Immunfluoreszierende Färbung zur Visualisierung von Heterochromatin-assoziierten Proteinen in Drosophila Speicheldrüsen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Heterochromatin-Aggregate in Drosophila-Polyten-Zellen zu visualisieren.

Zusammenfassung

Die Visualisierung von Heterochromatin-Aggregaten durch Immunfärbung kann eine Herausforderung sein. Viele Säugetierkomponenten von Chromatin sind in Drosophila melanogaster konserviert. Daher ist es ein ausgezeichnetes Modell, um die Bildung und Aufrechterhaltung von Heterochromatin zuuntersuchen. Polytenisierte Zellen, wie sie in Speicheldrüsen von Larven des dritten InstarS D. melanogaster gefunden werden, bieten ein hervorragendes Werkzeug, um das Chromatin fast tausendmal verstärkt zu beobachten, und haben es forschern ermöglicht, Veränderungen in der Verteilung von Heterochromatin im Kern zu untersuchen. Obwohl die Beobachtung von Heterochromatinkomponenten direkt in Polytenchromosompräparaten durchgeführt werden kann, kann die Lokalisation einiger Proteine durch die Schwere der Behandlung verändert werden. Daher ergänzt die direkte Visualisierung von Heterochromatin in Zellen diese Art von Studie. In diesem Protokoll beschreiben wir die für dieses Gewebe verwendeten Immunfärbungstechniken, die Verwendung sekundärer fluoreszierender Antikörper und die konfokale Mikroskopie, um diese Heterochromatinaggregate genauer und detaillierter zu beobachten.

Einleitung

Seit den frühen Studien zu Emil Heitz¹gilt Heterochromatin als wichtiger Regulator zellulärer Prozesse wie Genexpression, meiotische und mitotische Trennung von Chromosomen und die Aufrechterhaltung der Genomstabilität^2,3,4.

Heterochromatin wird hauptsächlich in zwei Typen unterteilt: konstitutives Heterochromatin, das charakteristisch repetitive Sequenzen definiert, und transponierbare Elemente, die an bestimmten Chromosomenstellen wie den Telomeren und Zentromeren vorhanden sind. Diese Art von Heterochromatin wird hauptsächlich epigenetisch durch spezifische Histonmarkierungen wie die Di- oder Trimethylierung von Lysin 9 des Histons H3 (H3K9me3) und die Bindung des Heterochromatinproteins 1a (HP1a)^5,6definiert. Auf der anderen Seite lokalisiert fakultatives Heterochromatin durch die Arme des Chromosoms und besteht hauptsächlich aus entwicklungsstillierten Genen^7,8. Die Immunfärbung von Heterochromatinblöcken in Metaphasenzellen oder die Beobachtung von Heterochromatinaggregaten in Interphasenzellen hat viel Licht in das Verständnis der Bildung und Funktion heterochromatischer Regionen^{enthüllt 9}.

Die Verwendung von Drosophila als Modellsystem hat die Entwicklung wesentlicher Werkzeuge zur Untersuchung von Heterochromatin ohne den Einsatz von Elektronenmikroskopie ermöglicht¹⁰. Seit der Beschreibung der Positionseffektvariegation und der Entdeckung von Heterochromatin-assoziierten Proteinen wie HP1a und histon-posttranslationalen Modifikationen haben viele Gruppen mehrere immunhistochemische Techniken entwickelt, die eine Visualisierung dieser heterochromatischen Regionen ermöglichen^10,11.

Diese Techniken basieren auf der Verwendung spezifischer Antikörper, die Heterochromatin-assoziierte Proteine oder Histonmarkierungen erkennen. Für jeden Zelltyp und Antikörper müssen die Fixations- und Permeabilisationsbedingungen empirisch bestimmt werden. Die Bedingungen können auch variieren, wenn zusätzliche mechanische Verfahren wie Quetschtechniken verwendet werden. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von Drosophila Speicheldrüsen zur Untersuchung heterochromatischer Herde. Speicheldrüsen haben polytenisierte Zellen, die mehr als 1.000 Kopien des Genoms enthalten, so dass eine verstärkte Ansicht der meisten Chromatinmerkmale, mit Ausnahme der Satelliten-DNA und einiger heterochromatischer Regionen, die unterrepliziert sind, möglich ist. Dennoch sind Heterochromatinregionen in Polytenchromosompräparaten leicht sichtbar, aber die Squashing-Techniken können manchmal charakteristische Chromatin-gebundene Komplexe oder die Chromatin-Architektur stören. Daher kann die Immunlokalisierung von Proteinen im gesamten Speicheldrüsengewebe diese unerwünschten Effekte übertreffen. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um mehrere Chromatin-gebundene Proteine nachzuweisen, und wir haben gezeigt, dass dieses Protokoll in Kombination mit mutierten Drosophila-Beständen verwendet werden kann, um Heterochromatin-Störung zu untersuchen¹².

Protokoll

1. Dritte Instar-Larvenkultur

1. Bereiten Sie 1 Liter Standardmedien vor, indem Sie 100 g Hefe, 100 g unraffinierten Vollrohrzucker, 16 g Agar, 10 ml Propionsäure und 14 g Gelatine hinzufügen. Alle Zutaten außer der Hefe in 800 ml Leitungswasser auflösen und dann die Hefe auflösen. Autoklaven Sofort für 30 Minuten.
   1. Danach das Medium auf 60 °C abkühlen lassen und Propionsäure zu einer Endkonzentration von 0,01% hinzufügen. Lassen Sie die Flasche stehen, bis sich die Gelatine gebildet hat.
2. Um die 3o-Instar-Larvenkultur zu optimieren, sammeln Sie zunächst 5 bis 10 Tage alte Erwachsene und legen Sie 50 (25 Männchen und 25 Weibchen) in eine breite Halsflasche mit Standardmedien.
3. Stellen Sie die Flasche mit den Fliegen in einen kontrollierten Temperaturinkubator bei 25 ° C, bis die Anzahl der gelegten Eier 50 beträgt (ca. 12 Stunden für den Wildtypstamm).
4. Nachdem die Inkubationszeit vorbei ist, entfernen Sie die Erwachsenen und übertragen Sie sie in eine neue Flasche, um den Vorgang zu wiederholen. Lassen Sie die Embryonen 72 Stunden lang bei 18 °C wachsen
   HINWEIS: Weitere Informationen zu den Lagerhaltungsbedingungen für Drosophila finden Sie unter Tennessen & Thymmel¹³.

2. Larvensammlung

1. Für die Larvensammlung wählen Sie die wandernden Larven, die keine everted Spiracles haben. Nach der Eversion der Spiralen tritt die Larve in das Vorbereitungsstadium ein, während sie ausgezeichnete Polytenchromosomen behält, die für die Analyse geeignet sind. Erst nach 12 Stunden beginnen sich die Zellen der Speicheldrüse auf den programmierten Zelltod vorzubereiten^14,15.
2. Nehmen Sie fünfzehn 3° Instar-Larven und legen Sie sie in ein Wachglas, um sie zu waschen. Anschließend in eine eiskalte Kochsalzlösung oder PBS überführen (1x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO_4,2 mM KH₂PO_4,pH auf 7,4 einstellen).
3. Sezieren Sie 15 bis 30 Speicheldrüsenpaare (oder so viele wie möglich in 30 Minuten) in kaltem PBS mit Proteasehemmern unter dem stereoskopischen Mikroskop. Die Speicheldrüsen in ein 1,5 ml Röhrchen mit eiskaltem PBS überführen.
4. Einmal mit 1 ml PBS plus Proteasehemmer waschen. Warten Sie, bis das Gewebe den Boden der Röhre erreicht hat.
5. Nach dem Waschen das PBS mit einer 1000 μL Pipette entfernen. Achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu berühren.
   1. Alternativ sezieren Sie die Speicheldrüsen in 5 ml PBS, um diesen Waschschritt zu eliminieren, und fahren Sie mit Schritt 3 fort, indem Sie die Speicheldrüsen auf 0,5 ml des unten beschriebenen Ruvkun-Fixierpuffers übertragen.

3. Fixierung von Speicheldrüsengewebe

1. Nachdem Sie das PBS aus dem letzten Schritt entfernt haben, fügen Sie direkt 0,5 ml 1x Ruvkun-Fixierpuffer mit 50% Methanol (0,5 ml Methanol hinzufügen) und 2% Formaldehyd hinzu.
   HINWEIS: 2x Ruvkun Lösung ist 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM PIPES bei pH 7,4.
2. 2 Stunden bei 4 °C bei leichter Rotation inkubieren.

4. Speicheldrüsengewebe waschen

1. Führen Sie eine 5-minütige Rotationswäsche mit 1 ml Tris/Triton-Puffer durch (100 mM Tris pH 7,4, 1% Triton X-100 und 1 mM EDTA).
   HINWEIS: Warten Sie, bis das Gewebe den Boden der Röhre erreicht hat.

5. Permeabilisierung

1. Inkubieren Sie die Speicheldrüsen in 1 ml Tris / Triton X-100 (das gleiche wie oben). Für einige Proteine kann es notwendig sein, 1% β-Mercaptoethanol hinzuzufügen.
2. 2 Stunden bei 37°C bei leichtem Schütteln (300 U/min) inkubieren.

6. Konservierungsschritt (optional)

HINWEIS: Wenn Sie nicht sofort mit der Inkubation mit dem Antikörper fortfahren, bewahren Sie das Gewebe wie folgt auf.

1. Mit 1 mL_BO3 Puffer (0,01 M H₃BO₃ pH 9,2 + 0,01 M NaOH) waschen und dann in BO_{3 /10}mM DTT bei 37°C unter leichtem Schütteln (300 U/min) für 15 Minuten inkubieren.
2. Am Ende der Inkubationszeit eine Wäsche mit 1 ml_BO3-Puffer allein durchführen.
   HINWEIS: Warten Sie, bis das Gewebe den Boden der Röhre erreicht hat.
3. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu. Bewahren Sie das Gewebe in dieser Lösung bei 4 °C für bis zu 72 Stunden auf und fahren Sie dann mit dem nächsten Schritt fort. Dieser Schritt ist besonders hilfreich bei der Arbeit mit verschiedenen mutierten Stämmen, die einen verzögerten Lebenszyklus aufweisen können, so dass die Immundetektion gleichzeitig mit den Kontrollen durchgeführt werden kann.

7. Gewebeblockierung

1. Inkubieren Sie die Speicheldrüsen in 1 ml Puffer B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 mM EDTA) für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit Rotation.

8. Immunfärbung

1. Entfernen Sie alle Puffer B und fügen Sie Puffer A (PBS + 0,1% BSA) plus Antikörper von Interesse hinzu.
   HINWEIS: Wir verwenden den HP1a C1A9c (konzentrierter Antikörper) von Hybridoma Bank bis zu 1:3000. Bei der Verwendung des C1A9s (Überstand) haben wir versucht, von 1:100 bis zu einer 1:500 Verdünnung zu gehen und jede Verdünnung zwischen diesem Rang funktioniert gut) über Nacht bei 4 oC mit Rotation. An dieser Stelle ist es wichtig, dass das Schütteln keine Blasen aufwirft, die den Antikörper schädigen könnten.

9. Immunhaltiges Waschen

1. Führen Sie 3 x 15-minütige Wäschen mit Puffer B unter Rühren bei Raumtemperatur mit jeweils 1 ml durch.
2. Übertragen Sie die Drüsen zusammen mit dem sekundären Antikörper, der an ein Fluorophor gekoppelt ist, für 2 Stunden unter Rotation bei 4 oC in Puffer B (sekundärer Antikörper Alexa Fluor 568 Invitrogen wurde 1:3000 verwendet).
   1. Bedecken Sie das Röhrchen mit Aluminiumpapierfolie, um den sekundären Antikörper vor dem Licht zu schützen.
3. Führen Sie 2 x 15-minütige Waschungen bei Raumtemperatur während der Rotation mit 1 ml Puffer B durch.
4. Mit einem DNA-Marker wie Sytox (2 μL von 5 mM Stamm nehmen und in 1 ml Puffer B auflösen) oder Hoechst (1 μL 10 mg/ml Stamm nehmen und in 1 ml Puffer B auflösen) für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit Rotation inkubieren.
5. Führen Sie eine Wäsche mit Buffer B und einmal mit PBS durch, wobei jede Wäsche 10 Minuten dauert, während Sie bei Raumtemperatur rotieren.
   HINWEIS: Denken Sie daran, es vor dem Licht zu schützen.

10. Bildgebung

1. Montieren Sie die Speicheldrüsen auf einer Rutsche und machen Sie einen Pool mit einem Coverlip.
2. Legen Sie die Speicheldrüsen in die Mitte des Pools und bedecken Sie sie mit AF1 Citifluor, um die Bildung von Blasen zu vermeiden, die die viskose Flüssigkeit überall ausdehnen. Dann versiegeln Sie alle Seiten mit klarem Nagellack.
3. Unter einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop beobachten. Wenn die Probe nicht am selben Tag beobachtet wird, lagern Sie sie lichthalb bei 4 °C.
4. Verwenden Sie GraphPad Prism 6, um alle Diagramme und statistischen Analysen zu generieren.
5. Analysieren Sie die Daten der HP1a-Verteilung in Speicheldrüsen mit dem Kruskal-Wallis-Test. Die statistische Signifikanz wurde auf (p < 0,05*, < 0,01 **, < 0,001***, < 0,0001****) festgelegt.

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse der HP1a-Immunfärbung in Drosophila-Speicheldrüsen sind in Abbildung 1 dargestellt. Ein positives Ergebnis ist die Beobachtung eines Brennpunktes (Abbildung 1a) (heterochromatisches Aggregat oder Kondensat). Ein negatives Ergebnis ist kein Signal oder ein dispergiertes Signal. Manchmal kann ein Doppelsignal beobachtet werden, dh mit einem Doppelpunkt (Abbildung 1c), aber es tritt normalerweise in k...

Diskussion

Die zelluläre Funktion eukaryotischer Organismen kann die 3D-Struktur innerhalb des Kerns definieren, die durch Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Proteinen mit Chromatin und verschiedenen Molekülen einschließlich RNA unterstützt wird. In den letzten drei Jahren haben die biologischen Kondensate, die relevant waren, einschließlich Heterochromatin, eine grundlegende Rolle bei der Bestimmung der Phasentrennung gespielt, die die ausgeprägte nukleare räumliche Organisation von aktivem und repressivem Chromatin fördert <...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Axygen MCT-150-C	11351904	Marke nicht kritisch
16 % Formaldehyd	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Molekularbiologie Qualität	Roche	10735078001	Marke nicht kritisch
Vollständig, Proteaseinhibitoren Ultra EDTA Protease Inhibitoren	Merck	5892953001
Deckglas	Corning	CLS285022-200EA	22x22, Marke nicht kritisch
DTT	Sigma	d9779	Marke nicht kritisch
EDTA	Sigma	E5134	Marke nicht kritisch
EGTA			Marke nicht kritisch
Objektträger	Goldsiegel	3011	Marke nicht kritisch
H3BO3	Baker	0084-01	Marke nicht kritisch
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Produktform  Konzentrat 0,1 mL
KCl		Baker 3040-01	nicht kritisch
Methanol	Baker	9070-03	Marke nicht kritisch
NaCl	Sigma	71376	Marke nicht kritisch
Marke NaOH			nicht kritisch
Marke PIPES			Marke nicht kritisch
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1,5 mL
Tris	Milipore	648311	Marke nicht kritisch
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, Marke nicht kritisch
β-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710	25 mL, Marke nicht kritisch