Hier präsentieren und evaluieren wir ein Protokoll zur Herstellung kostengünstiger Umkehrphasen-Nanofluss-Flüssigkeitschromatographiesäulen für die Peptidcharakterisierung unter Verwendung von LC-MS/MS-Proteom-Workflows.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
* These authors contributed equally
Hier präsentieren und evaluieren wir ein Protokoll zur Herstellung kostengünstiger Umkehrphasen-Nanofluss-Flüssigkeitschromatographiesäulen für die Peptidcharakterisierung unter Verwendung von LC-MS/MS-Proteom-Workflows.
Die hohe Komplexität, die in biologischen Proben vorherrscht, erfordert chromatographische Trennungen mit hoher Empfindlichkeit und Auflösung, um effektiv analysiert werden zu können. Hier stellen wir ein robustes, reproduzierbares und kostengünstiges Protokoll für die Herstellung von Nanofluss-Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Säulen (RP-HPLC) für die Online-Trennung von analytischen Peptiden vor, bevor sie in traditionelle Bottom-up-Proteomik-Arbeitsabläufe eingeführt und mit einem Massenspektrometer detektiert werden. Abhängig vom Ziel des Experiments und den chemischen Eigenschaften der zu trennenden Analyten können sich die optimalen Säulenparameter in ihren Innen- oder Außendurchmessern, ihrer Länge, der Partikelgröße, der Porengröße, der Chemie der Partikel der stationären Phase und dem Vorhandensein oder Fehlen eines integrierten Elektrospray-Emitters an der Spitze unterscheiden. Ein hauseigenes Säulenpacksystem ermöglicht nicht nur die schnelle Herstellung von Säulen mit den gewünschten Eigenschaften, sondern reduziert auch die Kosten des Prozesses drastisch. Das hier besprochene optimierte Protokoll für die Packung einer C18 AQ (wässrigen) Quarzglassäule ist mit einer Vielzahl von flüssigchromatographischen Instrumenten kompatibel, um eine effektive Trennung von Analyten zu erreichen.
HPLC-Säulen haben immens zur Produktivität in den Bereichen Pharmazie, Medizin und Umweltforschung beigetragen 1,2,3,4. Der Zugang zu hochwertigen Chromatographiesäulen ist ein entscheidender Schritt bei der Fraktionierung komplexer Analyten. In der Schrotflintenproteomik wird eine hohe analytische Empfindlichkeit routinemäßig durch die Kopplung der Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI) mit der Nanoflow-Chromatographie erreicht 5,6,7,8.<....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
1. Vorbereitung der Kapillarspitze
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Um die Leistung der Säulen zu bewerten, wurden 750 ng tryptische Peptidverdaue, die aus Ganzzelllysaten von HEK293-Zellen hergestellt wurden, online mit einer 25 cm langen Kapillare aus Quarzglas mit einem Innendurchmesser von 75 μm fraktioniert, die im eigenen Haus mit ReproSil-Pur 120 C18-AQ-Partikeln verpackt war, wie im Protokoll beschrieben. Vor der Probenbeladung wurde die Säule mit 6 μl einer Mischung aus Acetonitril, Isopropanol und H2O in einem Verhältnis von 6:2:2 gewaschen und mit Puffer A (Puffer A.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Moderne proteomische Strategien sind auf qualitativ hochwertige chromatographische Trennungen angewiesen, um komplexe biologische Systeme effektiv analysieren zu können. Daher sind leistungsstarke und kostengünstige Nanoflow-LC-Säulen entscheidende Komponenten eines erfolgreichen Tandem-Massenspektrometrie-Regimes, das darauf abzielt, Tausende von Proteinen in einem einzigen Arbeitsablauf zu charakterisieren.
In dieser Studie untersuchten wir die Leistung und .......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Diese Arbeit wurde durch das Stipendium der National Institutes of Health unterstützt, das an J.A.W. GM089778 wurde.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 99,99% Formamidsäure | Sigma-Aldrich | zur Herstellung von Frittenalkohollampen | |
| Jede Marke | Zur Wärmebereitstellung | ||
| Brechbühler Heliumdruckzelle | BioSurplus | für die Packungskolonne | |
| Keramiksäulenschneider | Jede Marke | zum Schneiden von Siliziumdioxid-Kapillare | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) ≥ 99% | Sigma-Aldrich | Lagerung in einem brennbaren Schrank | |
| Formamid ≥ 99,5% | Sigma-Aldrich | für die Herstellung von Fritte | |
| Flusssäure (HF) (50%) | Fisher Scientific | für das Öffnen des Emitters nach der Polymerisation | |
| KASIL (Kaliumsilikatlösung) | PQ Corporation | für die Herstellung von Fritte | |
| Orbitrap Fusion Lumos | Thermo Fisher Scientific | für die MS-Datenerfassung | |
| P2000 Laser Puller | Sutter | zum Ziehen von Kapillaren | |
| PTFE 1/16" Ferrule 0,4 mm ID (lang) für Rohrverschraubung | Chromre | 214104 | Zum Einstellen von Bomben |
| Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1,9 um, 1g | Dr. Masch GmbH | r119.aq.0001 | Batch 5910 |
| Löten | Jede Marke | Zum Initiieren der Polymerisierung | |
| Edelstahl-Rohrverschraubung, Sechskantkupplung, 1/4 Zoll. NPT-Buchse | Swagelok | SS-4-HCG | zum Setzen von Bomben |
| TSP075375 Quarzglas, 75 & Mikro; m ID x 360 &Mikro; OD | MOLEX/Polymicro | 1068150019 | Für Säulenschläuche |
| Ultimate 3000 UHPLC | Dionex | HPLC Typ |
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Dieser Artikel wurde veröffentlicht
Video demnächst verfügbar