Verwendung von Lipid-Nanopartikeln für die Verabreichung von chemisch modifizierter mRNA in Säugetierzellen

Zusammenfassung

Das Protokoll präsentiert die In-vitro-Transkription (IVT) von chemisch modifizierter mRNA, die kationische Liposomenpräparation und die funktionelle Analyse von Liposomen-aktivierten mRNA-Transfektionen in Säugetierzellen.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren hat sich chemisch modifizierte Boten-RNA (mRNA) zu einem potenten Nukleinsäuremolekül für die Entwicklung einer Vielzahl von therapeutischen Anwendungen entwickelt, darunter eine neuartige Klasse von Impfstoffen, Proteinersatztherapien und Immuntherapien. Unter den Verabreichungsvektoren haben sich Lipid-Nanopartikel als sicherer und wirksamer bei der Abgabe von RNA-Molekülen erwiesen (z. B. siRNA, miRNA, mRNA), und einige Produkte sind bereits im klinischen Einsatz. Um die Lipid-Nanopartikel-vermittelte mRNA-Verabreichung zu demonstrieren, präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Synthese von funktioneller me1Ψ-UTP-modifizierter eGFP-mRNA, die Präparation von kationischen Liposomen, die elektrostatische Komplexbildung von mRNA mit kationischen Liposomen und die Bewertung der Transfektionseffizienz in Säugetierzellen. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Modifikationen die Stabilität von mRNA effizient verbesserten, wenn sie mit kationischen Liposomen verabreicht wurden, und die Effizienz und Stabilität der eGFP-mRNA-Translation in Säugetierzellen erhöhten. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die gewünschte mRNA zu synthetisieren und mit kationischen Liposomen für die Zielgenexpression in Säugetierzellen zu transfizieren.

Einleitung

Als therapeutisches Molekül bietet mRNA im Vergleich zu Plasmid-DNA (pDNA) mehrere Vorteile, da sie nicht-integrativ ist und nicht-mitotische Zellen transfizieren ^kann1. Obwohl die mRNA-Verabreichung bereits in den frühen 1990er Jahren nachgewiesen wurde, waren die therapeutischen Anwendungen aufgrund ihrer mangelnden Stabilität, ihrer mangelnden Immunaktivierung und ihrer geringen translationalen Effizienz begrenzt². Kürzlich identifizierte chemische Modifikationen wie Pseudouridin-5'-triphosphat (Ψ-UTP) und Methyl-Pseudouridin-5'-triphosphat (me1Ψ-UTP) auf mRNA halfen, diese Einschränkungen zu überwinden, revolutionierten die mRNA-Forschung und machten mRNA wiederum zu einem vielversprechenden Werkzeug sowohl in der Grundlagen- als auch in der angewandten Forschung. Das Anwendungsspektrum reicht von der Erzeugung von iPSCs über die Impfung bis hin zur Gentherapie ^3,4.

Parallel zu den Fortschritten in der mRNA-Technologie machten bedeutende Fortschritte bei nicht-viralen Verabreichungssystemen die Verabreichung von mRNA effektiv, so dass diese Technologie für mehrere therapeutische Anwendungen möglich ist⁵. Unter den nicht-viralen Vektoren haben sich Lipid-Nanopartikel als wirksam bei der Abgabe von Nukleinsäuren erwiesen ^6,7. Vor kurzem hat Alnylam von der FDA die Zulassung für lipidbasierte siRNA-Medikamente zur Behandlung von Lebererkrankungen erhalten, darunter Patisiran zur Behandlung von hereditärer Transthyretin-vermittelter Amyloidose (hATTR-Amyloidose) und Givosiran zur Behandlung von akuter hepatischer Porphyrie (AHP)⁸. Während der COVID19 Pandemie haben lipidverkapselte mRNA-basierte Impfstoffe von Pfizer-BioNtech und Moderna ihre Wirksamkeit unter Beweis gestellt und die FDA-Zulassungen erhalten ^9,10. Daher hat die lipidgestützte mRNA-Verabreichung ein großes therapeutisches Potenzial.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von chemisch modifizierter, in vitro transkribierter eGFP-mRNA, kationische Liposomenpräparation, mRNA-Lipid-Komplex-Optimierung und Transfektionen in Säugetierzellen (Abbildung 1).

Protokoll

1. Herstellung von me1 Ψ-UTP-modifizierter mRNA

1. Vorbereitung von DNA-Templates für In-vitro-Transkription (IVT)
   HINWEIS: Für die Vorbereitung des IVT-DNA-Templates (T7-Promotor - offener Leserahmen (ORF) des Gens) ist ein genspezifisches Primer-Set für das interessierende Gen zu entwerfen. Fügen Sie die T7-Promotorsequenz (5'-NNNNNNTAATACGACTCACTCACTATAGGGNNNNNN-3') vor dem genspezifischen Forward-Primer hinzu.
   1. Bereiten Sie das PCR-Reaktionsgemisch wie in Tabelle 1 beschrieben vor.
      HINWEIS: Führen Sie mindestens vier PCR-Reaktionen durch, um die IVT-DNA-Template-Konzentration und -Qualität für IVT zu erhöhen.
   2. Das Reaktionsgemisch mit einer Mikropipette vollständig durchmischen und mit einer Mikrofuge nach unten schleudern.
   3. Führen Sie das in Tabelle 2 angegebene PCR-Zyklusprotokoll auf einem Thermocycler aus.
2. Reinigung des IVT-DNA-Templates durch organische Extraktion/Ethanolfällung
   1. Passen Sie das amplifizierte PCR-Reaktionsgemisch mit DEPC-behandeltem Wasser in einem 1,5-ml-Mikrofuge-Röhrchen (nukleasefrei) auf insgesamt 200 μl an.
   2. 200 μl TE-gesättigtes Phenol/Chloroform, pH 8,0, zugeben. 10 Sekunden lang kräftig vortexen.
   3. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 12.000 x g, um die Phasen zu trennen, und übertragen Sie die wässrige obere Phase (ca. 200 μl) in ein neues 1,5 mL Mikrofuge-Röhrchen.
   4. 1/10^th (20 μl) Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,5 und zwei Volumen (400 μl) 99-100 % Ethanol hinzufügen. Gut mischen und dann mindestens 30 Minuten bei -20 °C inkubieren.
   5. Das DNA-Template wird durch Zentrifugation bei 12.000 x g für 15 Minuten bei 4 °C pelletiert.
   6. Entfernen Sie den Überstand vollständig, ohne das Pellet mit einer Mikropipette zu stören.
   7. Geben Sie 0,5 ml 75%iges Ethanol in das Pellet und invertieren Sie es 5-10 Mal.
   8. 2 Minuten bei 12.000 x g bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie dann das Ethanol vollständig mit einer Pipette, ohne das DNApellet zu stören.
   9. Lassen Sie das Pellet bei Raumtemperatur trocknen, bis das Pellet etwas glasig wird.
   10. Fügen Sie 20 μl nukleasefreies Wasser hinzu und suspendieren Sie es einige Sekunden lang gründlich.
3. Qualitätskontrolle für das aufgereinigte IVT-DNA-Template
   1. Quantifizierung
      1. Messen Sie die Konzentration und Qualität der gereinigten IVT-DNA-Matrize mit einem Mikrospektrophotometer.
         HINWEIS: Die erwartete DNA-Konzentration liegt bei etwa 300-600 ng/μL. Lagern Sie das IVT-DNA-Template langfristig bei -20 °C.
   2. DNA-Agarose-Gel-Elektrophorese
      HINWEIS: Mit diesem Experiment soll überprüft werden, ob das gereinigte IVT-DNA-Template die richtige Größe hat und frei von unspezifischen Produktkontaminationen ist.
      1. Um ein 1%iges Agarose-Gel herzustellen, geben Sie 0,5 g Agarose und 50 mL 1x TAE in einen ermächtigten Kolben. In der Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat. Die Agarose 5 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
      2. Fügen Sie 1 μl Nukleinsäurefärbung (SafeView-Farbstoff) hinzu, um eine 50 mL Agaroselösung zu erhalten.
      3. Gießen Sie die Agaroselösung mit einem Kamm in eine Gelgießschale und lassen Sie sie einwirken, bis das Gel fest geworden ist.
      4. Nehmen Sie den Kamm aus dem Gel und bewahren Sie das Gel im 1x TAE gepufferten Tank auf.
      5. Mischen Sie 10 μl 100-10000 bp DNA-Leiter und 100-200 ng PCR-gereinigtes Template-Produkt mit 2 μl 6x DNA-Ladepuffer zu einem Gesamtvolumen von 12 μl.
      6. Laden Sie jede Probe in die entsprechenden Vertiefungen und lassen Sie sie mindestens 45-60 Minuten lang bei 100 V laufen.
      7. Visualisieren Sie die DNA-Banden auf einem Geldokumentationsinstrument (Abbildung 2).
4. Synthese von me1Ψ-UTP-modifizierter RNA
   HINWEIS: Vor Beginn dieses Experiments sollte der Arbeitsbereich (laminare Luftströmung) mit 70 % Ethanol in DEPC-behandeltem Wasser gereinigt werden. Verwenden Sie sterile Nuklease- und Endotoxin-freie Röhrchen mit geringer Retention und Filterbarrierespitzen. Tragen Sie häufig 70% Ethanol auf die behandschuhten Hände auf.
   1. Bereiten Sie das IVT-Reaktionsgemisch wie in Tabelle 3 angegeben bei Raumtemperatur in einem 0,2-ml-Röhrchen vor und mischen Sie es gründlich mit einer Mikropipette.
   2. Drehen Sie das Röhrchen 10 Sekunden lang in einer Mikrofuge.
   3. Bei 37 °C 3 Stunden in einem Thermocycler inkubieren.
5. Abbau des IVT-DNA-Templates durch DNase 1-Behandlung
   1. 1 μl 1 U/μl DNase 1 (RNase-frei) in den IVT-Reaktionsmix geben und 30 Minuten bei 37 °C inkubieren.
6. Aufreinigung von RNA durch organische Extraktion/Ammoniumacetat-Fällung
   1. Stellen Sie das Volumen des IVT-Reaktionsgemisches auf 200 μl mit 179 μl DEPC-behandeltem Wasser ein.
   2. 200 μl TE-gesättigtes Phenol/Chloroform pH 8,0 zugeben. Wirbeln Sie es 10 Sekunden lang.
   3. Bei 12.000 x g 5 Minuten bei 25 °C zentrifugieren, um die beiden Phasen zu trennen.
   4. Die wässrige obere Phase (200 μl) wird in ein 1,5-ml-Röhrchen überführt und 200 μl 5 M Ammoniumacetat hinzugefügt. Gut mischen und dann 15 Minuten auf Eis inkubieren, um die RNA auszufällen.
   5. Die präzipitierte RNA wird durch Zentrifugation bei 12.000 x g für 15 Minuten bei 4 °C pelletiert und der Überstand mit einer Mikropipette vollständig entfernt.
   6. Waschen Sie das RNA-Pellet mit 70% Ethanol und invertieren Sie es 5-10 Mal. Bei 12.000 x g 5 Minuten bei 4 °C zentrifugieren.
   7. Entfernen Sie den Überstand vollständig mit einer Mikropipette, ohne das RNA-Pellet zu stören.
   8. Lassen Sie das Pellet bei Raumtemperatur trocknen, bis das Pellet halbdurchscheinend wird. Suspendieren Sie das Pellet dann erneut in 60-75 μl RNase-freiem Wasser.
7. Qualitätskontrolle für gereinigte RNA
   1. Quantifizierung
      1. Messen Sie die Konzentration und Qualität der gereinigten RNA mit einem Mikrospektrophotometer.
         HINWEIS: Die erwartete RNA-Ausbeute beträgt 140-180 μg für unmodifizierte RNA und 100-150 μg für me1Ψ-UTP-modifizierte RNA pro Reaktion, abhängig von der Größe des interessierenden Gens und der Qualität des IVT-DNA-Templates. Die optimale Qualität sollte ein Verhältnis von OD₂₆₀/OD₂₈₀ um 1,9-2,0 und ein Verhältnis von OD₂₆₀/OD₂₃₀ >2,0 sein. Lagern Sie die RNA für kurze Zeit bei -20 °C.
   2. Denaturierende RNA-Agarose-Gelelektrophorese
      HINWEIS: Dieses Experiment wird durchgeführt, um zu überprüfen, ob die synthetisierte RNA die richtige Länge und keine Kontamination durch IVT-Nebenprodukte aufweist.
      1. Um ein 1%iges Agarose-Gel herzustellen, geben Sie 0,5 g Agarose und 50 mL 1x TAE in einen ermächtigten Kolben. Die Lösung in der Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat. Bewahren Sie die Agaroselösung zum Abkühlen 5 Minuten bei Raumtemperatur auf.
      2. Fügen Sie 1 μl Nukleinsäurefärbung für 50 mL 1%ige Agaroselösung hinzu.
      3. Gießen Sie die Agaroselösung mit einem Kamm in die Gelgießschale und lassen Sie sie einwirken, bis das Gel fest geworden ist.
      4. Nehmen Sie den Kamm aus dem Gel und bewahren Sie das Gel im 1x TAE gepufferten Tank auf.
      5. Bereiten Sie die RNA-Ladefarbstoffprobe vor, wie in Tabelle 4 beschrieben.
      6. Erhitzen Sie die Proben 10 Minuten lang bei 65 °C und bewahren Sie die Proben dann auf Eis auf.
      7. Laden Sie jede Probe auf die jeweiligen Vertiefungen und lassen Sie sie mindestens 45-60 Minuten lang bei 100 V laufen.
      8. Visualisieren Sie die RNA-Banden auf einem Geldokumentationsinstrument (Abbildung 3).
8. Synthese von me1Ψ-UTP modifizierter mRNA durch enzymatisches Capping & Poly-A Tailing
   HINWEIS: Die Deckelungseffizienz von IVT-RNA mit der enzymatischen Methode beträgt 100%. Daher haben wir in diesem Protokoll ein enzymatisches Capping von Cap-1 in der mRNA-Synthese verwendet. Wir fügten Poly-A-Schwänze mit einer Länge von >150 A-Basen pro Molekül hinzu, um die Translationseffizienz von mRNA zu verbessern.
   1. Fügen Sie 55-60 μg gereinigte IVT-RNA hinzu und erhöhen Sie die Menge mit dem RNase-freien Wasser in einem 1,5-ml-Röhrchen auf 72 μl.
   2. Denaturieren Sie die RNA bei 65 °C für 10 Minuten in einem Thermomixer und legen Sie das Röhrchen dann sofort für 5 Minuten auf Eis.
   3. In der Zwischenzeit wird das Verschließreaktionsgemisch wie in Tabelle 5 gezeigt vorbereitet.
   4. Geben Sie das Gemisch der Verschließreaktion und 4 μl des Verschließenzyms zur denaturierten RNA und mischen Sie es gut mit einer Mikropipette. Drehen Sie das Röhrchen 10 Sekunden lang in einer Mikrofuge.
   5. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.
   6. Nach 2 Stunden das Röhrchen auf Eis legen und den Poly A Tailing Master Mix wie in Tabelle 6 angegeben zubereiten.
   7. Geben Sie den Poly A Tailing-Mastermix in die verschlossene RNA-Lösung und mischen Sie es gut mit einer Mikropipette. Drehen Sie das Röhrchen 10 Sekunden lang in einer Mikrofuge.
   8. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.
      HINWEIS: mRNA kann sofort weiter gereinigt werden, oder rohe mRNA kann über Nacht bei -20 °C gelagert werden.
9. IVT-mRNA-Aufreinigung
   1. Die mRNA wird durch organische Extraktion/Ammoniumacetat-Fällung gemäß Protokollabschnitt 1.6 gereinigt.
   2. Suspendieren Sie das mRNA-Pellet mit 60 μl RNase-freiem Wasser.
10. Qualitätskontrolle für die aufgereinigte mRNA
    1. Befolgen Sie das Qualitätskontrollprotokoll, wie in Protokollabschnitt 1.7 beschrieben.
       HINWEIS: Die mRNA-Bande sollte aufgrund der Zugabe von Poly-A-Tailing in der denaturierenden RNA-Agarose-Gelelektrophorese über der RNA-Bande erscheinen (Abbildung 3). Außerdem erhöht das Poly-A-Tailing die mRNA-Ausbeute (sollte > RNA-Konzentration sein). Nach der Quantifizierung werden mehrere aliquote mRNA in einer Konzentration von 1 μg/μl gegeben und sofort bei -80 °C gelagert. Vermeiden Sie mehrfache Einfrier- und Auftauzyklen von RNA, um den Abbau der synthetisierten mRNA zu verhindern.

2. Herstellung von kationischen Liposomen und Bewertung der in vitro mRNA-Transfektionseigenschaften

1. Liposomen-Vorbereitung
   1. Für die Herstellung von 1 mM kationischem Liposom verwenden Sie kationisches Lipid: DOPE: Cholesterin im molaren Verhältnis von 1:1:0,5.
   2. Geeignete molare Verhältnisse des kationischen Lipids, des Cholesterins und des DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamin) in Chloroform (200 μL) in einem Glasfläschchen auflösen.
   3. Verwenden Sie einen dünnen Strom feuchtigkeitsfreies Stickstoffgas zur Entfernung von Lösungsmitteln.
   4. Getrocknete Lipide zum weiteren Trocknen 2 Stunden unter einem Hochvakuum aufbewahren.
   5. Fügen Sie nach dem Vakuumtrocknen 1 ml steriles deionisiertes Wasser zu den getrockneten Lipiden hinzu und lassen Sie die Mischung über Nacht quellen.
   6. Wirbeln Sie das Fläschchen bei Raumtemperatur, um multi-unilamelläre Vesikel (MUVs) herzustellen.
   7. Verwenden Sie Badbeschallung, gefolgt von Sondenbeschallung bei 25 W Leistung, um aus mehrstöckigen unilamellären Vesikeln (MUVs) kleine unilamellare Vesikel (SUVs) herzustellen.
      HINWEIS: Die SUVs sollten wie eine durchscheinende Liposomenlösung aussehen. Wenn nicht, erhöhen Sie die Anzahl der 30-Sekunden-Impulse im Abstand von 1 Minute ein- und aus. Hydrodynamische Durchmesser und Oberflächenpotentiale werden in einem Partikelgrößenanalysator gemessen (Abbildung 4).
2. mRNA/Liposomen-Komplexbildung und Gelretardierungsassay
   1. Zur Herstellung verschiedener Lipid-RNA-Ladungsverhältnisse von 1:1 bis 8:1 verdünnen Sie die mRNA und das kationische Liposom getrennt in deionisiertem Wasser, wie in Tabelle 7 angegeben.
   2. Mischen Sie die verdünnte mRNA mit der Liposomenlösung, wie in Tabelle 7 gezeigt, und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Lipoplexbildung zu gewährleisten.
   3. Geben Sie 20 μL 2x RNA-Ladefarbstoff in den Komplex und laden Sie ihn in die Vertiefung. mRNA allein dient als Kontrolle.
   4. Laden Sie die Proben auf ein 1%iges Agarosegel in 1x TAE-Puffer und lassen Sie sie 45 Minuten lang bei 100 V laufen.
   5. Visualisieren Sie die RNA-Banden auf einem Geldokumentationsinstrument (Abbildung 5).
3. In vitro mRNA-Transfektion
   1. 45.000 Säugetierzellen pro Vertiefung mit 48-Well-Platten in vollständiges Medium aussäen und dann bei 37 °C für 16 bis 20 Stunden Transfektion inkubieren.
   2. Überprüfen Sie nach 16 bis 20 Stunden die Zelldichte. Zum Zeitpunkt der Transfektion sollte der Zellzusammenfluss etwa 80 % betragen.
   3. In 0,5-ml-Röhrchen werden 150 ng GFP-Protein-kodierender mRNA-Komplex mit einem Ladungsverhältnis von 1:1 aus kationischen Liposomen und mRNA in DMEM-Medium ohne Serum gegeben. Das Gesamtvolumen beträgt bis zu 20 μL.
   4. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   5. Geben Sie Lipoplex in die Zellen und inkubieren Sie es 4 Stunden lang in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂ .
   6. Entfernen Sie das Medium, ohne die Zellen zu stören. Geben Sie 250 μl vollständiges Medium mit 10 % FBS (Tabelle 8) in jede Vertiefung.
   7. Nach 72 Stunden Transfektion ist die GFP-Expression unter einem Fluoreszenzmikroskop zu betrachten (Abbildung 6, 7).
   8. Um die GFP-Expression zu quantifizieren, werden die Zellen für die Durchflusszytometer-Analyse aufbereitet.
   9. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es zweimal mit 1x PBS. Trypsinisieren Sie die Zellen und verarbeiten Sie die Zellen, um den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen in einem Durchflusszytometer zu quantifizieren.
   10. Erfassen Sie die Zellen in einem Durchflusszytometer mit dem Laser 488. Koppeln Sie die lebende Population daraus und analysieren Sie den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen. Quantifizieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) (Abbildung 6, 7).

Ergebnisse

Wir optimierten das Protokoll für die me1Ψ-UTP-modifizierte mRNA-Produktion, die Liposomenpräparation und mRNA-Transfektionsexperimente mit kationischen Liposomen in mehreren Säugetierzellen (Abbildung 1). Zur Synthese von mRNA wurde das Säugetiercodon-optimierte eGFP IVT-Template aus dem mEGFP-N1-Säugetierexpressionsvektor amplifiziert und durch organische Extraktion/Ethanolfällungsmethode gereinigt (Abbildung 2). Später wurden me1Ψ-UTP-modifizierte RNA und mRN...

Diskussion

Therapeutische Anwendungen von unmodifizierten mRNAs waren aufgrund ihrer kürzeren Halbwertszeit und ihrer Fähigkeit, intrazelluläre angeborene Immunantworten zu aktivieren, begrenzt, was wiederum zu einer schlechten Proteinexpression in transfizierten Zellen führte¹¹. Katalin et al. zeigten, dass RNA, die modifizierte Nukleoside wie m5C, m6A, ΨU und me1Ψ-UTP enthält, die TLR-Aktivierung vermeiden kann¹². Noch wichtiger ist, dass der Einbau...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agarose	Lonza	50004
Bad-Ultraschallgerät	DNMANM Industries	USC-100
Kationisches Lipid	Labor
Chlorofrom	MP biomedicals	67-66-3	"Vorsicht"
Cholesterin	Himedia	GRM335
DEPC Wasser	SRL BioLit	66886
DMEM	Lonza	12-604F
DNA Leiter	GeneDireX	DM010-R50C
DOPE	TCI	D4251
EDTA Natriumsalz	MP biomedizinisch	194822
Ethanol	Hayman	F204325	"Vorsicht"
Fötales Rinderserum	Gibco	10270
Durchflusszytometrie	BD	FACS Celesta
Fluroszenmikroskop	Leica	MI6000B
Gel Dokumentationssystem	Cell Biosciences	Flurochem E
Eisessig	Fisher Scientific	85801	"Vorsicht"
mEGFP-N1, Säugetier-Expressionsvektor	Addgene	54767
N1-Methylpseudo-UTP	Jena Bioscience	NU-890
Phenol:Chloroform:isoamylalchol (25:24:1), pH 8,0	SRL BioLit	136112-00-0	"Vorsicht"
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4	CellClone	CC3041
Sonden-Ultraschallgerät	Sonics Vibra Cells	VCX130
RNA-Leiter	NEB	N0362S
RNase-Inhibitor	Thermo Scientific	N8080119 SafeView-Farbstoff
	abm	G108
Natriumacetat	Sigma	S7545
Thermocycler	Angewandte Biosysteme	4375786
Thermomixer	Eppendrof	22331
Tris-Puffer	SRL BioLit	71033
Trypsin	Gibco	25200056