mit dem Vorhandensein eines vergrößerten vestibulären Aquädukts (EVA) verursacht wird1. Wenn es mit einem Kropf in Verbindung gebracht wird, wird es als Pendred-Syndrombezeichnet 2,3. Einige gehen auch davon aus, dass Morbus Menière mit einer Anomalie des endolymphatischen Kompartiments (Hydrops) verbunden ist4. Die einzigartigen Merkmale des endolymphatischen Sacks und die Pathologien, die mit einer Veränderung seiner Morphologie verbunden sind, stehen im Einklang mit einer entscheidenden Rolle für die Entwicklung und Erhaltung des Innenohrs.
Trotz seiner Bedeutung ist das Wissen über die Entwicklung, die zelluläre Zusammensetzung, die molekularen Signalwege und die funktionellen Eigenschaften des endolymphatischen Sacks noch begrenzt. Dies ist zumindest teilweise auf die Schwierigkeit zurückzuführen, dieses Gewebe sichtbar zu machen und zu mikrodissezieren. Der endolymphatische Sack ist eine beutelförmige Struktur, die aus einer einzigen Schicht von Epithelzellen besteht, die oft durchscheinend ist und mit der Lichtstereomikroskopie nur sehr schwer aus dem sie umgebenden Bindegewebe herauszufiltern ist. Obwohl eine kleine Anzahl von Forschern Whole-Mount-Dissektionstechniken entwickelt und ihre experimentellen Ergebnisse veröffentlicht hat 5,6,7,8,9,10, gibt es keine Veröffentlichung, die sich auf die technischen Details dieses Verfahrens konzentriert.
In dieser Studie werden die Mikrodissektionsansätze beschrieben, die entwickelt wurden, um den endolymphatischen Sack aus dem Innenohr der Wildtyp-Maus in verschiedenen Altersstufen zu erreichen und zu isolieren. Die Ergebnisse einer ähnlichen Dissektion zeigen sich in einem Mausmodell, bei dem die Expression von SLC26A4 fehlt und das eine Vergrößerung des Ductus endolymphaticum und des Sacks aufweist. Es wird über eine Mauslinie mit einem Transgen berichtet, das für eine Cre-Rekombinase kodiert, die im endolymphatischen Sack exprimiert wird. In Gegenwart eines fluoreszierenden Reporters der Cre-Expression, hier tdTomato, kann die Fluoreszenz verwendet werden, um den endolymphatischen Sack mit begrenzter Dissektion leicht sichtbar zu machen und Informationen über seine Größe zu erhalten. Diese Reportermauslinie kann auch als Lehrmittel verwendet werden, um endolymphatische Sackdissektionen zu üben und zu perfektionieren. Die Fähigkeit, endolymphatisches Sackgewebe zu präparieren, sollte die weitere Charakterisierung dieses wenig untersuchten, aber wesentlichen Bestandteils des Innenohrs erleichtern.
Protokoll
Alle Tierversuche und -verfahren wurden gemäß Protokollen durchgeführt, die von den Animal Care and Use Committees des National Institute of Neurological Diseases and Stroke/National Institute on Deafness and Other Communication Disorders (#1264) und dem Institutional Animal Care and Use Committee an der Tokyo Medical and Dental University (A2020-058A) genehmigt wurden.
HINWEIS: C57BL/6J-Mäuse (Best.-Nr. 000664), Pds-/-auch bekannt als Slc26a4-/- Mäuse (129S-Slc26a4 tm1Egr/AjgJ, Nr. 018424) 11, B6; CBA-Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mm Mäuse12 und Ai9(LSL-RCL-tdT) (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze, Nr. 007909) Mäuse13 sind im Jackson Laboratory und auf Anfrage erhältlich. Alle Verfahren der Genotypisierung wurden bereits beschrieben. B6; CBA-Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mm-Mäuse, die zuvor über mindestens fünf Generationen mit dem Stamm C57BL/6J rückgekreuzt wurden, wurden für Experimente gezüchtet. Tiere beiderlei Geschlechts können mit diesem Ansatz ohne offensichtlichen Unterschied untersucht werden. Der erste Tag nach der Paarung über Nacht wird als Embryonaltag 0,5 (E0,5) gezählt.
1. Entnahme und Fixierung des intakten Innenohrs im Schädel
- Einschläferung von Versuchstieren oder zeitschwangeren Muttertieren mit einem institutionell anerkannten Verfahren, zum Beispiel durch CO2 -Inhalation. Arbeiten Sie nach Möglichkeit unter einem Abzug, um die Ausbreitung von Mausallergenen zu vermeiden oder zu minimieren. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass Sie nicht auf schmerzhafte Reize wie Pfoten- oder Schwanzzwicken reagieren, enthaupten Sie das Tier. Bei einer zeitschwangeren Hündin kann die Zervixluxation als Alternative zur Enthauptung eingesetzt werden, wenn das Innenohr nicht für weitere Experimente genutzt wird.
- Entnehmen Sie die Embryonen durch Laparotomie14 mit einer Arterienschere mit Kugelspitze, um die Embryonen während des Prozesses zu schützen. Manipulieren Sie die Embryonen mit einer Ringzange. Legen Sie die Gebärmutterhörner bei 4 °C PBS auf Eis und isolieren Sie jeden Embryo wie zuvor beschrieben15 , bevor Sie ihn enthaupten.
- Halbieren Sie den Kopf von hinten nach vorne: Schnitten Sie zuerst die Oberseite des Kopfes, indem Sie zuerst die Haut einschneiden, dann die Oberseite des Schädels und schneiden Sie bei jedem Schnitt etwa ein Drittel davon ein, damit sich der Schädel nicht verbiegt. Schneide dann sofort die Unterseite des Schädels ab.
HINWEIS: Bei Embryonen wird empfohlen, eine scharfe Klinge anstelle einer Schere zu verwenden. Es ist wichtig, dass der Schädel in jedem Alter nicht deformiert wird, während er halbiert wird. - Ohne den Schädel zu berühren oder zu biegen, entfernen Sie vorsichtig das Hemihirn, um das knöcherne Labyrinth freizulegen (Abbildung 1B, Ergänzende Abbildung 1A-B).
- Bei Mäusen ab dem 5. Tag der Geburt durchschneiden Sie den äußeren Gehörgang und ziehen Sie die Haut nach vorne in Richtung Nase. Schneiden Sie den Schädel um das Innenohr herum (Ergänzende Abbildung 1C).
- Die beiden Halbschädel jedes Tieres mit möglichst intaktem Innenohr in ein Glasfläschchen oder -röhrchen mit 10 ml 4 °C 4 % Paraformaldehyd (PFA), verdünnt in 1x PBS, geben und unter einem Abzug auf Eis legen.
HINWEIS: Versuchen Sie bei diesem Schritt nicht, das Innenohr aus dem Schädel zu entfernen, da dies den endolymphatischen Gang und den Sack beschädigen kann. - 1 h bei 4 °C auf einem Schaukelschüttler inkubieren. Wenn Sie mit Gewebe eines Tieres mit einem fluoreszierenden Reporter arbeiten, bewahren Sie das Röhrchen mit der Probe in Aluminiumfolie oder in einer Box auf, um die Lichteinwirkung zu minimieren.
HINWEIS: Wenn Sie an der Untersuchung von Mikrotubuli und zugehörigen Molekülen interessiert sind, sollte die Gewebefixierung bei Raumtemperatur (RT) mit RT-Fixiermittel durchgeführt werden. - Entsorgen Sie das PFA in einem geeigneten Behälter in einem Abzug. Waschen Sie dreimal mit 10 mL 1x PBS für jeweils 15 Minuten auf einem Schaukelschüttler bei RT, um das Fixiermittel vor der Dissektion zu entfernen.
2. Mikrodissektion des endolymphatischen Sacks
- Übertragen Sie jedes Innenohrpräparat in eine 35-mm-Gewebekulturschale mit 1x PBS.
- Legen Sie die Zubereitung so in die Schale, dass die Wurzel des 8. Hirnnervs nach oben ausgerichtet ist. Halten Sie das Gewebe in dieser Position, indem Sie die Cochlea mit einer Pinzette #4 fassen (Abbildung 1C).
- Identifizieren Sie wichtige Orientierungspunkte: das vestibuläre Aquädukt, die vorderen und hinteren Bogengänge, den Crus communis und den Sinus sigmoideus (Vene) (Abbildung 1D).
HINWEIS: Der endolymphatische Sack bei der Wildtyp-Maus ist durchscheinend und schwer zu visualisieren. Für eine erfolgreiche Mikrodissektion des endolymphatischen Sacks ist es wichtig, seine Anatomie und Lokalisation zu verstehen (Abbildung 1E). - Schneiden Sie die Dura mater und das vestibuläre Aquädukt sowie das darunter liegende Bindegewebe, das den endolymphatischen Sack umgibt, mit einer 27-G-Nadel auf einer 1-ml-Spritze (Abbildung 1D, F).
HINWEIS: Bei einer erwachsenen Maus ist eine Entkalkung des Präparats mit 10 % EDTA (pH 7,4) vor der Mikrodissektion nützlich, aber nicht unbedingt erforderlich, um die Inzision des vestibulären Aquädukts zu erleichtern. Für die Dissektion eines geöffneten endolymphatischen Sackes, der älter als der 5. postnatale Tag ist, wird empfohlen, die Inzisionslinie auf dem vestibulären Aquädukt leicht nach vorne zu positionieren, um einen Schnitt in das Lumen des endolymphatischen Sacks zu machen (Abbildung 2A). - Halten Sie das Bindegewebe, das sich lateral des endolymphatischen Sacks befindet, mit einer Pinzette fest und ziehen Sie das Gewebe nach oben, um es vom Schläfenbein zu lösen (Abbildung 1G).
- Entfernen Sie vorsichtig alle Rückstände. Das Präparat umfasst in der Regel das Epithel des endolymphatischen Sacks, das umgebende Bindegewebe, einen Teil des vestibulären Aquädukts und den Sinus sigmoideus (Abbildung 1H-I). Falls erforderlich, trennen Sie das Epithel des endolymphatischen Sacks vom umgebenden Gewebe (Abbildung 1J).
- (Fakultativ) Für die Dissektion des geöffneten endolymphatischen Sacks halten Sie den Stielteil des Präparats so, dass der Querschnitt des Lumens sichtbar ist. Führen Sie eine 27-G-Nadel in das Lumen ein und bewegen Sie sie, um den endolymphatischen Sack in zwei Blätter zu schneiden (Abbildung 2B-C). Halten Sie den Rand jedes blattartigen Gewebes mit einer Pinzette fest und trennen Sie sie voneinander (Abbildung 2D-F).
3. Immunhistochemie
- Verwenden Sie nach der Mikrodissektion die Pinzette #5, um die endolymphatischen Säcke in eine 9-Well-Spotglasplatte zu übertragen.
- Um sicherzustellen, dass die endolymphatischen Säcke unberührt bleiben, verwenden Sie mit dem Mikroskop eine 200-μl-Pipette, um alle 1x PBS mit Ausnahme eines Tropfens mit dem Gewebe zu entfernen. 200 μl permeabilisierende und blockierende Lösung (1x PBS mit 0,15 % Triton X-100 (PBS-TX) und 5 % Rinderserumalbumin (BSA)) zugeben und 1 h bei RT auf einem Orbitalschüttler inkubieren.
- Nachdem alle Blockierungslösung bis auf einen Tropfen, der das Gewebe enthält, entfernt wurden, werden 200 μl Primärantikörper hinzugefügt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anti-Pendrin-Antikörper6 , verdünnt im Verhältnis 1:1000 in Blockierungslösung, können verwendet werden, um die mitochondrienreichen Zellen des endolymphatischen Sacks zu identifizieren, obwohl auch in einer Untergruppe ribosomenreicher Zellen16 eine schwache Expression zu sehen ist (Abbildung 5).
- Nach drei Wäschen in 1x PBS für 15 min bei RT mit Sekundärantikörpern inkubieren. Für die hier vorgestellte Markierung inkubieren Sie 200 μl fluoreszierende Farbstoff-konjugierte Sekundärantikörper, verdünnt aus dem kommerziellen Stamm bei 1:500 in Blockierungslösung, wobei das Gewebe auf einer Schaukelplattform für 1 h bei RT im Dunkeln liegt. Fluoreszierendes Farbstoff-konjugiertes Phalloidin, das β-Aktin (ACTB) erkennt, kann verwendet werden, um das Vorhandensein des endolymphatischen Sacks und des Gangs sowie des sie umgebenden Bindegewebes hervorzuheben (Abbildung 5A, C, F-G).
- Montieren Sie endolymphatische Säcke zwischen einem Objektträger und einem Deckglas mit einem Antifading-Eindeckmedium mit DAPI. Nachdem Sie die Objektträger 1 h lang bei RT lichtgeschützt trocknen ließen, tragen Sie an der Verbindungsstelle zwischen Deckglas und Objektträger transparenten Nagellack auf, um sie abzudichten und die Bildung von Luftblasen zu begrenzen. Wenn versucht wird, die unterschiedliche Verteilung von Proteinen an der apikalen und der basolateralen Oberfläche der Epithelzellen sichtbar zu machen, empfiehlt es sich, den Sack während des Montageschritts zu öffnen, indem man eine Kante einschneidet und öffnet.
- Aufnahme mit einem konfokalen Mikroskop. Visualisieren Sie zunächst endolymphatische Sackpräparate mit einem 10-fachen Ziel, um einen globalen Überblick über die Sackmarkierung zu erhalten (Abbildung 5A-D). Verwenden Sie dann ein 63x-Objektiv, um einen detaillierten Überblick über die Verteilung des interessierenden Proteins in mitochondrien- und ribosomenreichen Zellen des endolymphatischen Sacks zu erhalten (Abbildung 5F-G).
Ergebnisse
Jeder Schritt dieser Mikrodissektion eines endolymphatischen Wildtyp-Sacks von einer Maus am postnatalen Tag 5 (P5) ist im zugehörigen Video detailliert beschrieben, und Schnappschüsse der wichtigsten Schritte dieser Dissektion und Eröffnung des endolymphatischen Sacks sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt.
Repräsentative Ergebnisse der Dissektionen des endolymphatischen Sacks mit tdTomato-Fluoreszenz am Embryonaltag 16.5 (E16.5), P5 und P30 nach diesem Protokoll sind in Abbildung 3 sowie in der ergänzenden Abbildung 1 und der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt. Unter Verwendung eines Dissektionsmikroskops mit Fluoreszenz kann der endolymphatische Sack nach Entfernung des Gehirns bei Mäusen, die das Transgen Tg(ATP6V1B1-Cre) tragen, in Gegenwart des Reporters der Cre-Expression: Ai9 (LSL-RCL-tdT) leicht im Schädel sichtbar gemacht werden (siehe Abbildung 3A-B und Ergänzende Abbildung 1 für Bilder, die unter einfallendem Licht und tdTomato-Fluoreszenz des endolymphatischen Sacks in verschiedenen Stadien der Dissektion aufgenommen wurden). Bei diesen Mäusen wird Cre als Mosaik in Zellen entlang des endolymphatischen Sacks und des Ductus exprimiert (Abbildung 3, siehe auch Ergänzende Abbildung 2 zur Visualisierung des endolymphatischen Sacks mit versus ohne fluoreszierenden Reporter). Obwohl die Expression dieses Reporters nicht spezifisch für die endogene Expression von Atp6v1b1 ist, die auf die mitochondrienreichen Zellen des endolymphatischen Sacks16, einem der beiden Zelltypen dieses Epithels, beschränkt ist (Abbildung 5E), ist er ein hilfreiches Hilfsmittel zur Identifizierung und Dissektion des endolymphatischen Sacks.
In Abbildung 4 sind Innenohren dargestellt, die aus einem Mausmodell zur Vergrößerung des vestibulären Aquädukts präpariert wurden. Im Vergleich zu Kontroll-Wurfgeschwistern sind die endolymphatischen Säcke und Kanäle von Mäusen mit einem Mangel an SLC26A4 (Pendrin) vergrößert.
Repräsentative Bilder der Immunhistochemie des intakten endolymphatischen Sacks mit und ohne Bindegewebe sind in Abbildung 5 dargestellt. Die Ergebnisse der Immunhistochemie des geöffneten endolymphatischen Sacks einer P5-Wildtyp-Maus werden ebenfalls vorgestellt (Abbildung 5F-G). Der endolymphatische Sack besteht aus einer einzigen Epithelschicht, die in einer beutelförmigen Struktur gefaltet ist und in ihrem Lumen die Endolymphe enthält. Dieses Epithel besteht aus zwei Zelltypen, mitochondrienreichen Zellen und ribosomenreichen Zellen (Abbildung 5E). Ein ganzer endolymphatischer Sack wird abgeflacht, da keine Endolymphe mehr vorhanden ist. Der Sack erscheint als zwei miteinander verschlungene Epithelschichten, was es schwierig macht, die subzelluläre Lokalisation von Proteinen zu bestimmen, die in diesem Epithel exprimiert werden. Durch Öffnen des endolymphatischen Sacks kann das einschichtige Epithel leicht sichtbar gemacht werden und die relative Verteilung der interessierenden Proteine in Bezug auf das Lumen des endolymphatischen Sacks kann eindeutiger bestimmt werden. Eine potentielle apikale (luminale, wo sich die Endolymphe befinden würde) versus basale Anreicherung dieser Proteine kann genauer bestimmt werden. Als Beispiel ist SLC26A4 auf der apikalen Seite von mitochondrienreichen Zellen angereichert (Abbildung 5F).
Abbildung 1. Sezierung des endolymphatischen Sacks einer Wildtyp-Maus am 5. Tag nach der Geburt (P5).
(A) Schematische Darstellung des membranösen Labyrinths eines entwickelten Innenohrs einer Maus (rechts). Angegeben sind die Lage des endolymphatischen Sacks sowie der Cochlea und der vestibulären Strukturen. Diese Zahl wurde von Honda et al.16 modifiziert.
(B) Mittlerer sagittaler Schnitt, der den linken Hemischädel zeigt. Die Lage des endolymphatischen Sacks ist angegeben (Pfeil). (O, okzipital; F, frontal)
(C) Otische Kapsel zusammen mit dem Plattenepithelteil des Schläfenbeins.
(D) Wichtige Orientierungspunkte, die auf dem gestrichelten Kasten in Feld C überlagert sind. (ES, endolymphatischer Sack; ED, Gang endolymphatischer Virus; VA, vestibuläres Aquädukt; ASC, vorderer Bogengang; PSC, hinterer Bogengang; CC, Crus; SS, Sinus sigmoideus)
(E) Schematische Darstellung des Querschnitts zusammen mit der durchgehenden weißen Linie auf Feld D durch den endolymphatischen Sack. Die proximale Seite des endolymphatischen Sacks ist zusammen mit dem Gang endolymphatischer Sack von einem knöchernen Kanal bedeckt, der als vestibuläres Aquädukt bezeichnet wird. Auf der distalen Seite erstreckt sich der endolymphatische Sack, der von konjonctivem Gewebe (CT) umgeben ist, und ragt nach außen aus dem knöchernen Labyrinth und ist zwischen der Dura mater (DM) und dem Sinus sigmoideus mit dem plattenepithelialen Teil des Schläfenbeins (TB) eingeklemmt.
(F) Mit einer feinen Nadel wird um den endolymphatischen Sack herum geschnitten (den gestrichelten gelben Linien auf Feld D folgend).
(G) Das Präparat wird vorsichtig aus dem Schläfenbein entfernt, indem das Gewebe an der durch das Sternchen (*, ebenfalls in Feld E dargestellten) Position gehalten und abgezogen wird.
(H) Ein isolierter ganzer endolymphatischer Sack mit umgebendem Gewebe.
(I) Schematische Version dieses isolierten endolymphatischen Sacks mit umgebendem Gewebe.
(J) Isolierter endolymphatischer Sack ohne umgebendes Gewebe.
Maßstabsleisten: 2 mm (B), 1 mm (J). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Dissektion des geöffneten endolymphatischen Sacks einer P5-Wildtyp-Maus.
(A) In Schritt 2.4 wird die Inzisionslinie am vestibulären Aquädukt leicht nach vorne positioniert (rote gestrichelte Linie), um einen Schnitt in das Lumen des endolymphatischen Sacks zu machen.
(B) Halten Sie den Stielteil des Präparats, führen Sie eine 27-Gauge-Nadel in das Lumen ein und bewegen Sie sie, um den endolymphatischen Sack in zwei Blätter zu schneiden.
(C) Schematische Darstellung von Tafel B.
(D) Halten Sie den Rand jedes Blattes mit einer Pinzette fest und trennen Sie sie voneinander.
(E) Schematische Darstellung von Tafel D.
(F) Der endolymphatische Sack ist in zwei Schichten unterteilt, die das Epithel und das umgebende Gewebe umfassen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Dissektion von R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn Endolymphatischer Sack der Maus bei E16.5, P5 und P30. Alle gezeigten Bilder zeigen die tdTomato-Fluoreszenz, die mit einem Stereomikroskop mit einem 1-x-Objektiv aufgenommen wurde, das für den Nachweis der tdTomato-Fluoreszenz ausgestattet ist.
(A, B) Mittlerer sagittaler Abschnitt des Schädels eines E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn-Maus vor (A) und nach (B) Halbhirnentfernung. Die tdTomato-Fluoreszenz beschreibt die Position des Innenohrs. Der endolymphatische Sack ist auch ohne Dissektion gut sichtbar (Pfeilspitze).
(C, E, G) Isolierte Innenohren von E16.5-, P5- bzw. P30-Mäusen.
(D, F und H) Bilder mit höherer Vergrößerung der entsprechenden mikrodissektionierten endolymphatischen Säcke und Gänge. Bei P30 ist der Gang endolymphatischer Gang in Knochen eingekapselt, was eine Isolierung besonders schwierig macht. Maßstabsleisten: 2 mm (A, B, C, E, G), 500 μm (D, F, H). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Grobanatomie der otischen Kapsel mit einem vergrößerten endolymphatischen Sack. Innenohren von Slc26a4+/- (links) und Slc26a4-/- (rechts) Maus-Wurfgeschwister bei P105. Der vestibuläre Aquädukt und der endolymphatische Sack und Gang (schwarz gestrichelte Linien) sind bei der Slc26a4-/- Maus im Vergleich zu einer Slc26a4+/- Maus vergrößert. Maßstabsleiste: 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. SLC26A4 Expression von mitochondrienreichen Zellen im endolymphatischen Sackepithel bei E16.5 und P5.
(A, B) Isolierter endolymphatischer Sack von E16.5-Maus, markiert mit Anti-SLC26A4-Antikörper (grün) und Phalloidin, das β-Aktin markiert (ACTB, rot).
(C) Ein Bild eines geöffneten endolymphatischen Sacks von P5-Mäusen mit geringer Vergrößerung, markiert mit einem Anti-SLC26A4-Antikörper (grün). Phalloidin (ACTB, rot) kann verwendet werden, um das Vorhandensein des endolymphatischen Sacks sowie des ihn umgebenden Bindegewebes hervorzuheben.
(D) Isolierter endolymphatischer Sack, der mit einem Anti-SLC26A4-Antikörper markiert ist (grün).
(E) Schematische Darstellung des epithels des endolymphatischen Sackes, die das Vorhandensein von zwei Zelltypen hervorhebt: die mitochondrienreichen Zellen, deren apikale Oberfläche mit Mikrovilli bedeckt ist, und die ribosomenreichen Zellen.
(F-G) Bilder des epithels des endolymphatischen Sacks bei P5 mit hoher Vergrößerung, nachdem der endolymphatische Sack geöffnet und mit einem Anti-SLC26A4-Antikörper (grün) und Phalloidin (ACTB, rot) markiert wurde. Ein repräsentatives Bild auf der Ebene der apikalen Membran ist in G dargestellt, und ein rekonstruierter Querschnitt aus dem z-Stapel auf der Ebene der punktförmigen weißen Linie ist in F dargestellt. Der Zellkern ist mit DAPI (blau) markiert.
Maßstabsleisten: 100 μm (A, B); 200 μm (C, D) ; 20 μm (F, G). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1. Auflicht- und entsprechende tdTomato-Fluoreszenzbilder eines P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn Maus-Innenohr in drei Schritten der Dissektion. Der endolymphatische Sack und der Gang können mit Hilfe der tdTomato-Fluoreszenz leicht sichtbar gemacht werden.
(A-B) Bereich des Innenohrs im hinteren Teil eines intakten Halbschädels eines P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn Maus.
(C-D) Die Entfernung der Haut und eines Teils des Schädels ermöglicht eine bessere Visualisierung der Region des endolymphatischen Sacks.
(E, F) Isoliertes Innenohr, wobei der endolymphatische Sack noch mit dem Bindegewebe verbunden ist.
(A, C, E) Bilder, die im Auflicht aufgenommen wurden. (B, D, F) tdTomatenfluoreszenz des entsprechenden Gewebes. Maßstabsleisten: 2 mm (A-B), 1 mm (C-F). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2. Vergleich der Fluoreszenz isolierter endolymphatischer Säcke von R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn und R26LSL-RCL-tdT/+ Wurfgeschwistermäuse bei E16,5 und P5. Die tdTomatenfluoreszenz erleichtert die Erkennung des endolymphatischen Sacks und des Ductus erheblich.
(A-C) Mikropräparierte endolymphatische Säcke von E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (A) und R26LSL-RCL-tdT/+ Wurfgeschwistermäuse (B, C).
(D-F) Mikrodissektionierte endolymphatische Säcke von P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (D) und R26LSL-RCL-tdT/+ Wurfgeschwistermäuse (E, F).
(A, B, D, E) tdFluoreszenz der Tomate. (C, F) Einfallslichtbilder entsprechen B und E. Maßstabsbalken: 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Diskussion
Viele Forscher haben in Paraffin eingebettete oder gefrorene Schnitte für morphologische Untersuchungen des endolymphatischen Sacks verwendet. Der Nachteil von geschnittenen Präparaten besteht darin, dass es schwierig sein kann, die komplizierten Zell-zu-Zell-Kontakte vollständig zu beobachten, da die Größe und Form jeder Epithelzelle im endolymphatischen Sack extrem variabel ist und eine faltige und pseudostratifizierte Zellschicht bildet. Die in diesem Protokoll beschriebene Immunfärbung und Z-Stack-Bildgebung ermöglichen eine bessere Visualisierung der dreidimensionalen Struktur des endolymphatischen Sacks.
Für eine erfolgreiche Mikrodissektion ist es entscheidend, den gesamten Umriss des endolymphatischen Sacks gedanklich zu visualisieren, auch wenn er bei der Wildtyp-Maus unsichtbar ist. Die Beobachtung des fluoreszierenden Reporters, der in Abbildung 3 und in der ergänzenden Abbildung 1-2 gezeigt ist, kann hilfreich sein, um die Lokalisation und Größe des endolymphatischen Sacks bei Mäusen zu erkennen.
Während diese Whole-Mount-Dissektionsmethode in dem obigen Protokoll für die Immunfärbung verwendet wurde, kann diese Technik auch zur Entnahme von endolymphatischem Sackgewebe für die Genexpressionsanalyse verwendet werden, wie z. B. RT-qPCR, Microarray-Expression und sogar Einzelzell-RNA-seq. Die Ergebnisse der Einzelzell-RNA-Seq-Analyse unter Verwendung von Gewebe, das mit diesem Protokoll präpariert wurde, wurden bereits berichtet16. Für die Genexpressionsanalyse von endolymphatischen Sackepithelzellen ist es vorzuziehen, isoliertes Epithel zu sammeln, so dass es keine Kontamination mit anderen angrenzenden Geweben gibt. Obwohl der embryonale endolymphatische Sack vom angrenzenden Bindegewebe getrennt werden kann, ist dies in späteren Jahren viel schwieriger. Bei Proben älterer Mäuse wird eine Inkubation mit Kollagenase/Dispase für 5 Minuten bei 37 °C empfohlen und erleichtert die Isolierung des endolymphatischen Sackepithels.
Einer der Nachteile der in diesem Protokoll beschriebenen Ganzbett-Immunfärbung besteht darin, dass die ursprüngliche dreidimensionale Struktur durch ein Trauma während der Dissektion oder Montage des Präparats zwischen Objektträger und Deckglas beeinträchtigt werden kann. Es ist Vorsicht geboten, um Artefakte durch Manipulation zu vermeiden.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Forschung wurde teilweise durch das Intramural Research Program der NIH, NIDCD (NIH Intramural Research Funds Z01-DC000060 und ZIC DC000081 zum Advanced Imaging Core) unterstützt. Wir danken Dr. Raoul D. Nelson und R. Lance Miller (University of Utah, Salt Lake City, UT) und Dr. Susan Wall (Emory University School of Medicine, Atlanta, GA) für die gemeinsame Nutzung der Tg(ATP6V1B1-Cre)-Mäuse und den Mitarbeitern der NIDCD-Tiereinrichtung für die Pflege unserer Tiere. Wir danken Dr. Philine Wangeman für die schöne Illustration des Innenohrs. Wir danken Dr. Thomas B. Friedman und Dr. Robert J. Morell für die kritische Begutachtung dieses Manuskripts.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| EDTA 0,5 M | Crystalgen | 221-057 | |
| 1 mL TUBERCULIN Spritze mit 27G x 13mm | BD | 309623 | |
| 9-Well-Spotglasplatte | Pyrex | 13-748B | |
| Alexa Fluor 555-konjugiertes Phalloidin | ThermoFisher Scientific | A34055 | |
| Arterie Schere - Kugelspitze | Fine Science Tools | 14080-11 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Kamera zum Aufnehmen von Bildern im Auflicht | Leica | DFC 495 | |
| Kamera zum Aufnehmen von fluoreszierenden Bildern | Leica | DFC 7000 GT | |
| Zentrifugenröhrchen 15 mL | Corning | 430053 | |
| Zentrifugenröhrchen 50 mL | Corning | 430829 | |
| Kollagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| Konfokalmikroskop | Zeiss | LSM 880 | |
| Deckglas | Corning | 2940-223 | |
| Dumont #4 Pinzetten | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 Pinzetten | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Pinzette | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Extra feine Bonn Schere | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Alternative: Extra feine Mikro-Präparierschere; Gerade; Scharfe Spitzen; 20 mm Klingenlänge; 3 1/2" Gesamtlänge | Roboz | RS-5880 | |
| Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488-konjugierter Sekundärantikörper | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| MicroSlides Superfrost | VWR | 48311-702 | |
| Orbitalschüttler, z. B. Mini Shaker | Daigger | 980275 | |
| Paraformaldehyd (PFA) 16% wässrige Lösung | Elektronenmikroskopie Sciences | 15710 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10X) pH 7,4 | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
| ProLong Gold Antifading-Eindeckmittel mit DAPI | ThermoFisher Scientific | P36931 | |
| Kaninchen-Anti-Pentrin-Antikörper | Hauseigene | RRID:AB_2713943, PB826 (Choi et al., 2011) | |
| Ringzange | Feinwissenschaftliche Werkzeuge | 11106-09 | |
| Schaukelschüttler, z.B. GyroMini | Labnet | S0500 | |
| Stereomikroskop ausgestattet mit einem PlanApo 1.0x Objektiv | Leica | ||
| Edelstahl Single Edge Blades, .009" | GEM Personna | 62-0176 | |
| Gewebekulturschale 60 mm | Falcon | 353002 | |
| Transparenter Nagellack | |||
| Triton X-100 | ACROS Organische Stoffe | 32737-1000 |
Referenzen
- Dror, A. A., Brownstein, Z., Avraham, K. B. Integration of human and mouse genetics reveals pendrin function in hearing and deafness. Cellular Physiology and Biochemistry. 28 (3), 535-544 (2011).
- Reardon, W., CF, O. M., Trembath, R., Jan, H., Phelps, P. D. Enlarged vestibular aqueduct: a radiological marker of pendred syndrome, and mutation of the PDS gene. QJM. 93 (2), 99-104 (2000).
- Griffith, A. J., Wangemann, P. Hearing loss associated with enlargement of the vestibular aqueduct: mechanistic insights from clinical phenotypes, genotypes, and mouse models. Hearing Research. 281 (1-2), 11-17 (2011).
- Gurkov, R., Pyyko, I., Zou, J., Kentala, E. What is Meniere's disease? A contemporary re-evaluation of endolymphatic hydrops. Journal of Neurology. 263, Suppl 1 71-81 (2016).
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- Choi, B. Y., et al. Mouse model of enlarged vestibular aqueducts defines temporal requirement of Slc26a4 expression for hearing acquisition. Journal of Clinical Investigation. 121 (11), 4516-4525 (2011).
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Nachdrucke und Genehmigungen
