Überwachung des dynamischen Wachstums von Netzhautgefäßen im sauerstoffinduzierten Retinopathie-Mausmodell

Yuan Ma; Tao Li

doi:10.3791/62410

Method Article

Überwachung des dynamischen Wachstums von Netzhautgefäßen im sauerstoffinduzierten Retinopathie-Mausmodell

DOI:

10.3791/62410

⸱

April 2nd, 2021

Yuan Ma¹ , Tao Li¹

¹State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-Sen University

Summary

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Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Herstellung und Immunfluoreszenzfärbung von Netzhaut-Flachhalterungen und Analysen von Mäusen. Auch die Verwendung der Fluoresceinfundusangiographie (FFA) bei Mäusewelpen und die Bildverarbeitung werden ausführlich beschrieben.

Abstract

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Sauerstoff-induzierte Retinopathie (OIR) wird häufig verwendet, um abnormales Gefäßwachstum bei ischämischen Netzhauterkrankungen zu untersuchen, einschließlich Frühgeborenen-Retinopathie (ROP), proliferativer diabetischer Retinopathie (PDR) und Netzhautvenenverschluss (RVO). Die meisten OIR-Studien beobachten eine retinale Neovaskularisation zu bestimmten Zeitpunkten; Das dynamische Gefäßwachstum bei lebenden Mäusen entlang eines Zeitverlaufs, das für das Verständnis der OIR-bedingten Gefäßerkrankungen unerlässlich ist, wurde jedoch zu wenig untersucht. Hier beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Induktion des OIR-Mausmodells, heben die potenziellen Fallstricke hervor und bieten eine verbesserte Methode zur schnellen Quantifizierung von Bereichen der Vasoobliteration (VO) und Neovaskularisation (NV) mittels Immunfluoreszenzfärbung. Noch wichtiger ist, dass wir das Nachwachsen von Gefäßen bei lebenden Mäusen von P15 bis P25 überwachten, indem wir eine Fluoresceinfundusangiographie (FFA) im OIR-Mausmodell durchführten. Die Anwendung von FFA auf das OIR-Mausmodell ermöglicht es uns, den Umbauprozess während des Nachwachsens von Gefäßen zu beobachten.

Introduction

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Die retinale Neovaskularisation (RNV), definiert als ein Zustand, in dem neue pathologische Gefäße aus bestehenden Netzhautvenen entstehen, erstreckt sich normalerweise entlang der inneren Oberfläche der Netzhaut und wächst in den Glaskörper (oder unter bestimmten Bedingungen subretinalen Raum)¹. Es ist ein Kennzeichen und gemeinsames Merkmal vieler ischämischer Retinopathien, einschließlich Frühgeborenenretinopathie (ROP), Netzhautvenenverschluss (RVO) und proliferativer diabetischer Retinopathie (PDR)².

Zahlreiche klinische und experimentelle Beobachtungen haben gezeigt, dass Ischämie die Ha....

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Protocol

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Alle Verfahren, die die Verwendung von Mäusen beinhalten, wurden von der tierexperimentellen Ethikkommission des Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, China (autorisierte Nummer: 2020-082) und in Übereinstimmung mit den genehmigten Richtlinien des Animal Care and Use Committee des Zhongshan Ophthalmic Center und der Association Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research genehmigt.

1. Induktion des Maus-OIR-Modells

Verwenden Sie Mäuse mit einer geringeren Rate angeborener Fehlbildungen der Augen, z. B. C57BL / 6J-Mäuse, und paaren Sie sie in einem Ve....

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Results

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Im OIR-Mausmodell ist das wichtigste und grundlegendste Ergebnis die Quantifizierung des VO- und NV-Bereichs. Nach 5 Tagen in der Hyperoxie-Umgebung von P7 zeigte die zentrale Netzhaut der Welpen den größten Nicht-Perfusionsbereich. Unter der Stimulation der Hypoxie in weiteren 5 Tagen wurde allmählich eine retinale Neovaskularisation erzeugt, die intensiver fluoreszierte als die umgebenden normalen Gefäße. Nach P17 bildete sich das Fluoreszenzsignal der pathologischen Neovaskularisation schnell als Umbau der Netzhaut zu.......

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Discussion

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Die Anfälligkeit von Mäusen für OIR wird von vielen Faktoren beeinflusst. Die Welpen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund und Stämmen können nicht verglichen werden. Bei BALB/c-Albino-Mäusen wachsen die Gefäße schnell wieder in den VO-Bereich mit signifikant reduzierten neovaskulären Büscheln³⁸ ein, was der Forschung einige Schwierigkeiten bereitet. Bei C57BL/6-Mäusen kommt es im Vergleich zum BALB/cJ-Mausstamm^39,40 zu erhöhten Ph.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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Wir danken allen Mitgliedern unseres Labors und des Augentierlabors des Zhongshan Ophthalmic Center für ihre technische Unterstützung. Wir danken auch Prof. Chunqiao Liu für die experimentelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81670872; Peking, China), die Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Guangdong, China (Fördernummer 2019A1515011347) und ein hochrangiges Krankenhausbauprojekt des State Key Laboratory of Ophthalmology am Zhongshan Ophthalmic Center (Grant No. 303020103; Guangzhou, Provinz Guangdong, China).

....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL sterile Spritze	Solarbio	YA0550	Zur Vorbereitung von retinalen Flat Mounts und intraperitonealen Injektionen
1&mal; Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Transgen Biotech	FG701-01	Für die Präparation von Retina Flat Mounts
2 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Corning	MCT-200-C	Für die Präparation von Retina Flat Mounts
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Corning	3548	Für die Präparation von Retina Flat
Mounts Selbstklebende Objektträger	Verschiedenes		Für die Präparation von Retina Flat Mounts
Adobe Photoshop CC 2019	Adobe Inc.		Für die Bildanalyse
Kohlendioxidgas	Verschiedenes		Für das Opfer
Objektträger	Verschiedenes		Für die Präparation von retinalen flachen Halterungen
Gebogene Pinzetten	World Precision Instruments	14127	Für die Präparation von retinalen flachen Halterungen
DAPI-Färbelösung	Abcam	ab228549	Für die Markierung von Zellkernen auf retinalen flachen Halterungen
Präpariermikroskop	Olmpus	SZ61	Für die Präparation von Retinal Flat Mounts
Fluorescein-Natrium	Sigma-Aldrich	F6377	Für in vivo
Bildgebung Fluoreszenzmikroskop	Zeiss	AxioImager.Z2	Für die Aufnahme von Fluoreszenzbildern von Netzhaut-Flachhalterungen
Fluoromount-G Eindeckmedien	SüdenBiotech	0100-01	Zur Präparation von retinalen flachen Halterungen
Hydroxypropylmethylcellulose	Maya	89161	Für die in vivo Bildgebung
Isolectin B4 594 Antikörper	Invitrogen	I21413	Zur Markierung von retinalen Gefäßen auf retinalen flachen
Halterungen Mäuse C57/BL6J	GemPharmatech aus der Provinz		Für die Induktion von OIR-Modellen
Mikrodissektion Schere-gerade	Klinge World Precision Instruments	503242	Zur Vorbereitung von Netzhaut-Flachpinnetten
Nr.4 gerade Pinzetten	World Precision Instruments	501978-6	Zur Vorbereitung von retinalen flachen Halterungen
Normales Eselsserum	Abcam	ab7475	Zur Vorbereitung von retinalen flachen Halterungen
O₂ Sensor	Verschiedenes		Zur Überwachung des O₂
OxyCycler	Biospherix	A84XOV	Für die Induktion von OIR-Modellen
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma	P6148-1KG	Zur Gewebefixierung
Pentobarbital-Natrium	Verschiedenes		Für die Anästhesie
Natronkalk	Verschiedenes		Zur Aufnahme von überschüssigem CO₂ in der Sauerstoffkammer
SPECTRALIS HRA+OCT	Heidelberg	HC00500002	Für in vivo Bildgebung
SPSS Statistics 22.0	IBM		Für statistische Analysen
Tansference Decloring	Shaker Kylin-Bell	ZD-2008	Zur Vorbereitung von Retina Flat Mounts
Gewebekulturschale (Low Attachment)	Corning	3261-20EA	Zur Aufbereitung von Retina Flat Mounts
Transfer Pipetten Verschiedenes			Zur Aufbereitung von Retina Flat Mounts
Triton X-100	Sigma-Aldbsp	; SLBW6818	Für die Präparation von Retina Flat Mounts
Tropicamid	Verschiedenes		Für die in vivo Bildgebung
ZEN Imaging Software	ZEISS		Für die Bilderfassung und den Export

Jiangsu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vavvas, D. G., Miller, J. W. Chapter 26 - Basic Mechanisms of Pathological Retinal and Choroidal Angiogenesis. Retina (Fifth Edition). 1, 562-578 (2013).
Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (20....

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