Immunfluoreszierende Färbung zur Visualisierung von Heterochromatin-assoziierten Proteinen in Drosophila Speicheldrüsen

Summary

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Heterochromatin-Aggregate in Drosophila-Polyten-Zellen zu visualisieren.

Abstract

Die Visualisierung von Heterochromatin-Aggregaten durch Immunfärbung kann eine Herausforderung sein. Viele Säugetierkomponenten von Chromatin sind in Drosophila melanogaster konserviert. Daher ist es ein ausgezeichnetes Modell, um die Bildung und Aufrechterhaltung von Heterochromatin zuuntersuchen. Polytenisierte Zellen, wie sie in Speicheldrüsen von Larven des dritten InstarS D. melanogaster gefunden werden, bieten ein hervorragendes Werkzeug, um das Chromatin fast tausendmal verstärkt zu beobachten, und haben es forschern ermöglicht, Veränderungen in der Verteilung von Heterochromatin im Kern zu untersuchen. Obwohl die Beobachtung von Heterochromatinkomponenten direkt in Polytenchromosompräparaten durchgeführt werden kann, kann die Lokalisation einiger Proteine durch die Schwere der Behandlung verändert werden. Daher ergänzt die direkte Visualisierung von Heterochromatin in Zellen diese Art von Studie. In diesem Protokoll beschreiben wir die für dieses Gewebe verwendeten Immunfärbungstechniken, die Verwendung sekundärer fluoreszierender Antikörper und die konfokale Mikroskopie, um diese Heterochromatinaggregate genauer und detaillierter zu beobachten.

Introduction

Seit den frühen Studien zu Emil Heitz¹gilt Heterochromatin als wichtiger Regulator zellulärer Prozesse wie Genexpression, meiotische und mitotische Trennung von Chromosomen und die Aufrechterhaltung der Genomstabilität^2,3,4.

Heterochromatin wird hauptsächlich in zwei Typen unterteilt: konstitutives Heterochromatin, das charakteristisch repetitive Sequenzen definiert, und transponierbare Elemente, die an bestimmten Chromosomenstellen wie den Telomeren und Zentromeren vorhanden sind. Diese Art von Heterochromatin wird hauptsäc....

Protocol

1. Dritte Instar-Larvenkultur

1. Bereiten Sie 1 Liter Standardmedien vor, indem Sie 100 g Hefe, 100 g unraffinierten Vollrohrzucker, 16 g Agar, 10 ml Propionsäure und 14 g Gelatine hinzufügen. Alle Zutaten außer der Hefe in 800 ml Leitungswasser auflösen und dann die Hefe auflösen. Autoklaven Sofort für 30 Minuten.
   1. Danach das Medium auf 60 °C abkühlen lassen und Propionsäure zu einer Endkonzentration von 0,01% hinzufügen. Lassen Sie die Flasche stehen, bis sich die Gelatine gebildet hat.
2. Um die 3o-Instar-Larvenkultur zu optimieren, sammeln Sie zunächst 5 bis 10 Tage alte Erwachsene und legen Sie 50 (25 Männchen und 25 Weibchen) in....

Results

Repräsentative Ergebnisse der HP1a-Immunfärbung in Drosophila-Speicheldrüsen sind in Abbildung 1 dargestellt. Ein positives Ergebnis ist die Beobachtung eines Brennpunktes (Abbildung 1a) (heterochromatisches Aggregat oder Kondensat). Ein negatives Ergebnis ist kein Signal oder ein dispergiertes Signal. Manchmal kann ein Doppelsignal beobachtet werden, dh mit einem Doppelpunkt (Abbildung 1c), aber es tritt normalerweise in k.......

Discussion

Die zelluläre Funktion eukaryotischer Organismen kann die 3D-Struktur innerhalb des Kerns definieren, die durch Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Proteinen mit Chromatin und verschiedenen Molekülen einschließlich RNA unterstützt wird. In den letzten drei Jahren haben die biologischen Kondensate, die relevant waren, einschließlich Heterochromatin, eine grundlegende Rolle bei der Bestimmung der Phasentrennung gespielt, die die ausgeprägte nukleare räumliche Organisation von aktivem und repressivem Chromatin fördert <.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Axygen MCT-150-C	11351904	Marke nicht kritisch
16 % Formaldehyd	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Molekularbiologie Qualität	Roche	10735078001	Marke nicht kritisch
Vollständig, Proteaseinhibitoren Ultra EDTA Protease Inhibitoren	Merck	5892953001
Deckglas	Corning	CLS285022-200EA	22x22, Marke nicht kritisch
DTT	Sigma	d9779	Marke nicht kritisch
EDTA	Sigma	E5134	Marke nicht kritisch
EGTA			Marke nicht kritisch
Objektträger	Goldsiegel	3011	Marke nicht kritisch
H3BO3	Baker	0084-01	Marke nicht kritisch
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Produktform  Konzentrat 0,1 mL
KCl		Baker 3040-01	nicht kritisch
Methanol	Baker	9070-03	Marke nicht kritisch
NaCl	Sigma	71376	Marke nicht kritisch
Marke NaOH			nicht kritisch
Marke PIPES			Marke nicht kritisch
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1,5 mL
Tris	Milipore	648311	Marke nicht kritisch
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, Marke nicht kritisch
β-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710	25 mL, Marke nicht kritisch