Methodenartikel

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mäuse mit einem Miniaturschnitt

DOI:

10.3791/62402

⸱

13. Mai 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical Faculty Manheim, Heidelberg University, 2European Center of Angioscience ECAS, Medical Faculty Manheim, Heidelberg University, 3Computer-Assisted Clinical Medicine, Mannheim Institute for Intelligent Systems in Medicine, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Cooperative Core Facility Animal Scanner ZI, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel zeigt einen effizienten chirurgischen Ansatz zur Feststellung einer akuten Ischämie bei Mäusen mit einem kleinen Schnitt. Dieser Ansatz kann von den meisten Forschungsgruppen ohne Labor-Upgrades angewendet werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ziel dieser Studie ist es, einen modifizierten chirurgischen Ansatz zur Induktion einer akuten Ischämie bei Mäusen einzuführen und zu bewerten, der in den meisten Tierlabors eingesetzt werden kann. Im Gegensatz zum herkömmlichen Ansatz für die Doppelligatur der Oberschenkelarterie (DLFA) wurde ein kleinerer Schnitt an der rechten Leistenregion vorgenommen, um die proximale Oberschenkelarterie (FA) für die Durchführung von DLFA freizusetzen. Dann wurde der Schnitt mit einer 7-0-Naht in die Knieregion gezogen, um den distalen FA freizulegen. Magnetresonanztomographie (MRT) an bilateralen Hintergliedmaßen wurde verwendet, um FA-Okklusion nach der Operation zu erkennen. 0, 1, 3, 5 und 7 Tage nach der Operation wurde die funktionelle Erholung der Hintergliedmaßen visuell beurteilt und mit der Tarlov-Skala bewertet. Die histologische Untersuchung wurde nach der Einschläferung der Tiere 7 Tage nach DLFA durchgeführt. Die Eingriffe wurden bei zehnApoE-/- Mäusen erfolgreich am rechten Bein durchgeführt, und bei der anschließenden Beobachtung starben keine Mäuse. Die Schnittgrößen bei allen 10 Mäusen betrugen weniger als 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). MRT-Ergebnisse zeigten, dass der FA-Blutfluss auf der ischämischen Seite deutlich blockiert war. Die Ergebnisse der Tarlov-Skala zeigten, dass die Hintergliedmaßenfunktion nach dem Eingriff signifikant abnahm und sich in den folgenden 7 Tagen langsam erholte. Die histologische Untersuchung zeigte eine signifikante Entzündungsreaktion auf der ischämischen Seite und eine reduzierte mikrovaskuläre Dichte in der ischämischen Hintergliedmaße. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie eine modifizierte Technik mit einem Miniaturschnitt einführt, um eine Hintergliedmaßenischämie (HLI) unter Verwendung von DLFA durchzuführen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es besteht ein ungedeckter Bedarf an präklinischen Tiermodellen für die Erforschung von Gefäßerkrankungen wie der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (PAVK). Trotz der fortgeschrittenen Entwicklungen in Diagnose und Behandlung gab es im Jahr 2018 mehr als 200 Millionen Patienten mit PAD1, und ihre Zahl steigt ständig. Obwohl mehrere neuartige Therapieansätze2,3,4,5,6,7 beschrieben wurden, bleibt die erfolgreiche Translation dieser therapeutischen Modalitäten in die klinische Anwendung eine gewaltige Aufgabe. Daher sind zuverlässige und relevante experimentelle In-vivo-Modelle erforderlich, die den menschlichen Krankheitszustand simulieren, um den potenziellen Mechanismus und die Effizienz dieser neuen therapeutischen Ansätze zur Behandlung von PAD6zu untersuchen,7.

Hyperlipidämie und Atherosklerose (AS) sind die Hauptrisikofaktoren für die Entwicklung von PAD. ApoE-/- Mäuse (auf einer fettreichen Diät) zeigen einen abnormalen Fettstoffwechsel und Hyperlipidämie und entwickeln anschließend atherosklerotische Plaques, was ApoE-/- Mäuse zur besten Wahl macht, um das klinisch relevante PAD zu simulieren. Präklinische HLI-Tiermodelle werden durch Doppelligatur der Oberschenkelarterie (DLFA) erzeugt, was der am weitesten verbreitete Ansatz in Labors auf der ganzen Welt ist8,9,10,11,12,13,14,15 zur Simulation einer akuten chronischen Ischämie. Dieser Ansatz erfordert jedoch in der Regel einen relativ großen und invasiven Schnitt. Weiterhin führt es unweigerlich dazu, dass die Tiere (insbesondere Mäuse) unter vermehrten Schmerzverletzungen und Entzündungen leiden, was auch die nachfolgenden Experimentellen Ergebnissebeeinflusst 5,6,16,17. Diese Arbeit beschreibt ein akutes auf chronisches HLI-Modell in APOE-/- Mäusen unter Verwendung eines sehr kleinen Schnitts.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HINWEIS: Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß der EG-Richtlinie EG 2010/63/EU durchgeführt und sind durch die lokale deutsche Gesetzgebung (35-9185.81/G[1]239/18) zugelassen. Zehn männliche ApoE-/- Mäuse mit dem C57BL/6J-Hintergrund mit einem Gewicht von 29,6-38,0 g wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht und mit einer westlichen Ernährung (1,25% Cholesterin und 21% Fett) und Wasser ad libitum für 12 Wochen ab dem Alter von 8 Wochen gefüttert. HLI wurde an 20 Wochen alten Mäusen durchgeführt, wie unten beschrieben.

1. Induktion von HLI in ApoE-/- Mäusen

  1. Bereiten Sie die erforderlichen Geräte und Werkzeuge für die Operation vor (siehe Materialtabelle und Abbildung 1). Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente vor Gebrauch durch Autoklavieren und verwenden Sie während der Operation einen Glasperlensterilisator.
  2. Betäuben Sie die Maus vor allen chirurgischen Eingriffen mit einer subkutanen Injektion (S.C.) einer Mischung aus Midazolam (5 mg/kg), Medetomidin (0,05 mg/ml/kg) und Fentanyl (0,5 mg/kg).
    1. Verwenden Sie nach Beginn der Anästhesie die Tiersalbe auf den Augen, um Trockenheit zu verhindern, und bestätigen Sie das Fehlen des Pedalentzugreflexes im Vorderbein und in der Hintergliedmaße.
  3. Anschließend die Maus auf ein Heizkissen legen, um die Körperkerntemperatur bei ca. 37 °C zu halten. Entfernen Sie mit Wattestäbchen und Haarentfernungscreme vorsichtig haare von der Hintergliedmaßenhaut auf der rechten Seite.
    HINWEIS: Die Haarentfernungscreme sollte in ausreichender Menge verwendet werden, um den Hinterteil zu bedecken, insbesondere den Leistenbereich, in dem der Schnitt gemacht wird. Die Haarentfernungscreme sollte für eine Dauer von weniger als 3 Minuten verwendet werden und anschließend 2 bis 3 Mal mit angefeuchteten Wattestäbchen entfernt werden.
  4. Legen Sie die Maus in Rückenlage unter ein Seziermikroskop auf das Heizkissen. Verwenden Sie ein Hautantiseptikum (siehe Materialtabelle),um die Haut der Maus zu desinfizieren. Anschließend machen Sie mit einer spitzen Pinzette und einer chirurgischen Schere einen ca. 3-4 mm langen Schnitt in der Mitte der Leistengegend. In Abbildung 2 finden Sie ein Schema der Prozedur.
  5. Entfernen Sie das Unterhautfettgewebe vorsichtig mit Hilfe einer feinen spitzen Pinzette, um das proximale neurovaskuläre Femoralbündel freizulegen. Verwenden Sie vorsichtig die feine spitze Pinzette, um die Membran der Oberschenkelscheide zu durchbohren. Verwenden Sie ein mit Kochsalzlösung angefeuchtetes Wattestäbchen, um die Oberschenkelarterie (FA) vorsichtig vom Oberschenkelnerv (FN) und der Oberschenkelvene (FV) wegzubewegen.
  6. Führen Sie zwei resorbierbare 7-0-Nähte durch die proximale FA und machen Sie doppelte Knoten mit einer Federschere, um die FA zwischen den beiden Bindungen zu transektieren.
  7. Um die distale FA freizulegen, führen Sie eine resorbierbare 7-0-Naht durch den unteren Rand des Schnitts und ziehen Sie den Schnitt vorsichtig in den Bereich der rechten Seite des Knies der Hintergliedmaße.
  8. Bewegen Sie das Unterhautgewebe vorsichtig zur Seite, um das neurovaskuläre Bündel freizulegen. Verwenden Sie eine feine spitze Pinzette, um die Membran der Oberschenkelscheide zu durchbohren, und sezieren Sie die FA von FV und FN.
  9. Führen Sie zwei 7-0 resorbierbare Nähte durch die distale FA und machen Sie doppelte Knoten. Verwenden Sie eine Federschere, um die FA zwischen den beiden Bindungen zu transektieren.
    HINWEIS: Am linken Glied, das bei jeder Maus als Kontrolle diente, wurde keine Ligatur durchgeführt.
  10. Verwenden Sie anschließend 6-0 resorbierbare Nähte, um den Schnitt zu nähen. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen in einem sauberen Käfig und überwachen Sie ihre Vitalparameter bis zur Genesung. Postoperative Analgetika: Buprenorphin s.c. (0,1 mg/kg Körpergewicht alle 8 Stunden für 48 h). 48 h nach der Operation Metamizol im Trinkwasser verabreichen (24 mg/5 ml Wasser entsprechen einer Dosis von 200 mg/kg 4 mal täglich).

2. Magnetresonanztomographie

HINWEIS: Einen Tag nach DLFA müssen sich die Mäuse MRT-Scans unterziehen, um die FA-Blockade zu beurteilen.

  1. Legen Sie die Maus in eine transparente Induktionskammer und betäuben Sie die Maus mit 1,5-2% Isofluran in der Umgebungsluft bis zum Verlust des Aufrichtungsreflexes.
  2. Legen Sie die Maus auf ein beheiztes Tierbett, das mit einem Bisshalter ausgestattet ist und mit einem lasergesteuerten System zum Magneten hin positioniert ist. Halten Sie die Körpertemperatur bei 37±1 °C.
  3. Halten Sie während der Bildaufnahme die Anästhesie mit 1,5-2% Isofluran in der Umgebungsluft aufrecht und überwachen Sie die Atmung mit einer Drucksonde.
  4. Erfassen Sie Bilder in der Querschnittausrichtung mit einer dreidimensionalen (3D) Time of Flight (TOF) Angiographiesequenz mit Parameter Echozeit (TE)/Wiederholungszeit (TR)/Flip angle (FA) = 2 ms/12 ms/13°, vier Mittelwerten, einer Erfassungsmatrix von 178 x 144 rekonstruiert auf 256 x 192 und 121 Scheiben, was zu einer isotropen Auflösung von 0,15 mm3führt. Um das Signal von den Venen zu unterdrücken, legen Sie eine Sättigungsscheibe distal zu den Hintergliedmaßen.

3. Klinische Bewertung und Follow-up

  1. Schätzen Sie die funktionelle Erholung in den1.,3.,5.und7. Tagen nach der Operation unter Verwendung der funktionellen Scoring-Tarlov-Skala18,19 ( Tabelle1).

4. Histologische Bewertung

  1. Sieben Tage nach der Operation eine Pentobarbital-Injektion (115 mg/kg) anwenden, um die Mäuse einzuschläfern.
  2. Perfuse phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1% Paraformaldehyd (PFA) durch den linken Herzventrikel (100 ml pro Maus). Fixieren Sie den bilateralen Gastrocnemius (Gm) der Mäuse in 4% PFA über Nacht bei 4 °C.
  3. Die Probe wird gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll 20 in Paraffineingebettet.
    1. Schneiden Sie 4-5 μm dicke Abschnitte des in Paraffin eingebetteten Gewebeblocks auf ein Mikrotom. Mit Hilfe eines runden Pinsels die geschnittenen Gewebeabschnitte in das bei 42°C gehaltene Wasserbad legen.
    2. Führen Sie den Objektträger in einem Winkel von 45° in das Wasser ein und positionieren Sie ihn vorsichtig unter der Gruppe der zu sammelnden Abschnitte.
    3. Heben Sie die Rutsche vorsichtig aus dem Wasser und lassen Sie die Abschnitte an der Rutsche befestigen und über Nacht im Tischinkubator bei 37 ° C trocknen.
  4. Führen Sie eine Hämatoxylin/ Eosin (HE) -Färbung der Paraffinabschnitte durch.
    1. Legen Sie die Dias, die die Schnitte enthalten, in Schieberhalter. Bereiten Sie 3 Behälter mit frischem Xylol vor und legen Sie die Folien für 5 Minuten in jeden Behälter, um die Abschnitte zu entparaffinisieren.
    2. Rehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie die Scheiben nacheinander in 96%, 80%, 70%, 50%, 30% Ethanol und entionisiertes Wasser für jeweils 5 Minuten tauchen.
    3. Färben Sie in Hämatoxylinlösung für 10 min.
    4. Geben Sie die Scheiben in einen Behälter mit entionisiertem Wasser und spülen Sie sie ab, indem Sie sie 5 Minuten lang unter fließendes Leitungswasser legen.
    5. Überprüfen Sie mit einem Mikroskop die Intensität der Hämatoxylinfärbung. Wenn die Färbung eine eindeutige Identifizierung der Zellkerne ermöglicht, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn die Färbeintensität die Identifizierung von Zellkernen nicht erleichtert oder wenn die Intensität der Färbung schwach ist, legen Sie den Objektträger für 1 Minute in die Hämatoxylinlösung, wiederholen Sie das Waschen mit Wasser (Schritt 4.4.4) und überprüfen Sie es dann erneut.
    6. Gegenfleck in Eosin-Y-Lösung für 5 min.
    7. Dehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie die Scheiben nacheinander für eine Dauer von jeweils 10 s in Behälter mit entionisiertem Wasser und 30%, 50%, 70%, 80% und 96% Ethanol tauchen. Als nächstes legen Sie die Abschnitte nacheinander in drei Behälter mit frischem Xylol für jeweils 10 s.
    8. Platzieren Sie die Objektträger horizontal auf mikroskopischen Objektträger-Speicherkarten mit den Abschnitten nach oben. Fügen Sie genügend Montagemedium auf dem Dia hinzu und montieren Sie die Dias mit Deckgläsern.
  5. Führen Sie die immunhistochemische (IHC) Färbung der Paraffinabschnitte durch.
    1. Wiederholen Sie die Deparaffinisierungs- und Rehydratisierungsschritte 4.4.1-4.4.2. Tauchen Sie dann die Abschnitte in einen Behälter mit 10 mM Natriumcitratpuffer, pH 6, und bringen Sie die Probe in einer Mikrowelle zum Kochen.
      HINWEIS: Da eine Über- oder Unterhitzung der Proben zu einer inkonsistenten Färbung führen kann, halten Sie die Temperatur 10 Minuten lang knapp unter dem Siedepunkt.
    2. Als nächstes kühlen Sie die Abschnitte auf einer Tischplatte für 30 Minuten. Danach waschen Sie die Abschnitte dreimal für 5 min in PBS. Trocknen Sie den Bereich um die Probe sorgfältig ab und zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen großen Kreis um die Probe. .
      HINWEIS: Berühren Sie niemals die Probe. Die Markierung mit einem hydrophoben Pen bildet eine hydrophobe Grenze, die die Verwendung eines kleineren Volumens der Antikörperlösung erleichtert.
    3. Abschreckung der endogenen Peroxidaseaktivität durch Platzieren des Abschnitts in 0,3%H2O2in PBS für 10 min. Blockschnitte mit 400 μL Blockpuffer (PBS enthalten 3% Rinderserumalbumin und 0,3% nichtionisches Reinigungsmittel) für 1 h bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.
    4. Waschen Sie die Abschnitte in PBS für 5 min. Als nächstes fügen Sie 100-400 μL verdünnten Anti-CD31-Antikörper (1:250) hinzu, um den Abschnitt abzudecken. Anschließend brüten Sie Abschnitte über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer aus.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Abschnitt vollständig mit der Antikörperlösung bedeckt ist.
    5. Entfernen Sie den primären Antikörper und waschen Sie die Abschnitte dreimal in PBS für eine Dauer von jeweils 5 minuten.
    6. Bereiten Sie die 3, 3 '-Diaminobenzidin (DAB) -Mischung vor, indem Sie 1 Tropfen des DAB-Konzentrats zu 1 ml des DAB-Verdünnungsmittels geben und gut mischen. Anschließend 100-400 μL DAB-Gemisch in die Schnitte geben und 2 min lang mit dem Auge genau überwachen, bis eine akzeptable Färbeintensität beobachtet wird.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Abschnitt vollständig mit der DAB-Mischung bedeckt ist.
    7. Anschließend 5 min unter fließendem Leitungswasser abspülen. Führen Sie die Hämatoxylinfärbung wie in den Schritten 4.4.3-4.4.5 beschrieben durch.
    8. Führen Sie die in Schritt 4.4.6 beschriebene Eosin-Y-Färbung durch. Führen Sie die in Schritt 4.4.7 beschriebenen Dehydratisierungsschritte durch.
    9. Montage der Abschnitte mit Deckgläsern unter Verwendung des Montagemediums. Verwenden Sie ImageJ, um den Prozentsatz der positiven CD31-Fläche (%) in 5 zufällig ausgewählten Feldern (40x) zu schätzen, die wie zuvor beschrieben als mikrovaskuläre Dichte angesehen werden können21.

5. Statistische Auswertung

  1. Verwenden Sie eine statistische Analysesoftware, um die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardabweichung auszudrücken und einen ungepaarten t-Testan den Vergleichen durchzuführen. Betrachten Sie P < 0,05 als statistisch signifikant.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eigenschaften von ApoE-/- Mäusen
DLFA-Operationen wurden erfolgreich an 10 Mäusen durchgeführt, um das HLI-Modell zu etablieren, und keine der Mäuse starb nach dem Eingriff. Um Veränderungen des Körpergewichts zu verfolgen, wurden Mäuse vor dem DLFA-Verfahren (Pre-DLFA) und 7 Tage nach der DLFA-Operation (Post-DLFA) gewogen. Die Gewichte vor DLFA lagen zwischen 29,6 und 38,0 g (Mittelwert 34,74 ± 2,47 g), und die Gewichte nach DLFA lagen zwischen 26,5 und ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie berichtet über einen modifizierten, vereinfachten und chirurgisch effizienten Ansatz zur Etablierung eines HLI-Modells inApoE-/-Mäusen mit Doppeltligatur in den proximalen und distalen Regionen des FA durch einen 3-4 mm-Schnitt ohne erforderliche Labor-Upgrades. Das Hauptmerkmal dieser Methode ist die geringere Größe der Inzision im Vergleich zu zuvor berichteten Studien, die die Maus-HLI-Modelle8,9,10

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass der Artikelinhalt in Ermangelung kommerzieller oder finanzieller Beziehungen verfasst wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Viktoria Skude, Alexander Schlund und Felix Hörner für die hervorragende technische Unterstützung.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10x Phosphatpuffer KochsalzlösungRoth9143.1Zur Färbung von Hämatoxylin und Eosin und immunhistochemischer Färbung
30% H2O2Roth9681.2Zur immunhistochemischen Färbung
von 6-0 resorbierbaren NähtenPROLENE8776HZur Naht der Haut
6-0 absroable NahtmaterialPROLENEEP8706Wird in der Chirurgie
verwendet 7-0 resorbierbare NähtePROLENEEH8021EWird zur Ligatur der Arterie
7-0 absroable NahtPROLENEEP8755Verwendet in der Chirurgie
EssigsäureRoth6755.1Wird verwendet für Hämatoxylin- und Eosin-Färbung
Albumin Fraktion VRoth8076.2Wird für immunhistochemische Färbung
AutoklavverwendetSystec GmbHSystec VX-150Wird für die Sterilisation der chirurgischen Instrumente
verwendet Axio vert A1 Mikroskop CarlZeissZEISS Axio Vert.A1Dient zum Betrachten und Aufnehmen der Bilder von Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen und immunhistochemischen Flecken
Bruker BioSpec 94/20 AVIIIBruker Biospin MRI GmbHN/AScan der Blockade der Oberschenkelarterie
Buprenovet Sine 0,3mg/mlBayer AG2542 (WDT)Wird in der postoperativen Schmerztherapie verwendet. Dosis - 0,1 mg/kg Körpergewicht alle 8 Stunden für 48 h nach der Operation
CD31 AntikörperAbcamab28364Zur immunhistochemischen Färbung
Eosin Y Lösung 0,5 % in WasserRothX883.1Zur Färbung von Hämatoxylin und Eosin
Epitope Retrieval Solution pH 6Leica Biosystems6046945Zur immunhistochemischen Färbung
Ethanol > 99,5 %Roth5054.1Zur Färbung von Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen und immunhistochemischen Färbungen
FentanylCayman Chemical437-38-7Zur Anästhesie
Fine-Point-PinzetteMedixplus93-4505SZur Trennung der Arterie von Nerv und Vene
Glasperlen-SterilisatorSimon KellerTyp 250Zur Sterilisation der chirurgischen Instrumente
Graefe Iris Pinzette gebogenVUBUVUBU-02-72207Wird zur stumpfen Trennung von Haut und Unterhautgewebe verwendet
Haarentfernercreme, Veet (mit Aloe Vera)Reckitt Benckiser108972Entfernen Sie Haare von Mäusen Hintergliedmaßen Heizplatte
STÖ RK-TRONIC7042092Halten Sie die sattliche Temperatur von Mäusen
HämatoxylinRothT865.2Wird für Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen und immunhistochemische Färbungen
verwendet Leica OperationsmikroskopLeicaM651Vergrößern Sie das Sichtfeld, um die Operation zu erleichtern
Flüssiges DAB+Substrat Chromogen SystemDakoK3468Wird für immunhistochemische Färbung verwendet
Männliche ApoE-/- MäuseCharles River LaboratoriesN/AWird für die Etablierung der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit Mäusemodell
MedetomidinCayman Chemical128366-50-7Verwendet für die Anästhesie
MikronadelhalterSchwarz & Black SurgicalB3B-18-8Halten der Nadel
Mikro-NahtbindezangeLife Saver Surgical IndustriesPS-MSF-145Zur Unterstützung des Knotens während der Operation
MikrotomBiobaseBk-Mt268mWird für Gewebeschnitte
verwendet MidazolamRatiopharm44856.01.00Wird für die Anästhesie
verwendet MRT-kompatibles Überwachungs- und Anschnittsystem für Kleintiere Modell 1025SA InstrumentsN/aÜberwachung der Vitalparameter von Tieren während der MRT-Untersuchung
Octeniderm farblosSchü LKE & Mayr GmbH180212zur Desinfektion der Haut
verwendet Salbe für Augen und NaseBayer AG1578675Halten Sie die Augen unter Narkose feucht
ParaformaldehydRoth0335.1Zur Fixierung des Gewebes
PentobarbitalNembutal76-74-4Zur Anästhesie
KochsalzlösungDeltaSelect1299.99.99Verwendet für Anästhesie
Federgriffschere mit feinen, scharfen SpitzenSchwarz & Schwarz SurgicalB66167Wird zum Schneiden der Arterie
verwendet SuperCut SchereSchwarz & Black SurgicalB55992Wird zum Schneiden der Haut
verwendet Triton X-100Roth9002-93-1Verwendet für immunhistochemische Färbung
Westliche Ernährung, 1,25% Cholesterinschnüffelt Spezialdiä ten GmbHE15723-34Futter für die Mäuse
XylolRoth4436.3Zur Färbung von Hämatoxylin und Eosin und Immunhistochemie

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shu, J., Santulli, G. Update on peripheral artery disease: Epidemiology and evidence-based facts. Atherosclerosis. 275, 379-381 (2018).
  2. Tateishi-Yuyama, E., et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9331), 427-435 (2002).
  3. Wang, Z. X., et al. Efficacy of autologous bone marrow mononuclear cell therapy in patients with peripheral arterial disease. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 21 (11), 1183-1196 (2014).
  4. Botham, C. M., Bennett, W. L., Cooke, J. P. Clinical trials of adult stem cell therapy for peripheral artery disease. Methodist Debakey Cardiovascular Journal. 9 (4), 201-205 (2013).
  5. van Weel, V., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression in ischemic skeletal muscle enhances myoglobin expression in vivo. Circulation Research. 95 (1), 58-66 (2004).
  6. Olea, F. D., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression does not enhance adipose stromal cell-induced protection on muscle damage in critical limb ischemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (1), 184-188 (2015).
  7. Peeters Weem, S. M. O., Teraa, M., de Borst, G. J., Verhaar, M. C., Moll, F. L. Bone marrow derived cell therapy in critical limb ischemia: a meta-analysis of randomized placebo controlled trials. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 50 (6), 775-783 (2015).
  8. Crawford, R. S., et al. Divergent systemic and local inflammatory response to hind limb demand ischemia in wild-type and ApoE-/- mice. Journal of Surgical Research. 183 (2), 952-962 (2013).
  9. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e1035(2009).
  10. Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
  11. Peck, M. A., et al. A functional murine model of hindlimb demand ischemia. Annals of Vascular Surgery. 24 (4), 532-537 (2010).
  12. Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
  13. Nagase, H., Yao, S., Ikeda, S. Acute and chronic effects of exercise on mRNA expression in the skeletal muscle of two mouse models of peripheral artery disease. PLoS One. 12 (8), 0182456(2017).
  14. Fu, J., et al. Hydrogen molecules (H2) improve perfusion recovery via antioxidant effects in experimental peripheral arterial disease. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5009-5015 (2018).
  15. Yu, J., Dardik, A. A murine model of hind limb ischemia to study angiogenesis and arteriogenesis. Methods in Molecular Biology. 1717, 135-143 (2018).
  16. Pu, L. Q., et al. Enhanced revascularization of the ischemic limb by angiogenic therapy. Circulation. 88 (1), 208-215 (1993).
  17. Takeshita, S., et al. Therapeutic angiogenesis. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. Journal of Clinical Investigation. 93 (2), 662-670 (1994).
  18. Tarlov, I. M. Spinal cord compression studies. III. Time limits for recovery after gradual compression in dogs. AMA Archives of Neurology and Psychiatry. 71 (5), 588-597 (1954).
  19. Westvik, T. S., et al. Limb ischemia after iliac ligation in aged mice stimulates angiogenesis without arteriogenesis. Journal of Vascular Surgery. 49 (2), 464-473 (2009).
  20. Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
  21. Liu, Q., et al. CRISPR/Cas9-mediated hypoxia inducible factor-1α knockout enhances the antitumor effect of transarterial embolization in hepatocellular carcinoma. Oncology Reports. 40 (5), 2547-2557 (2018).
  22. Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166(2016).
  23. Pellegrin, M., et al. Experimental peripheral arterial disease: new insights into muscle glucose uptake, macrophage, and T-cell polarization during early and late stages. Physiological Reports. 2 (2), 00234(2014).
  24. Sun, Z., et al. VEGF-loaded graphene oxide as theranostics for multi-modality imaging-monitored targeting therapeutic angiogenesis of ischemic muscle. Nanoscale. 5 (15), 6857-6866 (2013).
  25. Craige, S. M., et al. NADPH oxidase 4 promotes endothelial angiogenesis through endothelial nitric oxide synthase activation. Circulation. 124 (6), 731-740 (2011).
  26. Kant, S., et al. Neural JNK3 regulates blood flow recovery after hindlimb ischemia in mice via an Egr1/Creb1 axis. Nature Communications. 10 (1), 4223(2019).
  27. Chevalier, J., et al. Obstruction of small arterioles in patients with critical limb ischemia due to partial endothelial-to-mesenchymal transition. iScience. 23 (6), 101251(2020).
  28. Kosmac, K., et al. Correlations of calf muscle macrophage content with muscle properties and walking performance in peripheral artery disease. Journal of the American Heart Association. 9 (10), 015929(2020).
  29. Mohiuddin, M., et al. Critical limb ischemia induces remodeling of skeletal muscle motor unit, myonuclear-, and mitochondrial-domains. Scientific Reports. 9 (1), 9551(2019).
  30. Ministro, A., et al. Assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59582(2019).
  31. Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nature Medicine. 15 (6), 657-664 (2009).
  32. Portou, M. J., et al. Hyperglycaemia and ischaemia impair wound healing via Toll-like receptor 4 pathway activation in vitro and in an experimental murine model. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 59 (1), 117-127 (2020).
  33. Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
  34. Hazarika, S., et al. MicroRNA-93 controls perfusion recovery after hindlimb ischemia by modulating expression of multiple genes in the cell cycle pathway. Circulation. 127 (17), 1818-1828 (2013).
  35. Fan, W., et al. mTORC1 and mTORC2 play different roles in the functional survival of transplanted adipose-derived stromal cells in hind limb ischemic mice via regulating inflammation in vivo. Stem Cells. 31 (1), 203-214 (2013).
  36. Terry, T., et al. CD34(+)/M-cadherin(+) bone marrow progenitor cells promote arteriogenesis in ischemic hindlimbs of ApoE(-)/(-) mice. PLoS One. 6 (6), 20673(2011).
  37. Kwee, B. J., et al. Treating ischemia via recruitment of antigen-specific T cells. Science Advances. 5 (7), (2019).
  38. Nakada, M. T., et al. Clot lysis in a primate model of peripheral arterial occlusive disease with use of systemic or intraarterial reteplase: addition of abciximab results in improved vessel reperfusion. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 15 (2), Pt 1 169-176 (2004).
  39. Carr, A. N., et al. Efficacy of systemic administration of SDF-1 in a model of vascular insufficiency: support for an endothelium-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 69 (4), 925-935 (2006).
  40. Del Giudice, C., et al. Evaluation of a new model of hind limb ischemia in rabbits. Journal of Vascular Surgery. 68 (3), 849-857 (2018).
  41. Liddell, R. P., et al. Endovascular model of rabbit hindlimb ischemia: a platform to evaluate therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 16 (7), 991-998 (2005).
  42. Aboyans, V., et al. 2017 ESC guidelines on the diagnosis and treatment of peripheral arterial diseases, in collaboration with the European Society for Vascular Surgery (ESVS): Document covering atherosclerotic disease of extracranial carotid and vertebral, mesenteric, renal, upper and lower extremity arteriesEndorsed by: the European Stroke Organization (ESO)The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Peripheral Arterial Diseases of the European Society of Cardiology (ESC) and of the European Society for Vascular Surgery (ESVS). European Heart Journal. 39 (9), 763-816 (2018).
  43. Lo Sasso, G., et al. The Apoe(-/-) mouse model: a suitable model to study cardiovascular and respiratory diseases in the context of cigarette smoke exposure and harm reduction. Journal of Translational Medicine. 14 (1), 146(2016).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Ligation der Arteria femoralisApoE Knockout M useminimalinvasive InzisionschirurgieDoppelligationsmethodeMagnetresonanztomographieTarlov Skala Bewertungmikrovaskul re DichteIsch mie Reperfusionsschadenhistologische Auswertung

Verwandte Artikel