Basierend auf einer von hepatitis-B-Virus (HBV) abgeleiteten Peptidmatrix konnten HBV-spezifische CD4-T-Zell-Reaktionen parallel zur Identifizierung von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Epitopen ausgewertet werden.
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Methodenartikel
Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktionen und Identifizierung von HLA-DR-beschränkten CD4-T-Zell-Epitopen auf Basis einer Peptidmatrix
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
CD4-T-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der chronischen Hepatitis B. Als vielseitige Zellpopulation wurden CD4-T-Zellen basierend auf den zytokinen, die sie sezernierten, als unterschiedliche funktionelle Untergruppen klassifiziert: zum Beispiel IFN-γ für CD4 T-Helfer-1-Zellen, IL-4 und IL-13 für CD4-T-Helfer-2-Zellen, IL-21 für CD4-T-Follikel-Helferzellen und IL-17 für CD4-T-Helfer 17-Zellen. Die Analyse von Hepatitis-B-Virus (HBV)-spezifischen CD4-T-Zellen auf der Grundlage der Zytokinsekretion nach HBV-abgeleiteter Peptidstimulation könnte nicht nur Aufschluss über das Ausmaß der HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktion geben, sondern auch über die funktionellen Untergruppen von HBV-spezifischen CD4-T-Zellen. Neuartige Ansätze wie Transkriptomik und Metabolomik-Analyse könnten detailliertere funktionelle Informationen über HBV-spezifische CD4-T-Zellen liefern. Diese Ansätze erfordern in der Regel die Isolierung lebensfähiger HBV-spezifischer CD4-T-Zellen auf der Grundlage von Peptid-Major-Histokompatibilitätskomplex-II-Multimeren, während derzeit die Informationen über HBV-spezifische CD4-T-Zell-Epitope begrenzt sind. Basierend auf einer HBV-abgeleiteten Peptidmatrix wurde eine Methode entwickelt, um HBV-spezifische CD4-T-Zell-Reaktionen zu bewerten und HBV-spezifische CD4-T-Zell-Epitope gleichzeitig unter Verwendung peripherer mononukleärer Blutzellproben von chronischen HBV-Infektionspatienten zu identifizieren.
Einleitung
Derzeit gibt es 3 Hauptansätze zur Analyse antigenspezifischer T-Zellen. Der erste Ansatz basiert auf der Interaktion zwischen dem T-Zell-Rezeptor und dem Peptid (Epitop). Antigenspezifische T-Zellen könnten direkt mit Peptid-Major-Histokompatibilitätskomplex (MHC)-Multimeren gefärbt werden. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie lebensfähige antigenspezifische T-Zellen erhalten könnte, die sich für die nachgelagerte Transkriptomik/Metabolomik-Analyse eignen. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass sie keine Informationen über die gesamte T-Zell-Reaktion auf ein bestimmtes Antigen liefern konnte, da sie validierte Epitoppeptide erfordert, wäh....
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Protokoll
Von jedem patienten, der in die Studie eingeschlossen wurde, wurde eine schriftliche Einwilligung nach Aufklärung eingeholt. Das Studienprotokoll entspricht den ethischen Richtlinien der Deklaration von Helsinki von 1975, was sich in der a priori Genehmigung durch die medizinische Ethikkommission des Southwest Hospital widerspiegelt.
1. Design der HBV-abgeleiteten Peptidmatrix
- Laden Sie Aminosäuresequenzen des HBV-Kernantigens aus NCBI-Datenbanken herunter (GenBank: AFY98989.1).
- Kaufen Sie HBV-Kernantigen-abgeleitete Peptide (ein Panel von 35 15-mer-Peptiden, die sich um 10 Rückstände überlappen, Reinheit > 90%, 4 mg / P....
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Ergebnisse
Die Häufigkeit der Zytokin-sezernierenden CD4-T-Zellen wird als Summe von Einzelproduzenten und Doppelproduzenten berechnet. Wie in Abbildung 1gezeigt, betragen die Häufigkeit von TNF-α sezernierenden CD4-T-Zellen und die Häufigkeit von IFN-γ sezernierenden CD4-T-Zellen in der Hintergrundkontrolle (DMSO) 0,154% bzw. 0,013%. Die Häufigkeit der TNF-α sezernierenden CD4-T-Zellen und die Häufigkeit der IFN-γ sezernierenden CD4-T-Zellen, die für den Peptidpool Core11 spezifisch sind, betragen 0,2.......
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Diskussion
Die kritischsten Schritte in diesem Protokoll sind wie folgt aufgeführt: 1) genügend PBMCs mit hoher Lebensfähigkeit, um die PBMCs-Expansion zu starten; 2) geeignete Umgebung für die Erweiterung von PBMCs; und 3) vollständige Entfernung von restenPtidpools in PBMCs-Kultur vor der Epitopidentifizierung.
Die gesamte Analyse in diesem Protokoll hängt von der robusten Proliferation von CD4-T-Zellen ab. Im Allgemeinen ist die Anzahl der PBMCs nach 10-tägiger Erweiterung das 2-3-fache der ursprüngli.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81930061), der Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) und Chinese Key unterstützt.
Projekt spezialisiert auf Infektionskrankheiten (2018ZX10723203).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-konjugiertes Anti-humanes TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Vor Licht geschützt |
| aufbewahren Benzonase-Nuklease | Sigma-Aldrich | E1014 | Begrenzung der Zellverklumpung |
| von B-lymphoblastoiden Zelllinien (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | HLA-DRB1*0803 homozygote | |
| B-lymphoblastoide Zelllinien (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | HLA-DRB1*1202 homozygot | |
| Zellkulturflasche (T75) | Corning | 430641 | |
| Zellkulturplatte (96 Well, flacher Boden) | Corning | 3599 | Zellkulturplatte mit flachem Boden |
| (96 Well, runder Boden) | Corning | 3799 | mit rundem Boden |
| Corning | CLS431751 | Porengröße 70 μ m, weiß, steril | |
| Zentrifugenröhrchen (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Steriles |
| Zentrifugenröhrchen (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Zentrifuge, gekühlt | Eppendorf | 5804R | |
| Zentrifuge, | gekühlt Thermo | ST16R | |
| Zentrifuge, | gekühlt Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Lösung vor Gebrauch vorbereiten |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Raumtemperatur aufbewahren, um eine Kristallisation zu verhindern |
| Dulbecco' s Phosphatgepuffertes | Kochsalzpräparat ddH2O (1000 ml) mit NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg) und Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Stellen Sie den PH-Wert auf 7,4 ein. Sterilisieren Sie durch den Autoklaven. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filterspitzen (0,5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filterspitzen (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filterspitzen (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-konjugierte Anti-Human-CD4 | BioLegend 300506 | Vor Licht geschützt | |
| Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Vor Licht schützen |
| GolgiStop Proteintransportinhibitor (enthält Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Proteintransportinhibitor |
| Hämozytometer | Marke | 718620 | |
| HBV-Kernantigen abgeleitete Peptide | ChinaPeptide | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Humanserum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Durchflusszytometer | BD | ||
| L-Glutamin | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoklaviersterilisation vor der Verwendung |
| Mikrotiterplattenschüttler | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR-Röhrchen (0,2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-konjugiert Anti-Human-CD8 | BioLegend | 300914 | Vor Licht geschützt |
| PE-konjugiert Anti-Human-IFN-& Gamma; | eBioscience | 12-7319-42 | Vor Licht geschützt |
| halten Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-konjugiert Anti-Human-CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Vor Licht geschützt |
| halten Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Rekombinant humanes IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Rekombinantes humanes IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Natriumpyruvat, 100 mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypanblauer Farbstoff (0,4 %) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF gereinigtes Anti-Human-HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomische DNA Aufreinigungsset | Promega | A1125 |
Referenzen
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
