Methodenartikel

Loss-of-Function-Ansatz in der embryonalen Küken-Netzhaut unter Verwendung von Tol2-Transposon-vermittelter transgener Expression künstlicher microRNAs

DOI:

10.3791/62399

⸱

18. Mai 2022

 , 
1Department of Biology, Valparaiso University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir haben einen neuartigen Loss-of-Function-Ansatz entwickelt, der die Einführung und genomische Integration künstlicher Mikro-RNA-Sequenzen in Kükenembryonen unter Verwendung der In-ovo-Elektroporation und des Tol2-Transposon-Systems beinhaltet. Diese Technik bietet eine robuste und stabile Gen-Knockdown-Methode für Studien der Genfunktion während der Entwicklung.

Zusammenfassung

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Die Netzhaut von Küken ist seit langem ein wichtiges Modellsystem in der Entwicklungsneurobiologie, mit Vorteilen wie ihrer Größe, ihrer schnellen Entwicklung und ihrer Zugänglichkeit für Visualisierungen und experimentelle Manipulationen. Seine größte technische Einschränkung war jedoch das Fehlen robuster Loss-of-Function-Ansätze für Genfunktionsanalysen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode des Gen-Silencings in der sich entwickelnden Netzhaut von Küken, die die transgene Expression künstlicher microRNAs (miRNAs) unter Verwendung des Tol2-Transposon-Systems beinhaltet. Bei diesem Ansatz wird ein Tol2-Transposon-Plasmid, das eine Expressionskassette für den EmGFP-Marker (smaragdgrün fluoreszierendes Protein) und künstliche prä-miRNA-Sequenzen gegen ein Zielgen enthält, mit einem Tol2-Transposase-Expressionskonstrukt durch In-ovo-Elektroporation in die embryonale Kükennetzhaut eingeführt. In den transfizierten Netzhautzellen katalysiert die Transposase die Exzision der Expressionskassette aus dem Transposon-Vektor und deren Integration in die Wirtschromosomen, was zu einer stabilen Expression von miRNAs und des EmGFP-Proteins führt. In unserer früheren Studie haben wir gezeigt, dass die Expression von Nel, einem Glykoprotein, das mehrere Funktionen in der neuronalen Entwicklung ausübt, durch diese Technik in der sich entwickelnden Netzhaut von Küken signifikant unterdrückt werden kann. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Methodik eine stabile und robuste Unterdrückung der Genexpression induziert und somit einen effizienten Loss-of-Function-Ansatz für Studien zur Netzhautentwicklung bietet.

Einleitung

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Die Netzhaut von Wirbeltieren ist ein wichtiges Modellsystem für die Erforschung der neuronalen Entwicklung. Trotz ihrer peripheren Lage ist die Netzhaut anatomisch und entwicklungsbedingt eine Erweiterung des zentralen Nervensystems, und der Sehnerv, der aus Axonen retinaler Ganglienzellen besteht, stellt einen Trakt innerhalb des zentralen Nervensystems dar. Die Netzhaut von Küken hat als Modellsystem zur Untersuchung des molekularen Mechanismus der neuronalen Entwicklung erhebliche Vorteile: Sie ist groß und entwickelt sich schnell; Es hat strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten mit der menschlichen Netzhaut; Es ist für Visualisierungen und experimentelle Manip....

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Protokoll

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1. Konstruktion von miRNA-Expressionsvektoren

ANMERKUNG: Die Verfahren zur Konstruktion von miRNA-Expressionsvektoren (Schritte 1.1-1.3, 1.5-1.6.) sind für das miRNA-Expressionskit Block-iT Pol II miR RNA-Expressionskit mit EmGFP optimiert, wie zuvorbeschrieben 15,16. Das Kit enthält den Expressionsvektor, der die miRNA-Expression ermöglicht (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), einen Kontrollvektor (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatives Kontrollplasmid), akzessorische Reagenzien und Anweisungen zur Herstellung von miRNA-Expressionsvektoren (siehe Materialtabelle

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Ergebnisse

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Aufbau von Tol2-Transposon-Konstrukten zur Expression künstlicher miRNAs gegen Nel
Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; auch bekannt als Nell2) ist ein extrazelluläres Glykoprotein. Es weist strukturelle Ähnlichkeiten mit Thrombospondin-1 auf und wird überwiegend im Nervensystem exprimiert20,21. Wir haben bereits gezeigt, dass Nel die Differenzierung und das Überleben von retinalen Ganglienzellen

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Diskussion

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Dieses Protokoll bietet einen detaillierten Leitfaden für das Gen-Silencing in der sich entwickelnden Netzhaut von Küken durch transgene Expression künstlicher miRNAs unter Verwendung der In-Ovo-Elektroporation und des Tol2-Transposon-Systems.

Die folgenden Faktoren sind für die erfolgreiche Durchführung dieser Technik von entscheidender Bedeutung. Erstens ist es wichtig, miRNA-Sequenzen zu verwenden, von denen bestätigt wurde, dass sie robuste Knockdown-Effekte ausüben. Bevor Sie sie.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Die pT2K-CAGGS- und pCAGGS-T2TP-Vektoren wurden freundlicherweise von Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Kyoto, Japan) bzw. Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Mishima, Japan) zur Verfügung gestellt. Wir danken Michael Berberoglu für die entscheidende Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Royal Society und des Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (UK) an M.N.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
18 G Nadel, 2"VWR89219-320
AP-TAG Kit A und AP-TAG Kit BGenHunter CorpQ201 und Q202Plasmidvektoren zur Herstellung von AP-Fusionsproteinen (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)
Block-iT RNAi DesignerInvitrogenEin Online-Tool zur Auswahl von Zielsequenzen und zum Design von prä-miRNA-Sequenzen (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)
BSA 10 mgSigma-AldrichA2153
C115CB KabelSonidelC115CBhttps://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254
C117 KabelSonidelC117https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252
Kapillarröhrchen mit Omega-Punktfaser (Mikropipettennadeln)FHC30-30-11 mm Außendurchmesser 0,75 mm Innendurchmesser
CUY21 Rechteck-ElektroporatorNepa GeneCUY21
Diethanolamin (pH 9,8)Sigma-AldrichD8885
Präpariermikroskop
Ei InkubatorKurlB-Lab-600-110https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html
ElektrodenhalterSonidelCUY580https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85
ElektrodenNepa GeneCUY611P3-1https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94
Electromax DH10BInvitrogen18290-015Elektrokompetente E. coli-Zellen
Fast greenFCF Sigma-AldrichF7258
Befruchtete Hühnereier (Gallus gallus)Bezogen von kommerziellen Anbietern (z.B. Charles River) oder lokalen Landwirten
Schwanenhalsfaser-Lichtquelle
FuGene 6 TransfektionsreagenzPromegaE2691
Hamilton-Spritze (50 μ L)Sigma-Aldrich20715Hamilton Cat No  80901
Hanks' ausgewogene SalzlösungSigma-AldrichH6648
Schweres MineralölSigma-Aldrich330760
HEPESGIBCO15630080
L-HomoargininSigma-AldrichH10007
MgCl2Sigma-Aldrich13112
MikromanipulatorNarishige (Japan)MM3http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html
MikropipettenabzieherShutter InstrumentP97
p-NitrophenylphosphatSigma-Aldrich20-106
PBSSigma-AldrichD8662
pCAGGS-T2TP VektorTol2-Transposase-Expressionsplasmid. Ein großzügiges freundliches Geschenk von Koichi Kawakami (Nationales Institut für Genetik, Japan). Auch bei Addgene erhältlich.
PfuThermoFisherF566S
Picospritzer (optional)ParkerDruck-Mikroinjektionssystem
Plasmid maxi kitQiagen12163Plasmid maxiprep kit
pT2K-CAGGS VektorTol2 Transposon Vektor. Mit freundlicher Verfügung von Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)
PVC-SchlauchVWR (UK)228-3830
SpectinomycinSigma-AldrichS9007-5
T4 DNA-LigasePromegaM1801
Das BLOCK-iT Pol II miR RNA-Expressionskit mit EmGFPInvitrogenK493600Enthält den miRNA-Expressionsvektor (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), einen Kontrollvektor (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatives Kontrollplasmid), Zubehörreagenzien und Anweisungen (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00
)Thermocycler

Referenzen

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  1. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
  2. Funahashi, J., et al.

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Schlagwörter

In Ovo ElectroporationGene SilencingRetinal DevelopmentMicroRNA KnockdownRetinal Ganglion CellsCell Differentiation

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