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Methodenartikel

Ein orthotopes Mausmodell für Eierstockkrebs unter Verwendung von menschlichem Stroma zur Förderung der Metastasierung

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DOI:

10.3791/62382

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23. März 2021

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology/Oncology, Department of Medicine, Hillman Cancer Center, University of Pittsburgh, 2Division of Gynecologic Oncology, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Sciences, Magee-Womens’ Hospital, University of Pittsburgh Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die orthotope Transplantation von Eierstockkrebszellen, gemischt mit menschlichen Stromazellen, liefert ein Mausmodell, das ein schnelles, diffuses Metastasierungsverhalten zeigt, das für menschlichen Eierstockkrebs charakteristisch ist. Dieses Modell ermöglicht auch die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Stromazellen sowie ihrer Rolle bei der Tumorprogression und Metastasierung.

Zusammenfassung

Eierstockkrebs ist durch frühe, diffuse Metastasen gekennzeichnet, wobei 70 % der Frauen zum Zeitpunkt der Diagnose eine metastasierende Erkrankung haben. Es gibt zwar elegante transgene Mausmodelle für Eierstockkrebs, aber diese Mäuse sind teuer und brauchen lange, um Tumore zu entwickeln. Intraperitoneale Injektions-Xenotransplantatmodelle haben kein menschliches Stroma und modellieren die Metastasierung von Eierstockkrebs nicht genau. Selbst patienteneigene Xenotransplantate (PDX) rekapitulieren die menschliche stromale Mikroumgebung nicht vollständig, da serielle PDX-Passagen einen signifikanten Verlust des menschlichen Stromas zeigen. Die Möglichkeit, menschlichen Eierstockkrebs in einer physiologisch relevanten stromalen Mikroumgebung einfach zu modellieren, ist ein ungedeckter Bedarf. Hier stellt das Protokoll ein orthotopes Mausmodell für Eierstockkrebs vor, das humane Eierstockkrebszellen in Kombination mit von Patientinnen stammenden Karzinom-assoziierten mesenchymalen Stammzellen (CA-MSCs) verwendet. CA-MSCs sind stromale Vorläuferzellen, die die Bildung der stromalen Mikroumgebung vorantreiben und das Wachstum und die Metastasierung von Eierstockkrebs unterstützen. Dieses Modell entwickelt sich früh und diffundiert Metastasen, die das klinische Erscheinungsbild nachahmen. In diesem Modell werden Luciferase-exprimierende Eierstockkrebszellen im Verhältnis 1:1 mit CA-MSCs gemischt und in die Eierstockschleimbeutel von NSG-Mäusen injiziert. Das Tumorwachstum und die Metastasierung werden mit Hilfe der Biolumineszenz-Bildgebung seriell über die Zeit verfolgt. Die resultierenden Tumoren wachsen aggressiv und bilden 14 Tage nach der Injektion abdominale Metastasen. Bei Mäusen kam es zu einer signifikanten Abnahme des Körpergewichts als Marker für systemische Erkrankungen und eine erhöhte Krankheitslast. Am Tag 30 nach der Injektion erreichten die Mäuse die Endpunktkriterien von >10 % Körpergewichtsverlust und die Autopsie bestätigte intraabdominale Metastasen bei 100 % der Mäuse und 60 % bis 80 % der Lungen- und parenchymalen Lebermetastasen. Insgesamt erzeugt die orthotope Transplantation von Eierstockkrebszellen und Stromazellen Tumore, die das frühe und diffuse Metastasierungsverhalten des menschlichen Eierstockkrebses genau nachahmen. Darüber hinaus bietet dieses Modell ein Werkzeug, um die Rolle von Eierstockkrebszellen zu untersuchen: Stromazell-Interaktionen bei der metastasierenden Progression.

Einleitung

Eierstockkrebs ist eine tödliche Krankheit mit derfünfthöchsten Sterblichkeitsrate aller Krebsarten bei Frauen1. Die meisten Frauen mit Eierstockkrebs werden in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, wobei bei 70 % der Patientinnen zum Zeitpunkt der Diagnose eine metastasierende Ausbreitung vorhanden ist. Faktoren wie frühe Metastasen und fortgeschrittenes Stadium bei der Diagnose tragen zu den hohen Sterblichkeitsraten bei dieser Krankheit bei. Darüber hinaus stellten diese einzigartigen Krankheitsmerkmale eine Herausforderung für die Etablierung von Mausmodellen für Eierstockkrebs dar, einschließlich der Reproduktion einer schnellen Krankheitsmigration in die Bauchhöhle 2,3,4.

Die Pathogenese des Eierstockkarzinoms, einschließlich der Ausbreitung des Bauchfells, wird durch die Bildung einer unterstützenden Tumormikroumgebung (TME) erleichtert, die aus vielen Elementen besteht5. Eine kritische Komponente der TME des Eierstockkarzinoms ist die Karzinom-assoziierte mesenchymale Stammzelle (CA-MSC). CA-MSCs sind stromale Vorläuferzellen, die die Initiierung, das Wachstum, die Chemotherapieresistenz und die Metastasierung von Eierstockkrebs verbessern 6,7. CA-MSCs treiben auch die Bildung des Eierstockkrebs-TME voran, indem sie die tumorassoziierte Fibrose stimulieren, die Angiogenese induzieren und die Immunmikroumgebung verändern 6,8,9. Angesichts der leistungsstarken Funktionen von CA-MSCs innerhalb der TME für Eierstockkrebs ist die Modellierung von menschlichem Eierstockkrebs in einer physiologisch relevanten stromalen Mikroumgebung für die Untersuchung des Fortschreitens und der Metastasierung von Eierstockkrebs von entscheidender Bedeutung.

In jüngster Zeit haben transgene Mausmodelle bei der Erforschung von spontanen Metastasen von Eierstockkrebs an Bedeutung gewonnen. Transgene Mäuse sind jedoch kostspielig und weisen einen verlängerten Zeitverlauf für die Entwicklung einer metastasierenden Erkrankung auf. Während andere verfügbare Mausmodelle wie das intraperitoneale Modell und patientenabgeleitete Xenotransplantate (PDX) relativ kurze metastatische Zeitintervalle aufweisen, rekapitulieren sie Metastasen bei Eierstockkrebs aufgrund des Fehlens einer relevanten stromalen Mikroumgebung nicht vollständig 10,11,12. In einem Versuch, diese Herausforderung zu meistern, wird in dieser Studie ein orthotopes Ovarialkarzinom-Mausmodell vorgestellt, das humane Eierstockkrebszellen in Kombination mit von Patientinnen stammenden CA-MSCs verwendet. In dem hier beschriebenen Modell erzeugt die Kombination von CA-MSCs mit Eierstockkrebszellen Tumore mit frühen und diffusen Metastasen, wie das Vorhandensein von intraabdominalen Metastasen bei 100% der Mäuse innerhalb von 30 Tagen nach der Injektion zeigt.

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Protokoll

Die Patientenproben wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen entnommen, die vom IRB (PRO17080326) der University of Pittsburgh genehmigt wurden. Tierexperimentelle Methoden wurden im Rahmen des vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pittsburgh genehmigten Protokolls durchgeführt.

1. Isolierung und Validierung von vom Patienten stammenden Karzinom-assoziierten mesenchymalen Stammzellen (CA-MSCs)

HINWEIS: CA-MSCs stammen aus chirurgisch reseziertem menschlichem Eierstockkrebsgewebe (in dieser Studie wurde ein hochgradiges seröses Karzinom verwendet), einschließlich des Eileiters, der Eierstöcke und/oder der omentalen Metastasierungen. CA-MSC-Medium wird aus MEBM (Mamma-Epithelzell-Basalmedium) hergestellt, das mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS, 1x B27, 20 ng/ml EGF, 1 ng/ml Hydrocortison, 5 μg/ml Insulin, 100 μM β-Mercaptoethanol, 10 ng/ml β-FGF, 1 % Penicillin/Streptomycin und 20 μg/ml Gentamicin 7,13 ergänzt wird.

  1. CA-MSC-Isolierung
    1. Teilen Sie die Gewebeprobe mit einem sterilen Skalpell und einer Pinzette in Stücke mit einer Größe von ca. 1 mm3 . Legen Sie drei Stücke des Gewebes in jede Vertiefung einer 6-Well-Zellkulturplatte.
      HINWEIS: 0,2 g des Tumorgewebes können in 12 Stücke geschnitten und auf vier Vertiefungen einer 6-Well-Zellkulturplatte verteilt werden.
    2. Fügen Sie eine dünne Schicht CA-MSC-Medien hinzu, ca. 1 ml pro Vertiefung. Stellen Sie die Zellkulturplatte bei 37 °C und 5 % CO2 in einen befeuchteten Inkubator.
    3. Entfernen Sie das Medium nach 24 h vorsichtig, ohne die Gewebestücke zu beschädigen. Geben Sie ca. 1 ml frisches Medium in jede Vertiefung. Pipettieren Sie das Medium langsam, ohne die Gewebeansätze zu stören. Stellen Sie die Zellkulturplatte wieder in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2.
      HINWEIS: Untersuchen Sie das Gewebe jeden Tag mit einem inversen Mikroskop und wechseln Sie das Medium wie in Schritt 1.1.3 beschrieben, wenn tote Zellen in den Nährmedien sichtbar gemacht werden.
    4. Nach 7 Tagen entfernen Sie die Gewebestücke, indem Sie das Gewebe mit einer sterilen Pinzette aufnehmen und die adhärenten Zellen einmal mit PBS waschen (PBS ohne Ca2+/Mg2+, 1 mL pro Well). Fügen Sie dann frisches CA-MSC-Medium (2 mL pro Vertiefung) hinzu und stellen Sie die Zellkulturplatte in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2.
  2. Ausbau der CA-MSCs
    1. Wenn CA-MSCs aus dem Gewebe innerhalb der 6-Well-Platte zu wachsen beginnen, untersuchen Sie die Zellen jeden zweiten Tag mit einem inversen Mikroskop, um das Zellwachstum sicherzustellen. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreicht haben, fahren Sie mit den folgenden Schritten fort.
    2. Aspirieren Sie das Medium aus der Zellkulturplatte und waschen Sie die Zellen einmal mit 1-2 mL PBS pro Vertiefung (PBS ohne Ca2+/Mg2+).
    3. Fügen Sie 300 μl 0,05 % Trypsin/0,02 % EDTA-Lösung (Trypsin/EDTA) pro Vertiefung hinzu. Drehen Sie die Zellkulturplatte, um die Zellen mit Trypsin/EDTA zu bedecken, und stellen Sie die Zellkulturplatte für 2-3 Minuten oder bis die Zellen abgelöst sind, wieder in den Inkubator zurück.
    4. Fügen Sie frisches CA-MSC-Medium hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren (1 ml pro Well) und die Zellen wieder zu suspendieren. Bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen wieder mit Wachstumsmedium. Die resuspendierten Zellen werden in einen 25 cm2 Kolben mit einem Gesamtvolumen von 5 ml Kulturmedium überführt.
      HINWEIS: Zellen, die aus drei Vertiefungen einer 6-Well-Zellkulturplatte entnommen wurden, können in einen 25-cm-2-Kolben überführt werden. Die Zellen sollten auf das Vorhandensein von Mykoplasmen getestet werden (nach einem etablierten Mykoplasmennachweisprotokoll wie PCR), da sie aus chirurgisch reseziertem menschlichem Gewebe stammen 14,15.
    5. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht haben, werden die Zellen von einem 25 cm2 Kolben in einen 75 cm2 Kolben überführt, indem die zuvor beschriebenen Schritte 1.2.2 bis 1.2.4 ausgeführt werden. Erweitern Sie die Zellen alle 5-7 Tage, um die Zellzahl zu erhalten, die für die CA-MSC-Validierung und für das orthotope Inokulationsverfahren erforderlich ist.
      HINWEIS: Da es sich bei CA-MSCs um vom Patienten stammende Zellen handelt, unterscheidet sich die zelluläre Verdopplungszeit zwischen den Zelllinien. Die meisten CA-MSCs benötigen 3-4 Tage, um die Anzahl zu verdoppeln. Einige CA-MSCs benötigen jedoch 5-7 Tage, um die Anzahl zu verdoppeln. CA-MSCs können 8-10 Mal durchlaufen werden. Nach Passage 10 können CA-MSCs altern oder sich differenzieren.
  3. CA-MSC-Validierung
    1. Validierung der Oberflächenexpression von CA-MSCs: Verwenden Sie 0,5 x 106 CA-MSCs (ca. 70 % Konfluenz in einem 75-cm-2-Kolben) für die durchflusszytometrische Analyse, um sicherzustellen, dass CA-MSCs geeignete Oberflächenmarker exprimieren, wie sie in den Richtlinien der International Society for Cellular Therapy definiert sind, wie zuvor beschrieben (CD73/CD90/CD105 positiv; CD45/CD34/CD14 oder CD11b/CD79a oder CD19/HLA-DR negativ)7,16. Bestätigen Sie die Zellzahl nach der Trypsinisierung und zählen Sie mit einem Hämozytometer unter Ausschluss von Trypanblau-toten Zellen.
      HINWEIS: Wenn die Durchflusszytometrie-Analyse zeigt, dass die Zellen zu <90 % rein sind, sortieren Sie die Zellen nach der CA-MSC-Population.
    2. Validierung der CA-MSC-Differenzierung: Um die Differenzierung der Abstammungslinie zu validieren, seeden Sie CA-MSCs in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit einer Zelldichte von 5 x 104 Zellen/Well in 2 ml MSC-Medium (eine Vertiefung pro Differenzierungsbedingung). Nach 24 Stunden wechseln Sie das Medium auf das entsprechende Differenzierungsmedium, um die Differenzierung von Adipozyten vs. Chondrozyten vs. Osteozyten zu induzieren, wie zuvor beschrieben 7,16.
      HINWEIS: Gemäß den ISCT-Richtlinien müssen MSCs in vitro eine Differenzierung in mindestens zwei Linien (Adipozyten, Chondrozyten oder Osteozyten) aufweisen.
  4. Am Tag der geplanten Mausinjektion entnehmen Sie die Zellen, indem Sie die Schritte 1.2.2 und 1.2.4 befolgen. Zählen Sie dann die Zellen mit einem Hämozytometer mit Trypanblau-Ausschluss für die Lebensfähigkeit und resuspendieren Sie die Zellen in CA-MSC-Medium bei einer Dichte von 1 x 108 Zellen/ml (0,5 x 106 CA-MSCs pro Injektion). Legen Sie die suspendierten Zellen auf Eis.
    HINWEIS: Im Allgemeinen können mindestens 1 x 107 CA-MSC aus einer Tumorprobe (0,2 g Gewebe) gewonnen werden. Auf diese Weise kann für die meisten Mausexperimente eine einzige vom Patienten abgeleitete CA-MSC-Linie verwendet werden. Es ist möglich, CA-MSCs von verschiedenen Patientinnen zu kombinieren, aber wir empfehlen, dass sie vom selben histologischen Subtyp des Eierstockkrebses abstammen. Die meisten CA-MSCs-Linien benötigen 2 Monate und/oder 6-7 Passagen, um 1 x 107 Zellen zu erreichen. CA-MSCs können mit Standard-Zellgefriermedien eingefroren und für die spätere Verwendung unbegrenzt in flüssigem Stickstoff gelagert werden.

2. Vorbereitung der Eierstockkrebszellen

  1. Halten Sie OVCAR3-Luc-Zellen in DMEM-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin/Streptomycin (Penicillin: 100 Einheiten/ml, Streptomycin: 0,1 mg/ml). Kultivieren Sie Zellen bei 37 °C in einem 5 % CO2 -befeuchteten Inkubator.
  2. Entnehmen Sie am Tag der Injektion OVCAR3-Luc-Zellen mit den folgenden Schritten.
    1. Zuerst wird das Medium aus dem Zellkulturkolben aspiriert und die Zellen einmal mit 5-7 mL PBS pro 75 cm2 Kolben (PBS ohne Ca2+/Mg2+) gewaschen. Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie Trypsin/EDTA-Lösung hinzu (2 mL pro 75 cm2 Kolben). Stellen Sie dann den Zellkulturkolben für 3-5 Minuten oder bis die Zellen abgelöst sind, in den Inkubator zurück.
    2. Stellen Sie mit Hilfe der Mikroskopie eine vollständige Trypsinisierung der Zellen sicher (stellen Sie sicher, dass alle Zellen vom Kulturkolben gelöst sind). Um die Trypsinisierung zu stoppen, geben Sie frisches serumhaltiges DMEM in den Kolben (2-3 mL pro 75 cm2 Kolben) und suspendieren Sie die Zellen erneut. Übertragen Sie die Zellen mit einer Pipette in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
    3. Bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen wieder mit Wachstumsmedium. Zählen Sie dann die Zellen und resuspendieren Sie sie in Wachstumsmedium mit einer Dichte von 1 x 108 Zellen/ml (0,5 x 106 OVCAR3-Luc-Zellen pro Injektion). Legen Sie die suspendierten Zellen auf Eis.

3. Orthotope Inokulation

  1. Herstellung der Zellsuspension
    1. Mischen Sie CA-MSCs und OVCAR-Luc-Zellen im Verhältnis 1:1.
    2. Tauen Sie die gefrorene Basalmembranmatrix in einem Eisbad auf. Anschließend wird die in Schritt 3.1.1 hergestellte Zellsuspension im Verhältnis 1:1 (endgültige Zellkonzentration: 1 x 106/ 20 μl Medium-Basalmembranmatrix) in die Basalmembranmatrix gegeben und gründlich vermischt. Die vorbereiteten Zellsuspensionen sollten bis zur Verwendung in einem Eisbad aufbewahrt werden.
      HINWEIS: Hier wird ein Verhältnis von 1:1 CA-MSC zu OVCAR-Luc beschrieben, das auf früheren Erfahrungen mit dem genannten Modell basiert. Frühere Arbeiten zeigten, dass CA-MSCs im Allgemeinen in einem Verhältnis von 1:10 zu Tumorzellen stehen, wenn sie direkt aus Patientengewebe quantifiziert werden. Wie unten diskutiert, ergibt sich ausgehend von einem Verhältnis von 1:1 CA-MSC zu Tumorzellen ein ungefähres Verhältnis von CA-MSC zu Tumorzellen von 1:10 sowohl an der primären als auch an der metastasierten Stelle an experimentellen Endpunkten unter Verwendung dieses Modells.
  2. Chirurgie
    HINWEIS: Die Operation sollte unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden und es müssen sterile chirurgische Instrumente verwendet werden. Es wird empfohlen, weibliche NSG-Mäuse im Alter von 8 Wochen für dieses orthotope Modell zu verwenden.
    1. Betäuben Sie die Maus durch Inhalation mit Isofluran (4 % für die Induktion, 2 % für die Erhaltung) und Sauerstoff (100 %, Durchflussmesser 0,5-1 L/min). Platzieren Sie die Maus auf dem präoperativen Nasenkonussystem. Um während der gesamten Operation eine Anästhesie durchzuführen (siehe detaillierte Anweisungen unten), führen Sie den Kopf der Maus in das Nasenkegelsystem des Isofluran-Verdampfers ein.
    2. Injizieren Sie der Maus subkutan 5 mg/kg Carprofen, ein präoperatives Analgetikum, mit einer Insulinspritze.
    3. Rasieren Sie mit einer Haarschneidemaschine den linken kaudalen Teil der Maus zwischen dem Rippenrand und dem Oberschenkelknochen. Sterilisieren Sie den rasierten Bereich mit Povidon-Jod-Lösung und Alkoholtupfern. Übertragen Sie dann die Maus in das chirurgische Nasenkonussystem und stellen Sie das Isofluran für die Erhaltungsanästhesie auf 1,5 % ein.
    4. Machen Sie einen 1-2 cm langen horizontalen Hautschnitt ca. 2-3 cm unterhalb des Rippenrandes. Fassen Sie das parietale Peritoneum mit einer Pinzette und legen Sie es hoch (das Peritoneum erscheint glänzend und ist durch Ablagerungen von Fettgewebe gekennzeichnet). Machen Sie einen 1 cm langen Schnitt im parietalen Peritoneum, um die Bauchhöhle zu öffnen.
    5. Beobachten Sie die Ansammlung von Fettgewebe, das den Eierstock der Maus (den Schleimbeutel der Eierstöcke) beim Eintritt in den Bauchperitoneal umgibt. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um den Schleimbeutel der Eierstöcke zu greifen und freizulegen. Während Sie den Eierstock mit der Pinzette fest umklammern, injizieren Sie 20 μl der in Schritt 3.1.2 hergestellten Zellsuspension in den Schleimbeutel.
    6. Bringen Sie den Eierstock vorsichtig wieder in die Bauchhöhle zurück. Mit einem resorbierbaren Naht aus Polyglykolsäure 6-0, das an einer Nadel befestigt ist, nähern Sie sich den Rändern des parietalen Peritonealschnitts wieder an. Verschließen Sie den Hautschnitt mit Wundklammern.
    7. Nehmen Sie die Maus aus dem Nasenkonus und setzen Sie die Maus in einen separaten, sauberen Käfig unter wärmendem Licht, bis sie das Bewusstsein erlangt und die Brustbeinlage beibehält. Setzen Sie dann die Maus wieder in ihren Käfig ein.
    8. Überwachen Sie die Mäuse täglich für 3-7 Tage nach der Operation. Legen Sie einen Becher Carprofen-Gel zur Schmerzkontrolle in die Mauskäfige. Entfernen Sie die Wundklammern 7-10 Tage nach der Operation.

4. Wöchentliche Überwachung des Tumorwachstums und des Körpergewichts der Maus

  1. In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS): Ab der ersten Woche nach der orthotopen Inokulation führen Sie in den nächsten 3-4 Wochen jede Woche eine In-vivo-Bildgebung durch.
    1. Bereiten Sie die Lösung von D-Luciferin (Substrat der Glühwürmchen-Luziferase) vor, indem Sie 15 mg in 1 ml PBS auflösen und zur Sterilisation durch eine 0,22 μm-Membran filtrieren.
    2. Betreiben Sie den IVIS gemäß den Anweisungen des Herstellers. Klicken Sie auf das Desktop-Symbol der Living Image Software . Wählen Sie dann in der IVIS-Erfassungssteuerung die Option Initialisieren aus. Dieser Schritt kann bis zu 10-15 Minuten dauern. Bereiten Sie die Mäuse in dieser Zeit für die Bildgebung vor.
    3. Anästhesieren Sie jede Maus mit der Isoflurankammer, die mit IVIS verbunden ist (2%-4% Isofluran- und Sauerstoffdurchflussmesser auf 0,5-1 l/min). Injizieren Sie das D-Luciferin (100 μL/10 g Körpergewicht) durch intraperitoneale Injektion mit einer Insulinspritze.
    4. Setzen Sie das mit Luciferin injizierte Tier zurück in die Isoflurankammer.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Injektionszeit aufzuzeichnen, um die Zeit zwischen der Luciferin-Injektion und der Bildgebungsleistung während der gesamten Studie konsistent zu halten.
    5. Übertragen Sie die anästhesierte Maus in die Bildgebungskammer und stellen Sie das Bildgebungssystem auf die entsprechenden Einstellungen ein. Erfassen Sie dann das Bild zum richtigen Zeitpunkt.
    6. Nachdem Sie die Bilder gespeichert haben, nehmen Sie die Mäuse aus der Bildgebungskammer und setzen Sie sie wieder in ihre jeweiligen Käfige ein.
      HINWEIS: CA-MSCs können auch mit einer Fluoreszenzmarkierung markiert und die Migration/Co-Metastasierung von CA-MSCs und OVCAR3-Luc-Zellen in vivo unter Verwendung eines Fluoreszenzkanals auf dem IVIS überwacht werden.

5. Beurteilung von CA-MSC: metastasierende Ablagerungen von Tumorzellen

  1. Bei Erreichen des vordefinierten Endpunkts (Gewichtszunahme >20 % bei Vorhandensein von Aszites, Gewichtsverlust <10 %, Tumorgeschwüre, Körperkonditionierungswert von 2 oderweniger 17) werden die Mäuse gemäß den institutionellen Tierschutzstandards eingeschläfert.
  2. Führen Sie eine Autopsie an jeder Maus einzeln durch. Platzieren Sie eine sterile 18-G-Nadel intraperitoneal, um Aszites abzusaugen. Als nächstes legen Sie den Brustkorb und die Bauchhöhle frei. Quantifizierung der grobmetastasierten Erkrankung durch visuelle Inspektion der Tumorbeteiligung von murinen Organen18.
  3. Entfernen Sie das Tumorgewebe mit einem sterilen Skalpell und fixieren Sie es entweder in Paraformaldehyd für eine eventuelle Paraffineinbettung, ii) frieren Sie es ein und betten Sie es in OTC-Kryostaten-Einbettungsmedien ein, iii) frieren Sie es ein Schockfrost für die nachgeschaltete DNA-, RNA- oder Proteinanalyse durch oder iv) dissoziieren Sie in einzelne Zellen für die Durchflusszytometrie oder FACS-Isolierung.
    HINWEIS: CA-MSCs bleiben in diesem Modell funktionsfähig und können für Downstream-Anwendungen erneut isoliert werden. Abhängig vom Ziel der Studie können die CA-MSC-Interaktionen mit Tumorzellen über immunhistochemische Ansätze, durchflusszytometrische Ansätze oder die Aufrechterhaltung reisolierter Zellen in Kultur untersucht werden.

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Ergebnisse

Der beschriebene Ansatz ahmt die unterstützende Mikroumgebung des Eierstockkarzinoms (insbesondere des hochgradigen serösen Karzinoms) durch Co-Injektion von mesenchymalen Stammzellen (CA-MSCs) und Eierstockkrebszellen in den Schleimbeutel der Eierstöcke nach. Zunächst wurden CA-MSCs aus primärem, chirurgisch reseziertem humanem hochgradigem serösem Ovarialkarzinom mit Beteiligung des Omentums isoliert (alle CA-MSCs, die in diesem Experiment verwendet wurden, stammten von derselben Patientin). Nach 2-wöchiger Beschichtun...

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Diskussion

Trotz erheblicher klinischer und Forschungsanstrengungen wurden bei der Behandlung und Prävention von Eierstockkrebs nur minimale Fortschritte erzielt1. Während eine Vielzahl von Mausmodellen verwendet wurde, um das Fortschreiten und die Metastasen von Eierstockkrebs zu untersuchen, waren diese Modelle mit erheblichen Einschränkungen konfrontiert. Insbesondere waren frühere Mausmodelle nicht in der Lage, den natürlichen Verlauf des Fortschreitens des Eierstockkreb...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

Wir danken dem Gynäkologischen Onkologie-Bioprobenprogramm-Promark für die Hilfe bei der Gewebeentnahme. LGC wird unterstützt von Tina's Wish Rising Star Grant und der Mary Kay Foundation.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,05 % Trypsin/0,02 % EDTASigmaSLCD2568
Anti-Human-CD105BD Pharmingen560847
Anti-Human-CD73BD Pharmingen555596
Anti-Human-CD90BD Pharmingen561443
B27Gibco17504-044
β-FGFGibcoPHG0261
β-MercaptoethanolMP Biomedicals194834
CarprofenHenry Schein11695-6934-1
D-LuciferinPerkinElmer122799
DMEDGibco11995-065
EGFGibcoPHG0311
GentamicinGibco15710072
Hitzeinaktiviertes FBSGibco16000069
InsulinGibco12585014
InsulinspritzeBD Pharmingen324704
In-vivo-Bildgebungssystem IVISPerkinElmerIVIS Lumina X5
MatrigelCorning354230
MEBM (Basalmedium für Brustepithelzellen)ATCC PCS-600-030
Mykoplasmen-TestkitABmG238
NSG-MäuseThe Jackson Laboratory5557
OVCAR3ATCCHTB-161
Penicillin/StreptomycinGibco15070063
Polyglykolsäure-NahtACE003-2480

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Metastasierungkarzinomassoziierte mesenchymale Stammzellenstromales MikromilieuPatient Derived XenograftBiolumineszenz ImagingTumormetastaseNSG M use

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