Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktionen und Identifizierung von HLA-DR-beschränkten CD4-T-Zell-Epitopen auf Basis einer Peptidmatrix

Zusammenfassung

Basierend auf einer von hepatitis-B-Virus (HBV) abgeleiteten Peptidmatrix konnten HBV-spezifische CD4-T-Zell-Reaktionen parallel zur Identifizierung von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Epitopen ausgewertet werden.

Zusammenfassung

CD4-T-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der chronischen Hepatitis B. Als vielseitige Zellpopulation wurden CD4-T-Zellen basierend auf den zytokinen, die sie sezernierten, als unterschiedliche funktionelle Untergruppen klassifiziert: zum Beispiel IFN-γ für CD4 T-Helfer-1-Zellen, IL-4 und IL-13 für CD4-T-Helfer-2-Zellen, IL-21 für CD4-T-Follikel-Helferzellen und IL-17 für CD4-T-Helfer 17-Zellen. Die Analyse von Hepatitis-B-Virus (HBV)-spezifischen CD4-T-Zellen auf der Grundlage der Zytokinsekretion nach HBV-abgeleiteter Peptidstimulation könnte nicht nur Aufschluss über das Ausmaß der HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktion geben, sondern auch über die funktionellen Untergruppen von HBV-spezifischen CD4-T-Zellen. Neuartige Ansätze wie Transkriptomik und Metabolomik-Analyse könnten detailliertere funktionelle Informationen über HBV-spezifische CD4-T-Zellen liefern. Diese Ansätze erfordern in der Regel die Isolierung lebensfähiger HBV-spezifischer CD4-T-Zellen auf der Grundlage von Peptid-Major-Histokompatibilitätskomplex-II-Multimeren, während derzeit die Informationen über HBV-spezifische CD4-T-Zell-Epitope begrenzt sind. Basierend auf einer HBV-abgeleiteten Peptidmatrix wurde eine Methode entwickelt, um HBV-spezifische CD4-T-Zell-Reaktionen zu bewerten und HBV-spezifische CD4-T-Zell-Epitope gleichzeitig unter Verwendung peripherer mononukleärer Blutzellproben von chronischen HBV-Infektionspatienten zu identifizieren.

Einleitung

Derzeit gibt es 3 Hauptansätze zur Analyse antigenspezifischer T-Zellen. Der erste Ansatz basiert auf der Interaktion zwischen dem T-Zell-Rezeptor und dem Peptid (Epitop). Antigenspezifische T-Zellen könnten direkt mit Peptid-Major-Histokompatibilitätskomplex (MHC)-Multimeren gefärbt werden. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie lebensfähige antigenspezifische T-Zellen erhalten könnte, die sich für die nachgelagerte Transkriptomik/Metabolomik-Analyse eignen. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass sie keine Informationen über die gesamte T-Zell-Reaktion auf ein bestimmtes Antigen liefern konnte, da sie validierte Epitoppeptide erfordert, während die Anzahl der identifizierten Epitope für ein bestimmtes Antigen vorerst begrenzt ist. Im Vergleich zu Hepatitis-B-Virus (HBV)-spezifischen CD8-T-Zell-Epitopen wurden weniger HBV-spezifische CD4-T-Zell-Epitope identifiziert^1,2, was diese Methode für die Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zellen derzeit weniger anwendbar macht.

Der zweite Ansatz basiert auf der Hochregulierung einer Reihe von aktivierungsinduzierten Markern nach Antigenpeptidstimulation³. Zu den häufig verwendeten Markern gehören CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB⁴. Diese Methode wurde nun verwendet, um antigenspezifische T-Zell-Reaktionen bei geimpften Personen^5,6, Human Immunodeficiency Virus Infektion Patienten⁷und Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Infektion Patienten^8,9zu analysieren. Im Gegensatz zum Peptid-MHC-Multimer-basierten Assay ist diese Methode nicht durch validierte Epitope eingeschränkt und könnte lebensfähige Zellen für die nachgelagerte Analyse erhalten. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass sie keine Informationen über das Zytokinprofil antigenspezifischer T-Zellen liefern konnte. Auch die Expression dieser aktivierungsinduzierten Marker durch einige aktivierte Antigen-unspezifische Zellen könnte zu den Hintergrundsignalen in der Analyse beitragen, was ein Problem darstellen könnte, insbesondere wenn die Zielantigen-spezifischen T-Zellen selten sind. Derzeit gibt es eine begrenzte Anwendung dieser Methode auf HBV-spezifische CD4-T-Zellen⁴. Ob diese Methode genutzt werden kann, um HBV-spezifische CD4-T-Zellen zuverlässig zu analysieren, bedarf weiterer Untersuchungen.

Der dritte Ansatz basiert auf der Zytokinsekretion nach Antigenpeptidstimulation. Wie die aktivierungsinduzierte markerbasierte Analyse ist diese Methode nicht durch validierte Epitope eingeschränkt. Diese Methode könnte das Zytokinprofil von antigenspezifischen T-Zellen direkt aufdecken. Die Sensitivität dieser Methode ist geringer als die aktivierungsinduzierte markerbasierte Methode, da sie auf der Zytokinsekretion antigenspezifischer T-Zellen beruht und die Anzahl der getesteten Zytokine in der Regel begrenzt ist. Derzeit wird diese Methode häufig in der Analyse von HBV-spezifischen T-Zellen eingesetzt. Da Zytokin-sezernierende HBV-spezifische T-Zellen durch direkte ex vivo Peptidstimulation kaum nachgewiesen werden^konnten10,¹¹, wird das Zytokinprofil von HBV-spezifischen T-Zellen in der Regel nach 10-tägiger in vitro peptidstimulierender Expansion analysiert^{12,13,14,15,16}. Die Anordnung von Peptidpools in Matrixform wurde verwendet, um die Identifizierung antigenspezifischer Epitope zu erleichtern^17,18. Mit der Kombination von Peptidmatrix und Zytokinsekretionsanalyse wurde eine Methode entwickelt, um HBV-spezifische CD4-T-Zell-Reaktionen zu bewerten und HBV-spezifische CD4-T-Zell-Epitope gleichzeitig zu identifizieren¹⁶. In diesem Protokoll werden die Details dieser Methode beschrieben. HBV-Kernantigen wird in diesem Protokoll als Beispiel für die Demonstration ausgewählt.

Protokoll

Von jedem patienten, der in die Studie eingeschlossen wurde, wurde eine schriftliche Einwilligung nach Aufklärung eingeholt. Das Studienprotokoll entspricht den ethischen Richtlinien der Deklaration von Helsinki von 1975, was sich in der a priori Genehmigung durch die medizinische Ethikkommission des Southwest Hospital widerspiegelt.

1. Design der HBV-abgeleiteten Peptidmatrix

1. Laden Sie Aminosäuresequenzen des HBV-Kernantigens aus NCBI-Datenbanken herunter (GenBank: AFY98989.1).
2. Kaufen Sie HBV-Kernantigen-abgeleitete Peptide (ein Panel von 35 15-mer-Peptiden, die sich um 10 Rückstände überlappen, Reinheit > 90%, 4 mg / Peptid) von einem Peptidsynthese-Dienstleister.
3. Richten Sie eine quadratische 6×6-Peptidmatrix ein, wobei jede Position in der Matrix nur 1 Peptid enthält. Es gibt 12 Peptidpools: 6 Reihenpeptidpools und 6 Säulenpeptidpools, 5-6 Peptide in jedem Pool^16. Die Zeilenpeptidpools und die Säulenpeptidpools in der Matrix stellen 2 separate Formationen des HBV-Kernantigens dar.
4. Für 3/4 der gekauften Peptide mischen Sie Peptide in derselben Reihe/Spalte der Matrix in 12 separate Peptidpools, indem Sie sie zusammen in Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen (2 μg/μL für jedes Peptid). Bei -80 °C für die Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktionen lagern.
5. Den Rest der Peptide separat auflösen (10 μg/μL) und bei -80 °C zur Epitopidentifikation lagern.

2. Isolierung peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs)

1. Probenahme von 5 ml venösem Blut von Patienten mit chronischer HBV-Infektion.
   HINWEIS: Das Blutvolumen sollte grob nach der Anzahl der Peptidpools plus 1 Hintergrundkontrolle und 1 Positivkontrolle geschätzt werden. Die Analyse von 1 Peptidpool benötigt 3 x 10⁵ PBMCs. Im Durchschnitt konnten 1 x^{10 6} PBMCs aus 1 ml Blut gewonnen werden.
2. Isolieren Sie PBMCs aus dem Blut mit Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation (800 × g, 20 min) und kryokonservieren Sie isolierte PBMCs in flüssigem Stickstoff für die spätere Verwendung.
3. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um Granulozyten zwischen der klaren Ficoll-Schicht und der roten Blutkörperchenschicht zu sammeln. Extrahieren Sie genomische DNA aus Granulozyten mit einem genomischen DNA-Reinigungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
4. Senden Sie die DNA-Probe an Genotypisierungsdienstleister, um den HLA-DRB1-Genotyp zu bestimmen.

3. In-vitro-Expansion von PBMCs mit einer HBV-Peptidmatrix

1. PBMCs auftauen.
   1. Warme RPMI 1640 ergänzt mit 1:10.000 Benzonase (25 U/ml) bis 37 °C im Wasserbad.
      HINWEIS: Benzonase hilft, die Zellklumpung während des Auftauens zu begrenzen. Jede Probe benötigt 20 ml RPMI 1640 mit Benzonase. Berechnen Sie die Menge, die zum Auftauen aller Proben benötigt wird, und bereiten Sie ein separates Aliquot von Medien (37 °C) mit 1:10.000 Benzonase (25 U / ml) vor. Tauen Sie nicht mehr als 5 Proben gleichzeitig auf.
   2. Proben aus flüssigem Stickstoff entnehmen und gefrorene Fläschchen in einem Wasserbad (37 °C) schnell auftauen.
   3. Die aufgetaute Zellsuspension in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen überführen. 1 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) tropfenweise in das Röhrchen geben. Langsam 6 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) in das Zentrifugenröhrchen geben, Kryovial mit weiteren 2 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) abspülen, um alle Zellen abzurufen. Fahren Sie so schnell wie möglich mit den restlichen Proben fort.
      HINWEIS: Die langsame Verdünnung von kryokonservierten Proben ist der Schlüssel zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit aufgetauter Zellen.
   4. Zentrifuge (400 × g, 10 min), entfernen Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet durch Klopfen des Rohres.
   5. Das Pellet vorsichtig in 1 ml warmer Benzonase RPMI 1640 wieder aufkehren. Mischen Sie vorsichtig und filtern Sie die Zellen bei Bedarf durch ein 70 μm-Zellsieb (d. H. Wenn ein sichtbarer Klumpen vorhanden ist).
   6. Aliquotieren Sie eine 10 μL-Suspension und verdünnen Sie sie in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS), fügen Sie Trypanblau (0,04%) hinzu, laden Sie es auf ein Hämozytometer, warten Sie 1 Minute und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen (klare Zellen).
   7. 9 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) in das Röhrchen geben, zentrifugieren (400 × g, 10 min), den Überstand entfernen und das Pellet durch Klopfen des Röhrchens lösen.
2. Resuspend PBMCs in RPMI 1640 ergänzt mit 25 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 10% humanem AB-Serum (vollständiges Kulturmedium). Passen Sie die Zelldichte auf 1,5 x 10⁶ Zellen/ml an. Platten-PBMCs in 96-Well-Platten (flacher Boden) mit einer Dichte von 3 x 10⁵ Zellen/Well.
3. Fügen Sie HBV-abgeleitete Peptidpools (2 μg / ml für jedes einzelne Peptid) zu jeder Vertiefung hinzu. Für Vertiefungen der Hintergrundkontrolle und Positivkontrolle fügen Sie die gleiche Menge Lösungsmittel (DMSO, 1 μL / ml) hinzu. Fügen Sie 10 U/ml IL-2 und 10 ng/ml IL-7 hinzu. Bei 37 °C und 5% CO_{2 inkubieren.}
4. Ergänzen Sie an Tag 3 das Kulturmedium mit 50 U/ml IL-2 und 10 ng/ml IL-7.
   HINWEIS: Von Tag 1 bis Tag 3 wird keine offensichtliche T-Zell-Proliferation beobachtet. Die Gesamtzellzahl nimmt normalerweise um 1/3 bis 1/2 ab, da Nicht-T-Zellen wie B-Zellen, NK-Zellen, NKT-Zellen und Monozyten abstreichen.
5. Ersetzen Sie an Tag 7 die Hälfte des Kulturmediums durch frisches Medium, das Peptide (4 μg/ml), IL-2 (100 U/ml) und IL-7 (20 ng/ml) enthält.
   HINWEIS: Um eine Störung der Zellen an der Unterseite zu vermeiden, pipetetten Sie etwa 90 μL Kulturmedium vorsichtig von der Oberseite des Mediums. Während Tag 3 bis Tag 7 wird eine robuste T-Zellproliferation beobachtet, und proliferierende T-Zellen aggregieren sich normalerweise zu Clustern.
6. Am Tag 10 die Zellkultur in jeder Vertiefung 7-9 Mal vorsichtig pipetten, um Zellcluster zu disaggregieren, die Anzahl der lebensfähigen Zellen zu zählen und 2×10⁵ Zellen in jeder Vertiefung auf eine 96-Well-Platte (runder Boden) für die HBV-spezifische CD4-T-Zell-Antwortanalyse zu übertragen.
7. Setzen Sie die Kultivierung der übrigen Zellen zur Epitopidentifizierung am Tag 12 fort, stellen Sie das Volumen des Kulturmediums auf 100 μL ein (verwerfen Sie übermäßiges Medium) und ergänzen Sie die Kultur mit 100 μL frischem vollständigem Kulturmedium, das Peptide (4 μg / ml), IL-2 (100 U / ml) und IL-7 (20 ng / ml) enthält.
   HINWEIS: Während Tag 7 bis Tag 10 vermehren sich die T-Zellen weiterhin kräftig. Ersetzen Sie das Kulturmedium wie in Schritt 3.5, wenn das Medium gelb wird. Im Allgemeinen überschreitet die Zellzahl 6×10⁵ am Tag 10. Jede Vertiefung zeigt normalerweise eine ähnliche Zellzahl, zählt die Zellzahl in 3 Vertiefungen und verwendet den Durchschnittswert als Schätzung der Zellzahl für alle Vertiefungen.

4. Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktionen mittels intrazellulärer Durchflusszytometrie

1. Stimulierung von PBMCs mit Peptidpools
   1. Für die auf die 96-Well-Platte (runder Boden) übertragenen Zellen 3 mal in einer Platte waschen (550 × g, 3 min). Verwenden Sie 200 μL Medium für jede Wäsche (RPMI 1640 für die ersten 2 Waschgänge, vollständiges Kulturmedium für die letzte Wäsche). Verwerfen Sie die Überstände.
      HINWEIS: Die Entfernung von Restzytokinen in der Kultur durch wiederholtes Waschen könnte den Hintergrund in der intrazellulären Durchflusszytometrie-Analyse effektiv verringern.
   2. Fügen Sie für jede Zellbohrung, die mit einem spezifischen Peptidpool stimuliert wird, 200 μL vollständiges Kulturmedium hinzu, das mit den gleichen Peptidpools ergänzt wird (2 μg / ml für jedes einzelne Peptid). Für die Hintergrundkontrolle fügen Sie ein komplettes Kulturmedium hinzu, das mit 1 μL / ml DMSO ergänzt wird. Für die Positivkontrolle fügen Sie ein komplettes Kulturmedium hinzu, das mit 1 μL / ml DMSO, 150 ng / ml Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) und 1 μmol / L Ionomycin ergänzt wird.
      HINWEIS: Eine hohe Dosis DMSO blockiert die Zytokinsekretion von T-Zellen (am wichtigsten für TNF-α). Eine Dosis von DMSO über 5 μL/ml wird nicht empfohlen. Im Allgemeinen überschreitet die Dosis von DMSO in unserem Experiment 1 μL / ml nicht.
   3. Bei 37 °C und 5% CO 2 für₆ h inkubieren.
   4. Nach 1 h Inkubation Wird Monensin (1,37 μg/ml) in die Kultur geben.
2. Durchflusszytometrie
   1. Nach 6 h Inkubation. Überstand nach Zentrifugation (550 × g, 3 min), Waschen sie die Zellen einmal mit 200 μL DPBS (550 × g, 3 min), Fleckenoberflächenmarkern (CD3, CD4 und CD8) und Lebensfähigkeitsmarker (mit Fixable Viability Dye) in einem 4 °C Kühlschrank für 30 min.
   2. Einmal mit 200 μL DPBS (550 × g, 3 min) waschen. Fixieren und permeabilisieren Sie Zellen und färben Sie intrazelluläre Zytokine (TNF-α und IFN-γ) in einem 4 °C Kühlschrank für 45 min.
   3. Nach der abschließenden Wäsche in der intrazellulären Färbung werden die Zellen in 150 μL Durchflusszytometriepuffer (DPBS + 0,5% BSA) resuspendiert.
   4. Erfassen Sie Durchflusszytometriedaten auf einem Durchflusszytometer.
3. Analyse der Ergebnisse der Durchflusszytometrie
   1. Definition des positiven Brunnens: Betrachten Sie einen Brunnen als positiv, wenn er eine Häufigkeit von Zytokin-sezernierenden T-Zellen mindestens das Zweifache der Hintergrundkontrollbohrung aufwies (Abbildung 1).
   2. Berechnen Sie nach der folgenden Formel die Ansprechrate für jedes analysierte Zytokin (Abbildung 2):
      
      HINWEIS: Der Zeilenpeptidpool und die Säulenpeptidpools in der Matrix repräsentieren 2 verschiedene Formationen des HBV-Kernantigens, daher sollte die endgültige Ansprechrate durch 2 geteilt werden.

5. Identifizierung von HBV-spezifischen HLA-DR-beschränkten CD4-T-Zell-Epitopen

1. Auftauen und Pflegen allogener B-lymphoblastoider Zelllinien (BLCLs) im T-75-Kolben (5-20 ×10⁶ Zellen, 20 ml vollständiges Kulturmedium).
   HINWEIS: Um den guten Zustand der BLCLs zu gewährleisten, sollte dieser Schritt 2 Wochen vor dem Auftauen der PBMCs der Patienten eingeleitet werden. BLCLs müssen im HLA-DRB1-Allel homozygot sein. Gemäß dem Genotypisierungsergebnis sollten patienten das gleiche HLA-DRB1-Allel wie BLCLs teilen.
2. Screening von Kandidatenpeptiden zur Identifizierung (Abbildung 3)
   1. Gemäß den Ergebnissen der T-Zell-Antwortrate am Tag 10 sollten 2 Peptidpools mit der höchsten Ansprechrate (1-Reihen-Peptidpool und 1-Säulen-Peptidpool) untersucht werden.
   2. Setzen Sie das Peptid in diesen 2 Pools als Kandidatenpeptid, wenn der andere Peptidpool, der dieses Peptid enthält, auch ein positives Ergebnis in der T-Zell-Antwortanalyse zeigt. Verwenden Sie die PBMCs, die mit dem anderen Peptidpool erweitert wurden, um später Epitope zu identifizieren.
3. Pulsierende BLCLs mit Peptid
   1. Zählen Sie an Tag 12 die Anzahl der lebensfähigen BLCLs, übertragen Sie die Zellen auf 15 ml Zentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie (350 × g, 10 min) und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in vollständigem Kulturmedium und aliquot BLCLs auf eine 96-Well-Platte (runder Boden) bei 4×10⁴ Zellen/Vertiefung in 80 μL vollständigem Kulturmedium.
   2. Ein einzelnes Peptid (10 μg/ml) hinzufügen, bei 37 °C und 5% CO₂ für 2 h inkubieren. Set 2 Hintergrundkontrolle: Peptidpulsing mit HLA-DR-Blockierung (Vorbehandlung mit Anti-HLA-DR (10 μg/ml) für 1 h); DMSO (1 μL/ml) pulsierend. Das Endvolumen des vollständigen Kulturmediums in jeder Vertiefung beträgt 100 μL.
   3. Mitomycin C (100 μg/ml) hinzufügen, bei 37 °C und 5% CO₂ für 1 h inkubieren.
   4. 3 mal mit 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) in einer Platte waschen, um ungepulstes Peptid und Mitomycin C zu entfernen. Für die erste Wäsche die Inkubationskultur mit 100 μL RPMI 1640 ergänzen.
   5. Resuspend Zellen in 120 μL vollständigem Kulturmedium.
4. Stimulation von PBMCs mit peptidgepulsten BLCLs.
   1. An Tag 12 PBMCs auf eine 96-Well-Platte (runder Boden) übertragen.
   2. Den Überstand nach der Zentrifugation (550 × g, 3 min) in einer Platte entfernen, zweimal mit 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) in einer Platte waschen.
      HINWEIS: Die Entfernung von Restzytokinen und Peptiden in der Kultur durch wiederholtes Waschen ist der Schlüsselschritt, um den Hintergrund in der intrazellulären Durchflusszytometrie-Analyse zu verringern. Besonders bei Restpeptiden bindet es an BLCLs und erhöht den Hintergrund deutlich.
   3. Resuspend PBMCs an jeder Vertiefung mit 210 μL vollständigem Kulturmedium.
   4. Für den Brunnen von PBMCs, die für die Epitopidentifikation ausgewählt wurden, mischen Sie das Aliquot (jeweils 70 μL) mit peptidgepulsten BLCLs (3 Vertiefungen, einschließlich 2 Hintergrundkontrollen).
      HINWEIS: An Tag 12 erreicht die Anzahl der expandierten PBMCs in Peptidpools normalerweise über 5-7×10⁵ pro Vertiefung, so dass das Verhältnis von PBMCs / BLCLs etwa 6/1 zu 4/1 beträgt.
   5. Bei 37 °C und 5% CO 2 für₆ h inkubieren.
   6. Nach 1 h Inkubation Wird Monensin (1,37 μg/ml) in die Kultur geben. Das endende Volumen des vollständigen Kulturmediums in jeder Vertiefung beträgt 200 μL.
5. Durchflusszytometrie
   1. Wiederholen Sie die gleichen Vorgänge wie in Schritt 4.2.
6. Analyse der Ergebnisse der Durchflusszytometrie
   1. Überprüfung eines Peptids als HLA-DR-beschränktes CD4-T-Zell-Epitop, wenn PBMCs, die mit diesem Peptid gepulst wurden, gepulste BLCLs eine Häufigkeit von Zytokin-sezernierenden CD4-T-Zellen zeigen, die mindestens das Zweifache der pbMCs aufweisen, die mit Hintergrundkontrollen inkubiert wurden (Peptidpulsing mit HLA-DR-Vorblockierung; DMSO pulsierend) (Abbildung 4).

Ergebnisse

Die Häufigkeit der Zytokin-sezernierenden CD4-T-Zellen wird als Summe von Einzelproduzenten und Doppelproduzenten berechnet. Wie in Abbildung 1gezeigt, betragen die Häufigkeit von TNF-α sezernierenden CD4-T-Zellen und die Häufigkeit von IFN-γ sezernierenden CD4-T-Zellen in der Hintergrundkontrolle (DMSO) 0,154% bzw. 0,013%. Die Häufigkeit der TNF-α sezernierenden CD4-T-Zellen und die Häufigkeit der IFN-γ sezernierenden CD4-T-Zellen, die für den Peptidpool Core11 spezifisch sind, betragen 0,2...

Diskussion

Die kritischsten Schritte in diesem Protokoll sind wie folgt aufgeführt: 1) genügend PBMCs mit hoher Lebensfähigkeit, um die PBMCs-Expansion zu starten; 2) geeignete Umgebung für die Erweiterung von PBMCs; und 3) vollständige Entfernung von restenPtidpools in PBMCs-Kultur vor der Epitopidentifizierung.

Die gesamte Analyse in diesem Protokoll hängt von der robusten Proliferation von CD4-T-Zellen ab. Im Allgemeinen ist die Anzahl der PBMCs nach 10-tägiger Erweiterung das 2-3-fache der ursprüngli...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Albumin Bovine V (BSA)	Beyotime	ST023
APC-konjugiertes Anti-humanes TNF-α	eBioscience	17-7349-82	Vor Licht geschützt
aufbewahren Benzonase-Nuklease	Sigma-Aldrich	E1014	Begrenzung der Zellverklumpung
von B-lymphoblastoiden Zelllinien (BLCLs)	FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER		HLA-DRB1*0803 homozygote
B-lymphoblastoide Zelllinien (BLCLs)	FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER		HLA-DRB1*1202 homozygot
Zellkulturflasche (T75)	Corning	430641
Zellkulturplatte (96 Well, flacher Boden)	Corning	3599	Zellkulturplatte mit flachem Boden
(96 Well, runder Boden)	Corning	3799	mit rundem Boden
	Corning	CLS431751	Porengröße 70 μ m, weiß, steril
Zentrifugenröhrchen (15 mL)	KIRGEN	KG2611	Steriles
Zentrifugenröhrchen (50 mL)	Corning	430829	Sterile
Zentrifuge, gekühlt	Eppendorf	5804R
Zentrifuge,	gekühlt Thermo	ST16R
Zentrifuge,	gekühlt Thermo	Legend Micro 21R
Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set)	BD Biosciences	562574	Lösung vor Gebrauch vorbereiten
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Raumtemperatur aufbewahren, um eine Kristallisation zu verhindern
Dulbecco' s Phosphatgepuffertes			Kochsalzpräparat ddH2O (1000 ml) mit NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg) und Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Stellen Sie den PH-Wert auf 7,4 ein. Sterilisieren Sie durch den Autoklaven.
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-03
Filterspitzen (0,5-10)	Kirgen	KG5131	Sterile
Filterspitzen (100-1000)	Kirgen	KG5333	Sterile
Filterspitzen (1-200)	Kirgen	KG5233	Sterile
FITC-konjugierte Anti-Human-CD4	BioLegend 300506		Vor Licht geschützt
Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor780	eBioscience	65-0865-14	Vor Licht schützen
GolgiStop Proteintransportinhibitor (enthält Monensin)	BD Biosciences	554724	Proteintransportinhibitor
Hämozytometer	Marke	718620
HBV-Kernantigen abgeleitete Peptide	ChinaPeptide
HEPES	Gibco	15630080	100 ml
Humanserum AB	Gemini Bio-Products	100-51	100 ml
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634
KCl	Sangon Biotech	A100395-0500
KH2PO4	Sangon Biotech	A100781-0500
LSRFortessa Durchflusszytometer	BD
L-Glutamin	Gibco	25030081	100 ml
Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL)	Corning	MCT-150-C	Autoklaviersterilisation vor der Verwendung
Mikrotiterplattenschüttler	Scientific Industries	MicroPlate Genie
Mitomycin C	Roche	10107409001
Na2HPO4.7H2O	Sangon Biotech	A100348-0500
NaCl	Sangon Biotech	A100241-0500
PCR-Röhrchen (0,2 mL)	Kirgen	KG2331
PE/Cy7-konjugiert Anti-Human-CD8	BioLegend	300914	Vor Licht geschützt
PE-konjugiert Anti-Human-IFN-& Gamma;	eBioscience	12-7319-42	Vor Licht geschützt
halten Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122	100 ml
PerCP-Cy5.5-konjugiert Anti-Human-CD3	eBioscience	45-0037-42	Vor Licht geschützt
halten Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA)	Sigma-Aldrich	P1585
Rekombinant humanes IL-2	PeproTech	200-02
Rekombinantes humanes IL-7	PeproTech	200-07
RPMI Medium 1640	Gibco	C11875500BT	500 ml
Natriumpyruvat, 100 mM	Gibco	15360070
Trypanblauer Farbstoff (0,4 %)	Gibco	15250-061
Ultra-LEAF gereinigtes Anti-Human-HLA-DR	BioLegend	307648
Wizard Genomische DNA Aufreinigungsset	Promega	A1125