Methodenartikel

Ein massenspektrometrie-basierter Proteomik-Ansatz für die globale und hochzuverlässige Protein-R-Methylierungsanalyse

DOI:

10.3791/62409

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28. April 2022

 ,  ,  , 
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology IRCCS (IEO), 2European School of Molecular Medicine (SEMM), c/o Campus IFOM-IEO

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Protein-Arginin (R)-Methylierung ist eine weit verbreitete posttranslationale Modifikation, die mehrere biologische Signalwege reguliert. Die Massenspektrometrie ist die beste Technologie, um das R-Methylproteom global zu profilieren, wenn es mit biochemischen Ansätzen zur modifizierten Peptidanreicherung gekoppelt ist. Der Arbeitsablauf für die hochzuverlässige Identifizierung der globalen R-Methylierung in menschlichen Zellen wird hier beschrieben.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Protein-Arginin (R)-Methylierung ist eine weit verbreitete posttranslationale Proteinmodifikation (PTM), die an der Regulation mehrerer zellulärer Signalwege beteiligt ist, einschließlich RNA-Verarbeitung, Signaltransduktion, DNA-Schadensreaktion, miRNA-Biogenese und Translation.

In den letzten Jahren hat sich dank biochemischer und analytischer Entwicklungen die Massenspektrometrie (MS)-basierte Proteomik als die effektivste Strategie zur Charakterisierung des zellulären Methylproteoms mit Single-Site-Auflösung herausgestellt. Die Identifizierung und Profilierung der In-vivo-Protein-R-Methylierung durch MS bleibt jedoch schwierig und fehleranfällig, hauptsächlich aufgrund der substöchiometrischen Natur dieser Modifikation und des Vorhandenseins verschiedener Aminosäuresubstitutionen und der chemischen Methylesterung von sauren Resten, die isobar zur Methylierung sind. Daher sind Anreicherungsmethoden zur Verbesserung der Identifizierung von R-Methylpeptiden und orthogonale Validierungsstrategien zur Reduzierung der False Discovery Rates (FDR) in Methylproteomik-Studien erforderlich.

Hier wird ein Protokoll beschrieben, das speziell für die Identifizierung und Quantifizierung von R-Methylpeptiden mit hoher Zuverlässigkeit von R-Methylpeptiden aus zellulären Proben entwickelt wurde, das metabolische Markierung von Zellen mit schwerem isotopenkodiertem Methionin (hmSILAC) und dualer Protease In-Solution Aufschluss von Ganzzellextrakt koppelt, gefolgt von Offline-High-pH Reversed Phase (HpH-RP) Chromatographie-Fraktionierung und Affinitätsanreicherung von R-Methyl-Peptiden unter Verwendung von Anti-Pan-R-Methyl-Antikörpern. Bei der hochauflösenden MS-Analyse werden die Rohdaten zunächst mit dem MaxQuant-Softwarepaket verarbeitet und die Ergebnisse dann von hmSEEKER analysiert, einer Software für die eingehende Suche nach MS-Peakpaaren, die leichten und schweren Methylpeptiden in den MaxQuant-Ausgabedateien entsprechen.

Einleitung

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Die Arginin (R)-Methylierung ist eine posttranslationale Modifikation (PTM), die etwa 1% des Säugetierproteoms1 verziert. Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs) sind die Enzyme, die die R-Methylierungsreaktion durch die Ablagerung einer oder zweier Methylgruppen an die Stickstoffatome (N) der Guanidino-Gruppe der Seitenkette von R symmetrisch oder asymmetrisch katalysieren. Bei Säugetieren können PRMTs in drei Klassen eingeteilt werden - Typ I, Typ II und Typ III - abhängig von ihrer Fähigkeit, sowohl Monomethylierung (MMA) als auch asymmetrische Dimethylierung (ADMA), MMA und symmetrische Dimethylierung (SDMA) oder nur MMA bzw. 2,3 abzuscheiden. PRMTs zielen hauptsächlich auf R-Reste ab, die sich in glycin- und argininreichen Regionen befinden, die als GAR-Motive bekannt sind, aber einige PRMTs, wie PRMT5 und CARM1, können Prolin-Glycin-Methionin-reiche (PGM) -Motive methylieren4. Die R-Methylierung hat sich als Proteinmodulator mehrerer biologischer Prozesse wie RNA-Spleißen5, DNA-Reparatur6, miRNA-Biogenese7 und Translation2 erwiesen und fördert die Erforschung dieses PTM.

Die Massenspektrometrie (MS) gilt als die effektivste Technologie zur systematischen Untersuchung der globalen R-Methylierung mit Protein-, Peptid- und Ortsauflösung. Dieses PTM erfordert jedoch einige besondere Vorsichtsmaßnahmen für seine hochzuverlässige Identifizierung durch MS. Erstens ist die R-Methylierung substöchiometrisch, wobei die unmodifizierte Form der Peptide viel häufiger ist als die modifizierten, so dass Massenspektrometer, die im DDA-Modus (Data Dependent Acquisition) arbeiten, hochintensive unmodifizierte Peptide häufiger fragmentieren als ihre methylierten Gegenstücke mit geringerer Intensität8. Darüber hinaus leiden die meisten MS-basierten Workflows für die Identifizierung von R-methylierten Stellen unter Einschränkungen auf der Ebene der bioinformatischen Analyse. Tatsächlich ist die rechnergestützte Identifizierung von Methylpeptiden anfällig für hohe False Discovery Rates (FDR), da dieses PTM isobar zu verschiedenen Aminosäuresubstitutionen (z. B. Glycin in Alanin) und chemischen Modifikationen wie der Methylesterung von Aspartat und Glutamat9 ist. Daher wurden Methoden, die auf der Isotopenmarkierung von Methylgruppen basieren, wie z.B. die Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), als orthogonale Strategien zur sicheren MS-Identifizierung von in vivo Methylierungen implementiert, wodurch die Rate falsch positiver Annotationen signifikant reduziert wird10.

Vor kurzem wurden verschiedene proteomweite Protokolle zur Untersuchung von R-methylierten Proteinen optimiert. Die Entwicklung von Antikörper-basierten Strategien zur Immunaffinitätsanreicherung von R-Methyl-Peptiden hat zur Annotation von mehreren hundert R-methylierten Stellen in menschlichen Zellen geführt11,12. Darüber hinaus berichteten viele Studien 3,13, dass die Kopplung der Antikörper-basierten Anreicherung mit Peptidtrenntechniken wie der HpH-RP-Chromatographie-Fraktionierung die Gesamtzahl der identifizierten Methylpeptide erhöhen kann.

Dieser Artikel beschreibt eine experimentelle Strategie zur systematischen und hochsicheren Identifizierung von R-methylierten Stellen in menschlichen Zellen, basierend auf verschiedenen biochemischen und analytischen Schritten: Proteinextraktion aus hmSILAC-markierten Zellen, paralleler doppelzymatischer Aufschluss mit Trypsin- und LysargiNase-Proteasen, gefolgt von HpH-RP-chromatographischer Fraktionierung von verdauten Peptiden, gekoppelt mit Antikörper-basierter Immunaffinitätsanreicherung von MMA-, SDMA-, und ADMA-haltige Peptide. Alle affinitätsangereicherten Peptide werden dann mittels hochauflösender Flüssigkeitschromatographie (LC)-MS/MS im DDA-Modus analysiert, und die MS-Rohdaten werden vom MaxQuant-Algorithmus zur Identifizierung von R-Methylpeptiden verarbeitet. Schließlich werden die MaxQuant-Ausgabeergebnisse mit hmSEEKER verarbeitet, einem selbst entwickelten Bioinformatik-Tool zur Suche nach Paaren schwerer und leichter Methylpeptide. Kurz gesagt, hmSEEKER liest und filtert Methylpeptididentifikationen aus der msms-Datei, gleicht dann jedes Methylpeptid seinem entsprechenden MS1-Peak in der allPeptides-Datei zu und durchsucht schließlich den Peak des schweren/leichten Peptid-Gegenstücks. Für jedes mutmaßliche Schwerlicht-Paar werden die Parameter Log2 H/L-Verhältnis (LogRatio), Retention Time Difference (dRT) und Mass Error (ME) berechnet, und Dubletten, die sich innerhalb benutzerdefinierter Cut-Offs befinden, werden als True Positives gekennzeichnet. Der Arbeitsablauf des biochemischen Protokolls ist in Abbildung 1 beschrieben.

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Protokoll

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1. Zellkultivierung und Proteinextraktion (Zeit: 3 - 4 Wochen erforderlich)

  1. Wachsen Sie HeLa-Zellen parallel in Medien, die entweder mit leichtem (L) bzw. schwerem (H) Methionin versorgt werden (siehe Tabelle 1 für die Medienzusammensetzung). Bei mindestens acht Zellteilungen wird ein Aliquot der Zellen aus jedem SILAC-Kanal gesammelt und der Einbautest durchgeführt.
    HINWEIS: Um die Inkorporationseffizienz zu überprüfen, testen Sie durch LC-MS / MS-Analyse, dass der Prozentsatz von schwerem Methionin (Met-4) im Heavy-Kanal so nahe wie möglich an 100% liegt. Analysieren Sie ein Aliquot von schwer markierten Zellen mittels LC-MS/MS (Einstellungen siehe Tabelle 2), und verarbeiten Sie dann die MS-Daten mit MaxQuant unter Verwendung der in Tabelle 3 angegebenen Parameter. Um die Met-4-Integration zu überprüfen, steht ein intern entwickeltes Skript unter https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/ zur Verfügung.
  2. Betrachten Sie eine starke Methionin-Einarbeitung als abgeschlossen, wenn sie >97% erreicht. Wenn jeder Kanal eine Gesamtzahl von etwa 60 x 10 6 Zellen erreicht (entsprechend etwa 40 Schalen von je 15 cm bei 85% Konfluenz für HeLa-Zellen, mit Variationen je nach Zelltyp), ernten sie sie. Sorgfältig zählen, im Verhältnis 1:1 mischen und Pellet durch Zentrifugieren bei 335 x g für 5 min bei 4 °C vermischen.
    HINWEIS: Um die richtige 1:1 L / H-Mischung zu beurteilen, behalten Sie ein Aliquot bei und lassen Sie es auf einer Scheibe eines Gels laufen, von dem bekannt ist, dass es eine hohe Häufigkeit und stark R-methyliertes Protein enthält (z. B. Fibrillarin). Wenn die Markierung erfolgreich war und eine 1:1-Mischung erreicht wurde, sollte ein Verhältnis von leichten und schweren Versionen der in der Probe vorhandenen R-methylierten Peptide im Verhältnis 1:1 vorhanden sein. Alternativ können Sie ein Aliquot der gemischten Probe beibehalten, die von LC-MS/MS analysiert werden soll, dann die MS-Daten mit MaxQuant unter Verwendung der in Tabelle 3 angegebenen Parameter verarbeiten und die Verteilung des Log2 H/L-Verhältnisses wie in Abbildung 2C dargestellt darstellen. Hier kann das Protokoll durch Schnappgefrieren des Pellets und Lagerung bei -80 °C gestoppt werden.
  3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in vier Volumen Lysepuffer (siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung des Lysepuffers) in Bezug auf das Zellpelletvolumen. Verwenden Sie beispielsweise 6 mL Lysepuffer für ein Pellet aus 120 x 10 6 Hela-Zellen (60 x 10 6 Light + 60 x 106 Heavy), was einem Volumen von 1,5 mL entspricht.
    HINWEIS: Die Proteinextraktion muss bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt werden, da Lysis Buffer das chaotrope Mittel 9 M Harnstoff enthält, der bei Eistemperatur ausfällt; Daher ist die Zugabe eines breiten Spektrums von Serin- und Cysteinproteaseinhibitoren wichtig, ebenso wie Phosphataseninhibitoren, um Proteine gleichzeitig vor proteolytischem Abbau und Dephosphorylierung zu schützen, Cocktail aus Protease und Phosphataseinhibitoren sind kommerziell als kleine Tabletten erhältlich, siehe Tabelle 1 und Materialtabelle.
  4. Beschallen Sie die Probe mit einem Mikrospitzen-Zelldisruptor-Ultraschallgerät für mindestens fünf Zyklen von 15 s ON und 30 s OFF, um einen effizienten Bruch der Zellmembranen und DNA-Freisetzung und -Scherung zu gewährleisten. Überprüfen Sie die Viskosität des Extrakts, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren. Wenn es aufgrund unvollständiger DNA-Scherung und Membransolubilisierung zu viskos ist, wiederholen Sie die Ultraschallzyklen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Probe während der Beschallung nicht überhitzt, da hohe Temperaturen Proteine schädigen können. Es ist jedoch nicht möglich, die Probe zwischen den Ultraschallzyklen auf Eis zu legen, da 9M Harnstoff vorhanden ist. Daher ist es ratsam, zwischen verschiedenen Ultraschallzyklen eine Pause von 60 s einzulegen. Vermeiden Sie außerdem die Bildung von Luftblasen während der Beschallung, da sie die Wirksamkeit der Beschallung verringern.
  5. Zentrifugieren Sie den Extrakt bei 3.000 x g für 10 min bei RT, um die Ablagerungen zu pelletieren und den Überstand in ein neues 15-ml-Röhrchen zu überführen.
  6. Messen Sie den Proteingehalt des Extrakts mit einem kolorimetrischen Assay wie Bradford oder Bicinchoninsäure (BCA)14,15. Eine optimale Ausgangsmenge an Proteinextrakt für dieses Protokoll liegt zwischen 20-30 mg.
    HINWEIS: Lysepuffer, die hochkonzentrierten Harnstoff enthalten, sind sowohl mit dem Bradford- als auch mit dem BCA-Quantifizierungstest kompatibel. Andere Arten von Lysepuffern, wie z. B. solche mit hoher Konzentration an Natriumdodecylsulfat (SDS), sind nicht mit Bradford kompatibel.

2.Lysat  Verdauung (indikative Zeit benötigt 2 Stunden)

  1. Die Reduktion der Thiolgruppe (-SH) von Proteinen wird unter Verwendung einer Stammlösung von Dithiothreitol (DTT), gelöst in Reinstwasser mit einer Endkonzentration von 4,5 mM, durchgeführt und die Reaktion 30 min bei 55 °C laufen lassen.
    HINWEIS: Es ist möglich, 1 M Standard-DTT-Lösung herzustellen und bis zu 1 Monat bei -20 °C zu lagern, wobei nur die für jeden Versuch benötigten Aliquots aufgetaut werden. Alternativ kann das Sulfhydryl-Reduktionsmittel Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin (TCEP) verwendet werden, um eine Reduktion von -SH-Gruppen durchzuführen; insbesondere bei Langzeitlagerung von Proteinen ist TCEP ohne Metallchelate wie EGTA im Puffer deutlich stabiler als DTT, während DTT stabiler ist, wenn Metallchelate vorhanden sind16.
  2. Die Alkylierung der Thiolgruppe (-SH) von Proteinen wird durch Zugabe von Iodacetamid (IAA) in einer Konzentration von 10 mM durchgeführt und 15 min bei RT im Dunkeln inkubiert. Führen Sie die Inkubation extrahierter Proteine mit IAA-Lösung im Dunkeln durch, da IAA lichtempfindlich ist.
    HINWEIS: Die IAA-Stammlösung bei 100 mM sollte vor jedem Versuch frisch zubereitet werden. Alternativ könnte Chloracetamid verwendet werden, um eine Alkylierung von -SH-Gruppen durchzuführen, insbesondere wenn das Ziel des Experiments darin besteht, das Übersprechen zwischen Methylierung und Ubiquitinierung zu analysieren, da IAA-induzierte Artefakte die Ubiquitinierungnachahmen 17.
  3. Bevor Sie mit dem Schritt der Proteinverdauung fortfahren, speichern Sie ein Aliquot des Proteinextrakts (1/1.000 des beginnenden unverdauten Lysats) für die anschließende Analyse auf SDS-PAGE Coomassie-gefärbtes Gel und Vergleich mit einer entsprechenden Probenmenge beim Aufdauen; Dieser Test dient dem Nachweis der Proteolyseeffizienz (siehe Punkt 4).
  4. Verdünnen Sie den verbleibenden Proteinextrakt mit vier Volumen von 20 mM HEPES pH 8,0, um eine endgültige Harnstoffkonzentration von 2 M zu erreichen (dies ist die Konzentration, die mit der enzymatischen Aktivität von Proteasen kompatibel ist). Die Probe wird in zwei Teile aufgeteilt: Im ersten wird Sequenzierungsgrad modifiziertes Trypsin und im zweiten Teil LysargiNase-Protease (siehe Materialtabelle) im Verhältnis 1:100 (w/w) relativ zu mg Ausgangsmaterial hinzugefügt. Über Nacht bei 37 °C in einem Thermomixer bei 600 U/min einwirken lassen, um einen enzymatischen Aufschluss zu ermöglichen.
    HINWEIS: Trypsin, das häufigste Verdauungsenzym in der Proteomik, spaltet sich am C-Terminus von R und Lysin (K) und erzeugt Peptide mit einer Ladungsverteilung, die zu Fragmentierungsspektren führt, die bei kollisionsinduzierter Dissoziation (CID) von Y-Typ-Ionen dominiert werden. LysargiNase spaltet sich am N-Terminus von R und K, spiegelt daher die Trypsin-Spaltungsspezifität wider und erzeugt Peptide, die bei CID-Fragmentierung hauptsächlich B-Typ-Ionen freisetzen. Diese kombinierte Analyse führt zu einer deutlich erhöhten Peptidsequenzabdeckung und zu einem höheren Vertrauen in die ortsspezifische Identifizierung von R-Methylierungen18.

3. Peptidreinigung (Indikationszeit benötigt 1 Stunde)

  1. Bewahren Sie ein Aliquot der verdauten Peptide beider Reaktionen auf und sammeln Sie die gleichen Volumina wie in Punkt 2.3 für den Vergleich mit SDS-PAGE Coomassie-gefärbtem Gel zur Beurteilung der Effizienz der Proteaseverdauung (siehe Punkt 4).
  2. Stoppen Sie den Aufschluss durch Ansäuern der Proben unter Zusatz von Trifluoressigsäure (TFA) auf eine Endkonzentration von 5%. Gut mischen und den pH-Wert der Proben mit einem Lackmuspapier messen (pH-Wert sollte etwa 3 betragen). Die angesäuerten Proben kurz durchwirbeln und abschleudern, bevor sie in neue 15-ml-Röhrchen überführt werden.
  3. Reinigen Sie die Proben durch zwei C18-Vac-Kartusche (Sorptionsgewicht 1 g, siehe Materialtabelle), eine für die mit Trypsin aufgeschlossene Probe und die andere für die mit LysargiNase aufgeschlossene Probe. Bereiten Sie Lösungsmittel A, Lösungsmittel B und Waschpuffer vor (siehe Tabelle 1 für die Pufferzusammensetzung).
  4. Rehydrieren Sie jede Kartusche mit 6 ml ACN 100% für 3 Mal. Danach babribrieren Sie jede Patrone nacheinander mit 3-9-18 ml Lösungsmittel A. Laden Sie die Proben (die Harze sollten gelb werden). Erneut nacheinander mit 3-9-18 mL Lösungsmittel A waschen und dann 6 mL Waschpuffer hinzufügen. Jede Säule wird in saubere 15-ml-Röhrchen überführt und die Proben mit 7 mL Lösungsmittel B eluiert. Wiederholen Sie den Elutionsschritt mit 7 ml Lösungsmittel B, für ein Endvolumen von 14 ml.
    HINWEIS: Führen Sie alle diese Schritte aus, indem Sie die Puffer und die Lösung durch die Schwerkraft durch die Spalten passieren lassen. Um den Fluss der Puffer durch die Säule zu begünstigen, drücken Sie jede Lösung langsam mit einer Spritze, um das Vakuum nachzuahmen.
  5. Sparen Sie 50 μL eluierte Peptide, 50 μL Durchfluss (FT), 50 μL der Wäsche mit Lösungsmittel A und 50 μL der letzten Wäsche für die anschließende Peptidbewertung durch SDS-PAGE (siehe Punkt 4).

4. Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE Gel (Richtzeit benötigt 2 Stunden)

  1. Lassen Sie die gesammelten Aliquots auf einem 17,5% SDS-PAGE Gel laufen und färben Sie sie mit Instant-Blu Coomassie Färbung (siehe Materialtabelle). Das erwartete Ergebnis ist in Abbildung 2A dargestellt.

5. Peptid-Lyophilisation (Indikationszeit 2 Tage)

  1. Bedecken Sie die 15-ml-Röhrchen mit den eluierten Peptiden mit Paraffinfilm, der dann mit einer 20-G-Nadel gestanzt wird, um 3-5 Löcher zu erzeugen. Legen Sie die Röhrchen für mindestens 30 min in Trockeneis, bis die Proben vollständig gefroren sind.
  2. Lyophilisieren Sie die gefrorenen Fraktionen für 48 h, ein Zeitintervall, das typischerweise ausreicht, um eine vollständige Lyophilisierung der Proben zu gewährleisten, auch wenn aufgrund der Leistung des Gefriertrockners eine gewisse Variabilität auftreten kann.
    HINWEIS: Das Experiment kann hier pausiert werden, wobei die lyophilisierten Proben bei -80 °C gelagert werden.

6. Offline-HpH-RP-chromatographische Fraktionierung von Peptiden (Richtzeit 4 Tage)

  1. Um die Peptide in 60 Fraktionen zu fraktionieren, verwenden Sie die HpH-RP-Flüssigkeitschromatographie mit einem HPLC-System, das mit einer C12-RP-HPLC-Säule (250 x 4,6 mm, 4 μm Proteo 90A) ausgestattet ist.
  2. Bereiten Sie vor dem Lauf Puffer A und Puffer B vor (die Zusammensetzung der Puffer ist in Tabelle 1 beschrieben).
  3. Filtern Sie alle Lösungen mit einem 0,22 μm Filter und entgasen Sie sie in einem Ultraschallbad für mindestens 30 min.
  4. Die lyophilisierten Peptide werden in 1 ml Puffer A gelöst. Filtern Sie die Peptide mit einer Spritze durch einen 0,45 μm-Filter aus Polytetrafluorethylen (PTFE).
  5. Stellen Sie die Fraktionierungsrate auf 1 ml / min Durchfluss ein und sammeln Sie 1 ml Fraktionen mit dem folgenden chromatographischen Gradienten: 5% B bis 30% B in 60 min; 30% B bis 60% in 2 min; 70% B für 3 min.
  6. Stellen Sie die HPLC so ein, dass an diesem Punkt die Fraktionssammlung gestoppt wird und der Gradient 5 Minuten lang bei 70% Puffer B gehalten wird, bevor die Säule mit einem schnellen Gradienten von bis zu 100% Puffer B gewaschen wird, gefolgt von einer abschließenden Wäsche (100% Puffer B für 10 Minuten).
    HINWEIS: Am Ende jedes chromatographischen Laufs die Säule immer mit 100% Puffer A für 20 Minuten ausgleichen.
  7. Beide Proben, die separat mit Trypsin und LysargiNase aufgeschlossen wurden, werden durch Off-Line-HpH-RP-chromatographische Gradienten fraktioniert, wie unter Nummer 6.5 beschrieben.
  8. Sammeln Sie für jeden chromatographischen Gradienten alle Fraktionen in einer tiefen 96-Well-Platte.
  9. Fassen Sie die vor dem Farbverlauf gesammelten Brüche zu einem einzigen Bruch mit dem Namen PRE zusammen. Verketten Sie die 60 Fraktionen aus dem HpH-RP-Flüssigkeitschromatographischen (LC) Gradienten, indem Sie sie nicht zusammenhängend zu 14 Endfraktionen zusammenfassen. Um eine solche nicht zusammenhängende Verkettung zu erhalten, poolen Sie die HpH-RP-Fraktionen nach dem folgenden Schema.
    1. Fraktion 1 (Endvolumen 5 ml): Pool 1-15-29-43-57
    2. Fraktion 2 (Endvolumen 5 ml): Pool 2-16-30-44-58
    3. Fraktion 3 (Endvolumen 5 ml): Pool 3-17-31-45-59
    4. Fraktion 4 (Endvolumen 5 ml): Pool 4-18-32-46-60
    5. Fraktion 5 (Endvolumen 4 ml): Pool 5-19-33-47
    6. Fraktion 6 (Endvolumen 4 ml): Pool 6-20-34-48
    7. Fraktion 7 (Endvolumen 4 ml): Pool 7-21-35-49
    8. Fraktion 8 (Endvolumen 4 ml): Pool 8-22-36-50
    9. Fraktion 9 (Endvolumen 4 ml): Pool 9-23-37-51
    10. Fraktion 10 (Endvolumen 4 ml): Pool 10-24-38-52
    11. Fraktion 11 (Endvolumen 4 ml): Pool 11-25-39-53
    12. Fraktion 12 (Endvolumen 4 ml): Pool 12-26-40-54
    13. Fraktion 13 (Endvolumen 4 ml): Pool 13-27-41-55
    14. Fraktion 14 (Endvolumen 4 ml): Pool 14-28-42-56
      HINWEIS: Die nicht zusammenhängende Verkettung besteht in der Kombination von frühen, mittleren und spät eluierenden Fraktionen, wodurch die Heterogenität der Peptidzusammensetzung innerhalb der gepoolten Fraktionen erhöht werden kann. Folglich wird das Peptidgemisch jeder gepoolten Fraktion effizient und mit begrenzter Co-Elution in der anschließenden Nano-Flow-Low-pH-RP-LC-Chromatographie direkt an das Massenspektrometer gekoppelt.
  10. Fassen Sie die nach dem Farbverlauf gesammelten Brüche zu einem eindeutigen Bruch mit dem Namen POST zusammen.
    HINWEIS: Durch Einbeziehung der Fraktionen PRE und POST-Gradient erhält man insgesamt 16 Fraktionen in 15-ml-Röhrchen (siehe Abbildung 3A).
  11. Decken Sie die 15-ml-Röhrchen mit Paraffinfolie ab und stanzen Sie sie mit einer 20-G-Nadel, um 3-5 Löcher zu erzeugen. Frieren Sie sie ein, indem Sie die Zentrifugenröhrchen in Trockeneis inkubieren, bis jede Fraktion vollständig gefroren ist.
  12. Lyophilisieren Sie die Fraktionen für ca. 48 h. Stellen Sie sicher, dass jede Probe vollständig getrocknet ist, bevor Sie den Gefriertrockner anhalten.
    HINWEIS: Das Experiment kann hier pausiert werden, wobei die lyophilisierten Proben bei -80 °C gelagert werden.

7. R-methylierte Peptid-Immunaffinitätsanreicherung (Indikationszeit 2 Tage)

  1. Führen Sie die sequentielle Immunaffinitätsanreicherung von modifiziertem Peptid mit Anti-Pan-R-Methylierungsantikörpern parallel durch, jedoch getrennt für die beiden Proben aus Trypsin- bzw. LysargiNase-Aufschlüssen. Der Immuno-Affinity Purification (IAP) Buffer wird von dem Unternehmen bereitgestellt, das die Anti-Pan-R-Methyl-Antikörper für die modifizierte Peptidaffinitätsanreicherung kauft (Details finden Sie in Tabellenmaterial und Reagenzien). Der IAP-Puffer ist 10x konzentriert und sollte vor Gebrauch 10-mal verdünnt werden.
    HINWEIS: Der IAP Buffer 1x kann bei -20 °C bis zu 1 Jahr gelagert werden.
  2. Zentrifugieren Sie die lyophilisierten Peptide bei 2.000 x g für 5 min bei RT, um die Peptide auf den Boden des 15-ml-Röhrchens zu schleudern. Die lyophilisierten Peptide werden mit 250 μL 1x IAP Buffer pro 15 mL Röhrchen resuspendiert und in ein 1,5 mL Low-Binding-Röhrchen überführt. Überprüfen Sie mit einem Lackmuspapier, ob der pH-Wert >6 beträgt.
  3. Bewahren Sie ein kleines Aliquot (etwa 5% des Volumens) jeder Fraktion als Eingabe für die nachfolgende MS-Analyse auf.
  4. Jede Fraktion wird in zwei Aliquots aufgeteilt, um die Immunanreicherung von asymmetrisch-dimethylierten (ADMA) und symmetrisch dimethylierten (SDMA) Peptiden parallel durchzuführen.
  5. Verwenden Sie drei Durchstechflaschen mit den ausgewählten Anti-Pan-R-methylierten Antikörpern, die an Protein-A-Agaroseperlen konjugiert sind, pro 10 mg des ursprünglichen Proteinextrakts.
  6. Bereiten Sie die richtige Menge an Antikörper vor, die mit Agaroseperlen konjugiert sind, indem Sie jede Durchstechflasche bei 2.000 x g für 30 s zentrifugieren und den Puffer aus den Perlen entfernen. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 1 ml 1x PBS, indem Sie sie bei 2.000 x g für 30 s zentrifugieren.
  7. Nach dem letzten Waschen die Perlen in 40 μL 1x PBS für jede Durchstechflasche wieder aufsetzen; Bündeln Sie sie und teilen Sie sie schließlich gleichmäßig in 16 Fraktionen (so dass jeder Fraktion 2,5 μL Antikörperperlen zugesetzt werden).
  8. Zu jedem Röhrchen 250 μL 1x IAP Buffer geben, durch Invertieren mischen und auf einem rotierenden Rad 2 h bei 4 °C inkubieren lassen.
    HINWEIS: Mischen Sie die Proben, indem Sie die 1,5-ml-Röhrchen umkehren, anstatt sie mit Mikrospitzen zu pipettieren, da dies die Perlen beschädigen oder zum Verlust führen könnte.
  9. Nach 2 h Inkubation die 1,5 ml Röhrchen mit Peptiden und pan-R-Methyl-Antikörper-konjugierten Beads bei 2.000 x g für 30 s zentrifugieren, um die Perlen zu pelletieren; die FT von jeder Fraktion in saubere 1,5 mL Low-Binding-Röhrchen überführen.
  10. Fügen Sie die an Antikörper gegen R-Monomethylierung (MMA) konjugierten Beads zu den FTs hinzu und wiederholen Sie die Schritte 7.7 bis 7.9.
  11. Während der Inkubation der Peptidproben mit den MMA-Beads werden die Fraktionen, die zuvor mit Anti-ADMA und SDMA immunpräzipitiert wurden, mit 250 μL IAP-Puffer (invertiert und nicht pipettiert) gewaschen und den Überstand bei jedem Waschgang verworfen.
  12. Wiederholen Sie die Wäsche mit LC-MS Grad H2O dreimal.
  13. Eluieren Sie die affinitätsangereicherten symmetrisch und asymmetrisch mit R-Di-methylierten Peptiden aus den Agarosegelperlen durch Zugabe von 50 μL 0,15% TFA zu jedem Röhrchen (starke Säurebedingungen denaturieren tatsächlich das Epitop, was zur Freisetzung der Antigene aus den Antikörpern führt). Lassen Sie diese Lösung 10 min bei RT stehen und drehen Sie die Röhrchen alle 2-3 Minuten um.
  14. Die erste Elution in saubere 1,5 mL Low-Binding-Röhrchen überführen und die Elution mit 50 μL 0,15% TFA wiederholen; Poolen Sie die 2 Fraktionen in einem Röhrchen.
  15. Wiederholen Sie die Schritte von 7.11 bis 7.14 für die R-monomethylierten Peptide, die mit den Anti-MMA-Antikörperperlen inkubiert wurden.

8. Entsalzung und Konzentrierung affinitätsangereicherter Methylpeptide durch C18-Mikrosäulen (Richtzeit benötigt 30 Minuten)

  1. Equilibrieren Sie mit Methanol die C18-RP-Mikrosäulen, die mit 3M Festphasen-Extraktionskartuschen für die Peptidentsalzung und -konzentration vor der MS-Analyse hergestellt wurden19.
  2. Laden Sie die Proben (entsprechend den separaten mit Immunaffinität angereicherten Fraktionen und Eingangsfraktionen) in zwei Schritten (50 μL + 50 μL auf jeder C18-Mikrosäule) auf die C18-Mikrosäulen durch Zentrifugieren bei 600 x g für 6 min.
  3. Die Mikrosäulen werden mit 55 μL Puffer A (siehe Tabelle 1 für die Pufferzusammensetzung) gewaschen, immer durch Zentrifugieren bei ca. 900 x g für 5 min.
    HINWEIS: Das Experiment kann hier pausiert werden, so dass die C18-RP-Mikrosäulen bei 4 °C bleiben, wo sie bis zu 2 Wochen gelagert werden können.

9. Zweiter enzymatischer Aufschluss (Richtzeit benötigt 3 Stunden)

  1. Die C18-RP-Mikrosäulen werden zweimal mit 55 μL Puffer A (siehe Tabelle 1 für die Pufferzusammensetzung) durch Zentrifugieren bei etwa 850 x g für 5 min gewaschen.
  2. Eluieren Sie die Peptide zweimal mit 20 μL Puffer B (siehe Tabelle 1 für die Pufferzusammensetzung) und poolen Sie die beiden Fraktionen.
  3. Trocknen Sie die eluierten Peptide in einem Vakuumkonzentrator (siehe Tabelle Material und Reagenzien für Details). In der Zwischenzeit wird die Aufschlusslösung vorbereitet, die aus 50 mM Ammoniumbicarbonat besteht, das aus einer frisch hergestellten 1 M-Stammlösung verdünnt wird (siehe Tabelle 1).
  4. Zu den jeweiligen Proben Trypsin oder LysargiNase bis zu einer Endkonzentration von 25 ng/μL geben. Jede Probe bei 37 °C für 2 h inkubieren.
  5. Fügen Sie 1 μL 5% TFA hinzu, um die Verdauung zu stoppen; Wirbeln und drehen Sie die Proben herunter.
    HINWEIS: Enzymatische Spaltung durch Trypsin kann am C-Terminus von methyliertem R und K gehemmt werden, was zu verpassten Spaltungen führt, die die Peptidlänge und -ladung erhöhen, was wiederum komplexe und unvollständige Fragmentierungsspektren erzeugt, die die Peptididentifizierung und die ortsspezifische Zuordnung von Methylierungsstellen behindern. Es wurde gezeigt, dass ein zweiter enzymatischer Aufschluss die Häufigkeit solcher verpassten Spaltungen reduzieren kann, mit verbesserter Sequenzabdeckung und Standortzuordnung20.

10. Entsalzungspeptide (Richtzeit benötigt 30 Minuten)

  1. Laden Sie die angesäuerten Peptidlösungen in neue C18-RP-Mikrosäulen, die zuvor nach den in Nummer 8 beschriebenen Schritten äquilibriert wurden.
  2. Das auf den C18-RP-Mikrosäulen geladene Peptid kann bis zur Elution zur LC-MS/MS-Analyse bei 4 °C gelagert werden.

11. Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Analyse (Indikationszeit 5 Tage)

  1. Eluieren Sie die Peptide aus den C18-RP-Mikrosäulen, indem Sie 10 μL Puffer B passieren und bei 615 x g für 5 Minuten bei RT zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal und kombinieren Sie die Eluate.
  2. Reduzieren Sie das Volumen der Eluate in einem Vakuumkonzentrator, bis sie fast trocken sind, um ein Übertrocknen zu vermeiden.
  3. Resuspendieren Sie die Peptide in 10 μL Puffer A für die LC-MS/MS-Analyse.
  4. Analysieren Sie jede Fraktion von R-Methylpeptiden mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) in einem hochauflösenden Massenspektrometer (siehe Materialtabelle), gekoppelt mit einem Nano-Flow-Ultra-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-System (UHPLC). Stellen Sie die Geräteparameter wie in Tabelle 2 beschrieben ein.
  5. Laden Sie 2 μL jeder Probe auf eine nanoanalytische Säule (einfache Sprühsäule 75 μm Innendurchmesser, 25 cm Länge), verpackt mit C18-RP-Harz (2 μm Partikelgröße).
  6. Die Proben werden mit einer Durchflussrate von 300 nL/min durch die C18 RP-Nanosäule geleitet, mit dem folgenden linearen Gradienten: 3%-30% B für 89 min, 30%-60% B für 5 min, 60%-95% B für 1 min und 95% B für 5 min.
  7. Das Massenspektrometer arbeitet im datenabhängigen Erfassungsmodus (DDA), um automatisch zwischen Vollscan-MS und MS/MS-Erfassung umzuschalten. Stellen Sie den zu analysierenden Vollscan-MS im Spektrometerdetektor mit der Auflösung R = 70.000 ein. Die fünfzehn intensivsten Peptidionen werden sequentiell auf einen Zielwert von 3 x 106 isoliert und durch eine relative Kollisionsenergie von 28% fragmentiert. Stellen Sie die maximal zulässigen Ionenakkumulationszeiten auf 20 ms für vollständige Scans und 50 ms für MS/MS ein und legen Sie den Zielwert für MSMS auf 1 x 106 fest. Die dynamische Ausschlusszeit ist auf 20 s eingestellt.

12. Ausführen der MaxQuant- und hmSEEKER-Datenanalyse

  1. Nach Abschluss der LC-MS/MS-Läufe importieren Sie die MS-Rohdaten in eine Peptidsuchmaschine, um die Methylpeptide durch wahrscheinlichkeitsbasierten Ansatz anhand der Referenzdatenbank zu identifizieren. In diesem Protokoll wurde MaxQuant Version 1.6.2.10 für unsere Analyse verwendet. MaxQuant benötigt mindestens 2 GB RAM sowie genügend Speicherplatz zum Speichern aller Rohdaten und aller Ausgabedateien.
    HINWEIS: Alle Details zur Installation und zu den Hardware- und Softwareanforderungen finden Sie in der offiziellen Dokumentation unter https://www.maxquant.org.
  2. Duplizieren Sie jede Rohdatendatei. Benennen Sie die Originale um, indem Sie "_light" an ihren Namen anhängen, und benennen Sie die Kopien dann um, indem Sie "_heavy" anhängen.
    HINWEIS: Bei hmSEEKER, dem Skript für die nachgelagerte Analyse, wird zwischen Groß- und Kleinschreibung unterschieden.
  3. Starten Sie die MaxQuant/Andromeda-Suche zur Peptididentifizierung mit den in Tabelle 3 angegebenen Einstellungen. Von den verschiedenen von MaxQuant erzeugten Ausgabedaten werden nur die Dateien allPeptides.txt und msms.txt (die sich im Unterordner combined/txt befinden) für den Postverarbeitungsschritt benötigt.
  4. Die Nachbearbeitung der MaxQuant-Ausgabedaten erfolgt durch den Algorithmus hmSEEKER. Laden Sie hmSEEKER hier herunter: https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. Das Skript ist als Jupyter-Notebook in Python 3.7 verfügbar und wird zu Testzwecken mit einem Beispiel-Dataset geliefert. Für neue Benutzer ist es ratsam, die Anaconda-Plattform (https://www.anaconda.com/products/individual) herunterzuladen und zu installieren. Die neueste Version enthält standardmäßig Python 3.8, Jupyter und alle Pakete, die zum Ausführen von hmSEEKER erforderlich sind (z. B. Scikit-learn 0.23.1).
  5. Erstellen Sie einen Ordner und speichern Sie die Dateien allPeptides.txt und msms.txt aus der MaxQuant-Ausgabe darin.
  6. Starten Sie Jupyter (über die Befehlszeile oder über den Anaconda-Navigator).
  7. Navigieren Sie zum Ordner hmSEEKER und öffnen Sie hmSEEKER.ipynb.
  8. Geben Sie im Abschnitt Eingabeparameter des Notizbuchs die Pfade zur FASTA-Datenbank und zu den Ordnern an, die die MaxQuant-Textdateien enthalten.
  9. Führen Sie den Code in jeder Zelle aus, indem Sie die Zelle auswählen und oben auf der Jupyter-Benutzeroberfläche auf die Schaltfläche Wiedergabe klicken.
  10. Das Skript erzeugt eine kommagetrennte Ausgabedatei für jedes analysierte Dataset sowie eine kombinierte Datei. Die endgültige Dublettenliste finden Sie in der Datei "[Datum]-[Uhrzeit]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv"
    (Tabelle 4 enthält eine kurze Beschreibung der Spalten in der Ausgabetabelle.)

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Ergebnisse

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Der Artikel beschreibt einen Workflow für die hochsichere Identifizierung der globalen Protein-R-Methylierung, die auf der Kombination des enzymatischen Aufschlusses des Proteinextrakts mit zwei verschiedenen Proteasen parallel basiert, gefolgt von HpH-RP-Flüssigkeitschromatographie-Fraktionierung proteolytischer Peptide und Immunaffinitätsanreicherung von R-Methyl-Peptiden mit Anti-Pan-R-Methyl-Antikörpern (Abbildung 1).

Die Zellen wurden in Gegenwart von Methion...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die hochzuverlässige Identifizierung der In-vivo-Protein -/Peptidmethylierung durch globale MS-basierte Proteomik ist aufgrund des Risikos einer hohen FDR eine Herausforderung, da während der Probenvorbereitung mehrere Aminosäuresubstitutionen und Methylesterungen auftreten, die isobar zur Methylierung sind und falsche Zuordnungen verursachen können, wenn keine orthogonalen MS-Validierungsstrategien vorhanden sind. Die substöchiometrische Natur dieses PTM erschwert die Aufgabe der globalen Methylproteomik weiter...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MM und EM sind Doktoranden an der European School of Molecular Medicine (SEMM). EM erhält ein 3-jähriges FIRC-AIRC-Stipendium (Projektcode: 22506). Globale Analysen von R-Methylproteomen in der TB-Gruppe werden durch den AIRC IG Grant (Project Code: 21834) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ammoniumbicarbonat (AMBIC)Sigma-Aldrich09830
Ammoniumpersulfat (APS)Sigma-Aldrich497363
C18 Sep-Pak Säulen vacc 6cc (1g)WasserWAT036905
kolloidale Coomassie-Färbung InstantSigma-AldrichISB1L-1L
cOmplete Mini, EDTA-freiRoche-Sigma Aldrich11836170001Protease-Inhibitor
Dialysiertes fötales Kälberserum (FBS)GIBCO ThermoFisher26400-044
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich3483-12-3
DMEM MediumGIBCO ThermoFisherangefordert  mit stabilem Glutamin und ohne Methionin
EASY-nano LC 1200 ChromatographiesystemThermoFisher
EASY-Spray HPLC SäulenThermoFisherES907
GlyceroloSigma-AldrichG5516
HeLa ZellenATCCATCC CCL-2
HEPESSigma-AldrichH3375
Jodacetamid (IAA)Sigma-Aldrich144-48-9
Jupiter C12-RP SäulePhenomenex00G-4396-E0
L-MethioninSigma-AldrichM5308Light (L) Methionin
L-Methionin-(Methyl-13C,d3)Sigma-Aldrich299154Heavy (H) Methionin
LysargiNaseMerck MilliporeEMS0008
Microtip Zelldisruptor Sonifier 250Branson
N,N,N′,N′ -Tetramethylethylendiamin (TEMED)Sigma-AldrichT9281
Penicillin-StreptomycinGIBCO ThermoFisher 15140122
PhosSTOPRoche-Sigma Aldrich4906837001Phosphatase-Hemmer
Pierce C18 SpitzenThermoFisher87782
Stechen & 0,1 % Ameisensäure (v/v) in Acetonitril, LC-MS-QualitätThermoFisher85175LC-MS Lösungsmittel B
durchstechen 0,1 % Ameisensäure (v/v) in Wasser, LC-MS QualitätThermoFisher85170LC-MS Lösungsmittel A
stechen ein Acetonitril (ACN), LC-MS GradeThermoFisher51101
Pierce  Wasser, LC-MSGrade ThermoFisher51140
PolyacrylamidSigma-Aldrich92560
Precision Plus Protein  Alle Blue Prestained Protein StandardsBio-Rad1610373
PTMScan Antikörper α-ADMACell Signaling Technology13474
PTMScan Antikörper α-MMACell Signaling Technology12235
PTMScan Antikörper α-SDMACell Signaling Technology13563
Q Exactive HF Hybrid Quadrupol-Orbitrap Masse SpektrometerThermoFisher
Sequenzierqualität modifiziertes TrypsinPromegaV5113
TrifluoressigsäureSigma-AldrichT6508
Ultimate 3000 HPLCDionex
HarnstoffSigma-AldrichU5378
Vakuumkonzentrator 5301EppendorfSpeed vac

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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