Mikroinjektion von Maiszikade, Peregrinus maidis, Embryonen für die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung

Die Maiszikade, Peregrinus maidis, ist ein wirtschaftlich bedeutsamer Schädling von Mais ^1,2,3. Sie verursachen direkte physische Schäden an der Pflanze, sowohl während der Nahrungsaufnahme mit ihren stechend-saugenden Mundwerkzeugen als auch während der Fortpflanzung, wenn sie ihre Embryonen direkt in das Pflanzengewebe legen ^2,4. Trotz der vielfältigen direkten Schädigung von Nutzpflanzen haben diese Insekten den größten Einfluss auf die Pflanzengesundheit indirekt, da sie als Vektor des Maismosaikvirus (MMV) und des Maisstreifenvirus^{fungieren 5,6}. MMV ist in der Lage, sich im Körper seines P. maidis-Vektors zu vermehren, so dass das Virus in einzelnen Insekten während ihres gesamten Lebens persistieren kann, so dass sie das Virus weiterhin auf neue Wirtspflanzen übertragen können ^7,8. Die gebräuchlichsten Methoden zur Bekämpfung von P. maidis und damit der Viren, die er überträgt, sind Insektizide.

Leider hat die Misswirtschaft dieser Produkte zur Entwicklung von Resistenzen beim Zielschädling sowie zur Verschmutzung der Umwelt geführt⁹. Daher sind neue Strategien erforderlich, um die Ernteverluste durch diese Insekten-Virus-Schädlings-Kombination zu reduzieren. Frühere Arbeiten zeigten, dass RNA-Interferenz (RNAi) eine wirksame Kontrollmethode für P. maidis sein könnte, da sie auch bei der Aufnahme von doppelsträngiger RNA (dsRNA) anfällig für eine Herunterregulierung der Genexpression ^sind10. Der effektivste Weg, dsRNA auf dem Feld zu verabreichen, wäre jedoch über die Pflanzen, von denen sich die Insekten ernähren. Daher könnten Nutzpflanzen immer noch anfällig für Viren sein, die die Insekten bereits in sich tragen. Mit dem Aufkommen der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung sind neue Schädlingsbekämpfungsstrategien möglich, darunter der Cas9-basierte Gene Drive^11,12, der verwendet werden könnte, um die Größe einer Schädlingspopulation zu reduzieren oder diese Population durch Individuen zu ersetzen, die gegen die Viren resistent sind^, die sie übertragen.

Die Entwicklung und der Einsatz jeglicher Art von Gene-Drive-Systemen erfordert jedoch die Entwicklung transgener Techniken. Solche Methoden waren für die Durchführung von RNAi-Experimenten in P. maidis nicht erforderlich, da angenommen wird, dass dsRNAs und/oder siRNAs aufgrund der Effizienz von RNAi in P. maidis Zellmembranen durchdringen können ^10,13. Dies gilt nicht für die DNAs und/oder Proteine, die in der traditionellen Transgenese oder in der Cas9-basierten Genom-Editierung verwendet werden, die beide eine Vorstufe für die Erzeugung von Insekten wären, die einen Gene Drive tragen. Um eine Genom-Editierung oder andere Formen der Keimbahntransformation zu erreichen, werden diese DNAs und Proteine idealerweise während des synzytialen Blastoderm-Stadiums, bevor der Insektenembryo zellularisiert, in Embryonen mikroinjiziert. Das Timing ist entscheidend, denn das Synzytialstadium ist der früheste Teil der Entwicklung^14,15. Da die Weibchen von P. maidis ihre Eier bevorzugt in Pflanzengewebe ablegen, kann die Entnahme ausreichender Mengen präzellulärer Embryonen für Mikroinjektionen arbeitsintensiv und zeitaufwändig sein. Daher wurden neue Techniken entwickelt, um P. maidis-Embryonen vor der Zellularisierung schnell zu sammeln und zu mikroinjizieren.

1. Aufzucht von P. maidis Imagines auf Kolonieebene

1. Pflanzen Sie mindestens vier Töpfe Mais pro Woche und Aufzuchtkäfig mit 3-4 Samen pro Topf. Anbau in einer insektenfreien Umgebung.
2. Wenn die Pflanzen ~5 Wochen alt sind, stellen Sie sie in einen 30 cm x 30 cm x 60 cm großen Käfig.
3. Besorgen Sie sich eine ausreichende Menge erwachsener P. maidis (~500) aus einem Forschungslabor oder in freier Wildbahn und setzen Sie sie in einen insektensicheren Käfig mit 9-12 Maispflanzen (3-4 Töpfe).
4. Halten Sie die Kolonie in einem Inkubator für die Insektenaufzucht bei 25 °C (± 1 °C), mit mindestens 70 % Luftfeuchtigkeit und einem Lichtzyklus von 14:10.
5. Um eine alterskalibrierte Kolonie zu erzeugen, entfernen Sie alle anfänglichen erwachsenen Tiere nach vier Tagen Eiablage und lassen Sie die in den Käfig gelegten Embryonen auf natürliche Weise schlüpfen und altern.
6. Bringen Sie 5 Wochen alte P. maidis-Insekten (adulte Tiere) in frische Maispflanzen für die wöchentliche Subkultur, indem Sie sie mit einem Absauger sammeln (Abbildung 1). Lassen Sie die erwachsenen Tiere dann in einen sauberen Käfig mit frischen Maispflanzen entlassen. Um einen stetigen Nachschub an jungen Erwachsenen für Versuchszwecke aufrechtzuerhalten, bereiten Sie jede Woche frische, alterskalibrierte Käfige vor.
7. Gießen Sie die Töpfe in den Käfigen zweimal täglich. Schneiden Sie regelmäßig die Stiele ab, entfernen Sie verrottendes Pflanzenmaterial und ersetzen Sie es bei Bedarf durch frische Maistöpfe.
   HINWEIS: Bei richtiger Pflege kann eine Kolonie ~5 Wochen dauern (d.h. lange genug, damit die in den Käfig gelegten Embryonen erwachsen werden).

2. Eiablagekammer auf Agarosebasis

1. Stellen Sie Eierauffangschalen (Eiablagemedium) her, indem Sie 1 % w/v Agarose in Wasser in saubere, 100 mm x 15 mm große Petrischalen gießen. Lagern Sie das Eiablagemedium nach dem Erstarren bei 4 °C.
2. Bereiten Sie 10% w/v Saccharoselösung für die Fütterung der erwachsenen Tiere vor. Lagern Sie die Saccharoselösung bis zu einem Monat bei -20 °C.
3. Bauen Sie eine Kammer, um die Erwachsenen zu halten, indem Sie ein Loch in den Boden eines 1-Unzen-Bechers schneiden (siehe Materialtabelle) und ein Sieb für den Luftaustausch über das Loch kleben (Abbildung 2).
4. Schneiden Sie Kunststoff-Paraffinwachsfolie in 5 cm x 5 cm große Quadrate; Legen Sie für jede Tasse 2 Quadrate beiseite.
5. Sammle ~15 1 Woche alte erwachsene Weibchen aus einer alterskalibrierten P. maidis-Kolonie. Um Weibchen auszuwählen, untersuchen Sie die ventrale Seite des Abdomens und suchen Sie nach dem Ovipositor, der typischerweise dunkler ist als der Rest des Abdomens (Abbildung 3). Bewahren Sie erwachsene Tiere bis zu einer Stunde in einer konischen Durchstechflasche mit einem Fassungsvermögen von 15 ml auf, wenn Sie mehrere Eiablagekammern einrichten. Kühlen Sie die Insekten vor dem Geschlecht kurz auf Eis und setzen Sie sie in den erwachsenen Behälter um.
   HINWEIS: Diese Untersuchung kann ohne Mikroskop durchgeführt werden. Erwachsene Weibchen, die Zeit zum Fressen und zur Paarung hatten, haben in der Regel auch einen größeren Hinterleib als erwachsene Männchen und sind fügsamer. Daher können sie leichter aus einer Käfigpopulation ausgewählt werden.
6. Übertragen Sie die Weibchen in einen Behälter für Erwachsene und versiegeln Sie den Becher mit 1 Schicht Paraffinwachsfolie, indem Sie ihn gleichmäßig auf das 3-4-fache seiner ursprünglichen Größe dehnen (Abbildung 4A, B).
7. Tragen Sie 400 μl 10 % w/v Saccharoselösung auf die Oberseite der Kunststoff-Paraffin-Wachsfilm-Versiegelung auf und fügen Sie eine zweite Schicht Kunststoff-Paraffin-Wachsfolie hinzu, wobei die Kunststoff-Paraffin-Wachsfolie genau wie oben dehnt wird (Abbildung 4C, D).
   Anmerkungen: Das Sandwich aus gestreckter Kunststoff-Paraffinwachsfolie setzt die Saccharoselösung unter Druck, was für die Fütterung von Erwachsenen sehr wichtig ist, aber die Weibchen nicht daran hindert, ihre Legeapparate bis in das Eiablagemedium zu durchstechen.
8. Legen Sie die adulte Kammer mit der Kunststoff-Paraffinwachsfolie direkt auf das Eiablagemedium auf eine Eierauffangschale und wickeln Sie die gesamte Eiablagekammer mit Frischhaltefolie ein, ohne die Luftlöcher abzudecken, da diese für den Luftaustausch benötigt werden (Abbildung 5).
9. Inkubieren Sie jede Eiablagekammer bei 25 °C mit 70 % Luftfeuchtigkeit und einem Lichtzyklus von 14:10.
10. Wechseln Sie das Sandwich aus Kunststoff-Paraffinwachsfilm und 10% w/v Saccharoselösung täglich und entfernen Sie jegliches Wasser, das sich im Becher ansammelt.

3. Embryonenentnahme und -ausrichtung in einer Umgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit

1. Richten Sie ein stereomikroskopisches Mikroinjektionssystem in einem befeuchteten Raum oder einer Haube (befeuchtete Haube; Abbildung 6) um sicherzustellen, dass die Arbeitsumgebung während des gesamten Mikroinjektionsprozesses eine Luftfeuchtigkeit von mindestens 70 % erreicht.
2. Überprüfen Sie das Eiablagemedium auf Eier nach der gewünschten Eiablagezeit. Tun Sie dies in einer befeuchteten Haube oder einer anderen feuchten Umgebung.
   HINWEIS: Die normalerweise verwendete Eiablagezeit war über Nacht von 18 Uhr bis 10 Uhr und dauerte ~16 Stunden.
3. Wenn Eier in die Agarose gelegt werden, graben Sie sie vorsichtig mit einer feinen Pinzette aus und legen Sie sie auf die Oberfläche der Agarose, um sie feucht zu halten (Abbildung 7A).
4. Kleben Sie einen Streifen doppelseitiges Klebeband von 1 mm x 15 mm auf ein Deckglas von 22 mm x 30 mm (Abbildung 7B). Legen Sie das Deckglas mit der Klebebandseite nach oben auf das Eiablagemedium (Abbildung 7C).
5. Nehmen Sie jedes einzelne Ei von der Agaroberfläche auf und bewegen Sie es mit einem feinen Pinsel auf das doppelseitige Klebeband. Entfernen Sie alle Eier, die vollständig weiß sind oder eine schwarze Färbung aufweisen. Gesunde Eier sind halbtransparent.
6. Legen Sie die bananenförmigen Eier auf die Seite, wobei das größere Ende auf das doppelseitige Klebeband geklebt wird (Abbildung 7D).
   Anmerkungen: Bewahren Sie die Eier immer in einer Umgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit auf, z. B. in einer Petrischale mit einer Schicht von 1% Agar auf dem Boden.

4. Herstellung von CRISPR-Reagenzien und Injektionsnadeln

1. Ziehen Sie Quarznadeln mit einem Mikropipettenabzieher vom Typ Flaming/Brown.
2. Fasen Sie die Quarznadeln mit einer Mikropipetten-Anfasmaschine ab.
3. Verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um gezogene Nadeln in einem durchsichtigen Behälter, z. B. einer Petrischale, zu befestigen, bis sie gebrauchsfertig sind.
4. Bereiten Sie die Injektionslösung vor, indem Sie 0,5 μl Cas9-Protein (5 μg/μl Stammlösung) und 0,5 μl sgRNA (4 μg/μl Stammlösung; siehe Materialtabelle) mit 1 μl Phenolrotpuffer in einem Endvolumen von 5 μl kombinieren. Um Partikel auszufällen, die die Nadel verstopfen könnten, die Lösung kurz vortexen und 3 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren.
5. Füllen Sie die Injektionsnadel auf und achten Sie darauf, dass die Injektionsmischung in der Nähe des sich verjüngenden Endes der Nadel belassen wird. Entfernen Sie eventuelle Blasen von der Nadelspitze.
6. Setzen Sie die hinterfüllte Nadel vorsichtig in den Nadelhalter ein und ziehen Sie den Edelstahlkragen fest, um die Nadel während der Mikroinjektion sicher an Ort und Stelle zu halten.
7. Erzeugen Sie einen zuverlässigen Fluss der Injektionslösung aus der Nadel, indem Sie mit einem feinen, angefeuchteten Pinsel sanft über die abgeschrägte Spitze streichen, während Sie mit dem Injektionssystem Luftdruckstöße an die Nadel abgeben.
   Anmerkungen: Die Nadel ist bereit für die Injektion, wenn die Injektionsmischung die Spitze in kleinen Mengen verlassen kann.

5. Mikroinjektion und Pflege nach der Injektion

1. Bereiten Sie eine Mikroinjektionsplattform vor, indem Sie eine saubere 100 mm x 15 mm große Petrischale mit 1%igem Agar füllen, um eine ebene Agarschicht zu bilden, die bündig mit der Oberseite der Schale abschließt.
2. Legen Sie ein zuvor präpariertes Deckglas mit ~25 Embryonen auf die Agarplattform (Abbildung 8A).
   Anmerkungen: Alle Injektionsschritte müssen in einer befeuchteten Haube (~70% Luftfeuchtigkeit) durchgeführt werden.
3. Überprüfen Sie den Injektionsdruck, indem Sie die Nadelspitze in einen Tropfen Wasser legen und den Injektionszyklus einleiten.
   Anmerkungen: Bei korrekter Druckeinstellung sollte sich eine kleine Menge Injektionslösung im Wasser verteilen (Abbildung 8B).
4. Führen Sie die Nadel in das größere Ende des Embryos ein, wobei Sie sich von der linken Seite des Deckglases nähern (Abbildung 8C). Geben Sie die Injektionslösung in das Ei und ziehen Sie die Nadel schnell heraus.
5. Nachdem alle Eier injiziert wurden, legen Sie das Deckglas auf die Oberfläche einer neuen 1%igen Agar-Schale und geben Sie die Schale in eine Feuchtigkeitskammer (Abbildung 9).

6. Inkubation und Schlüpfen von Embryonen

1. Die Schlupfkammer für 6 Tage in einen 25 °C heißen Inkubator stellen.
2. Übertragen Sie alle überlebenden Embryonen mit sauberem Wasser und einem feinen Pinsel in eine 35 mm x 10 mm große Petrischale, deren Boden mit wasserangefeuchtetem Filterpapier bedeckt ist. Versiegeln Sie die Petrischale mit einer Paraffinwachsfolie aus Kunststoff und halten Sie sie bei 25 °C, damit die Embryonen schlüpfen können. Beginnen Sie 6 Tage nach der Injektion mit der Überprüfung der Embryonen auf Überleben.
   HINWEIS: Die ersten Nymphen im Stadium schlüpfen um Tag 8 herum.
3. Übertragen Sie die Nymphen mit einem feinen Pinsel in eine Petrischale mit Blattresten. Decken Sie die Schüssel ab und versiegeln Sie sie mit Paraffinwachsfolie.
4. Die verschlossene Schale der Jungtiere auf Blattstecklingen 48 h bei 25 °C bebrüten.
5. Alle 2 Tage alten Nymphen aus einer Injektionsrunde mit einer feinen Bürste in einen Aufzuchtkäfig mit Maispflanzen überführen. Wenn Injizierte mit sichtbarem Phänotyp in ausreichender Anzahl wiedergefunden werden, ziehen Sie sie separat auf, um die Erholung des Zielmerkmals in der nächsten Generation zu maximieren. Andernfalls führen Sie eine Massenpaarung aller Injektoren durch.
   Anmerkungen: Legen Sie die Jungtiere vorsichtig in den Wirtel der Maispflanze, um Zuflucht zu bieten und die richtige Luftfeuchtigkeit in ihrer unmittelbaren Umgebung zu gewährleisten.
6. Ziehen Sie die Insekten unter den oben beschriebenen Bedingungen auf und achten Sie auf die richtige Temperatur, Luftfeuchtigkeit und regelmäßige Umlagerungen auf frische Maispflanzen.
7. Screenen Sie die Nachkommen auf erwartete Phänotypen. Individuen, die den gewünschten Phänotyp aufweisen, werden in ihren eigenen Käfig gesetzt, um homozygote Linien zu etablieren.

Die Eiablagekammer wurde speziell entwickelt, um es den Weibchen von P. maidis zu ermöglichen, sich während der Eiablage in einem schützenden Medium zu ernähren, aus dem ihre Eier leicht geborgen werden können. Mit dieser Methode wurden ausreichende Mengen präzellulärer Embryonen für die Mikroinjektion mit DNA, RNA und/oder Proteinen gewonnen. Ausgewachsene P. maidis-Weibchen legen ihre Eier in der Regel in das Blattgewebe der Maispflanzen, was es zu einer Herausforderung macht, in kurzer Zeit genügend Eier zu bekommen, da viel Blattsektion erforderlich ist . Die künstliche Eiablageumgebung bietet eine Lösung, um diese Probleme zu überwinden. Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, wurden in 4 Wochen 6.483 Eier von insgesamt 645 Weibchen gesammelt. Die Weibchen beginnen in der Regel nach dem 2. Tag mit der Eiablage und liefern die meisten Eier vom 4. bis zum 6. Tag. Die Eiablageaktivität verlangsamte sich an Tag 9. Jede Eiablagekammer wurde am Freitag aufgebaut und von Sonntag bis zum nächsten Sonntag auf Eier untersucht. Die Befolgung dieses Zeitplans ermöglichte es, die meisten Eizellen während der Arbeitswoche für Mikroinjektionen zu sammeln.

Die erste praktische Anwendung dieses Eiablagesystems bestand darin, die Wirksamkeit des Cas9-vermittelten Gen-Knockouts zu testen, wobei das P. maidis-Ortholog des Augenfarbengens Weiß (Pmw) als Ziel diente. Es ist bekannt, dass Mutationen in Weiß bei anderen Insektenarten zu einem erheblichen Verlust der Augenpigmentierung führen, und Weiß ist zellautonom, so dass Mutationen bei injizierten Individuen nachgewiesen werden können16,17. Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass selbst eine kleine Mutation zu einem Funktionsverlust führen kann, wurden Guide-RNAs so konzipiert, dass sie im Bereich der ATP-bindenden Kassette schneiden, die für die White-Funktion notwendig ist16. P. maidis Embryonen wurden entweder mit 20% Phenolrot (Injektionspuffer), Injektionspuffer mit Cas9 in einer Endkonzentration von 800 ng/μL (Cas9-Kontrolle) oder Cas9 in Injektionspuffer zusammen mit drei Guide-RNAs in einer Konzentration von jeweils 400 ng/μL injiziert. Die Kombination von drei Leitfäden innerhalb einer Injektionsmischung sollte die Chancen auf die Erzeugung von Mutanten weiter maximieren, sowohl durch die Erzeugung einer großen Deletion als auch durch die Kompensation der Möglichkeit, dass eine einzelne Anleitung für das Schneiden unwirksam sein könnte. Die Entwicklungsraten für jede Behandlung waren vergleichbar (Tabelle 2), wobei 50-60% der injizierten Personen Entwicklungszeichen zeigten. Die Schraffurraten für die Puffer- und Cas9-Kontrollen waren ebenfalls vergleichbar; Die Schlupfraten der Individuen, die den Drei-Guide-Mix erhielten, waren jedoch relativ niedriger. Zum jetzigen Zeitpunkt ist unklar, ob das reduzierte Überleben auf den Verlust der Weißfunktion zurückzuführen ist oder auf unbeabsichtigte Folgen des Drei-Leit-Mixes, wie z. B. Off-Target-Effekte (siehe Diskussionsabschnitt). Keines der Individuen mit vollständigem Verlust der Augenpigmentierung (d. h. vollständiger Knockout) schlüpfte jedoch, und keiner der Nachkommen der injizierten Individuen hatte weiße Augen. Die On-Target-Wirksamkeit der Cas9-basierten Mutagenese wurde auf zwei Arten verifiziert. Zuerst wurden die Injizierten auf den Verlust der Augenpigmentierung untersucht.

Von den 71 Individuen, die sich entwickelten, zeigten 23 einen gewissen Grad an Pigmentverlust (Abbildung 10), und 9 dieser Individuen schlüpften, was zu einer Knockout-Rate von ≥32 % führte. Bei beiden Kontrollbehandlungen wurde kein Verlust der Augenpigmente beobachtet. Zweitens wurden chromosomale Mutationen mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR)18 und Sequenzierung19 bestätigt. Da eine mutierte Linie nicht gefunden werden konnte, wurde genomische DNA aus Pools von Embryonen analysiert, die entweder mit der Drei-Guide-Mischung oder dem Puffer injiziert wurden. Es wird erwartet, dass die Drei-Leit-Mischung ~180 Basenpaare aus dem weißen Locus entfernt. Dies zeigt sich in den PCR-Produkten, die aus genomischer DNA amplifiziert wurden, die aus injizierten Individuen isoliert wurde, sowie an den zugehörigen Sequenzdaten, die aus diesen Produkten generiert wurden (Abbildung 11). Diese kombinierten Beweise deuten darauf hin, dass Embryonen injiziert wurden, bevor die Zellularisierung stattfand.

Abbildung 1: Aspirator. Ein effektiver Absauger kann durch den Anschluss einer Vakuumpumpe am Einlass über einen Kunststoffschlauch an einen konischen 15-ml-Kunststoffschlauch montiert werden. Etwa 0,5 cm sollten vorsichtig vom Boden des konischen Rohrs entfernt werden. Ein Wattebausch sollte in das konische Röhrchen über der Öffnung des Plastikschlauchs gelegt werden, um erwachsene P. maidis beim Sammeln aufzufangen und von der Vakuumpumpe fernzuhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Bau von Behältern für Erwachsene. (A) Die benötigten Vorräte (im Uhrzeigersinn von oben links): Bildschirm, Heißklebepistole, Rasierklinge, 1-Unzen-Behälter. (B) Ein großes Loch sollte in den Boden des 1-Unzen-Behälters geschnitten werden, und ein Quadrat des Siebs wird gerade groß genug geschnitten, um dieses Loch abzudecken. (C) Das Sieb wird dann mit Heißkleber über das Loch geklebt. (D) Sobald der Kleber ausgehärtet ist, sollte überschüssiges Netz entfernt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Geschlechtsbestimmung der adulten P. maidis. Die ventralen Seiten der männlichen (links) und weiblichen (rechts) adulten P. maidis sind dargestellt. Der Ovipositor, der über dem weiblichen Hinterleib sichtbar ist, ist der deutlichste Indikator für das Geschlecht eines Individuums. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Versiegelung von Erwachsenen in Behältern . (A) Ein 5 cm x 5 cm großes Quadrat aus Paraffinwachsfolie aus Kunststoff. (B) Die Folie sollte gleichmäßig auf das 3-4-fache ihrer ursprünglichen Größe gedehnt werden. (C) Sobald die Erwachsenen in den Behälter für Erwachsene gelegt wurden, sollte die gespannte Folie über die Öffnung gelegt werden, um die Erwachsenen zu sichern. Anschließend sollte ein 400-μl-Tropfen 10%iger w/v-Saccharoselösung auf die Folie aufgetragen werden. (D) Um einen ausreichenden Fütterungsdruck für die erwachsenen Tiere zu gewährleisten, sollte ein zweites 5 cm x 5 cm großes Quadrat aus Paraffinfolie in ähnlicher Weise gespannt und über den Saccharosetropfen gelegt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Einrichten einer Eiablagekammer. (A) Die benötigten Vorräte (im Uhrzeigersinn von oben links): Plastikfolie, ein fertiger Behälter für erwachsene Tiere (mit erwachsenen Behältern) und eine Petrischale mit 1 % Agarose (Eiablagemedium). (B) Das Behältnis für erwachsene Tiere sollte auf die Agarose gestellt werden, wobei die Kunststoff-Paraffinfolie/das 10%ige Saccharose-"Sandwich" direkt auf das Eiablagemedium gelegt wird. (C) Plastikfolie wird verwendet, um den Behälter für erwachsene Tiere am Eiablagemedium zu befestigen. Dadurch wird verhindert, dass das Medium zu schnell austrocknet. (D) Es sollte darauf geachtet werden, dass das Sieb des Behälters für Erwachsene nicht abgedeckt wird, damit der Luftaustausch fortgesetzt werden kann. (E) Schematische Darstellung der Eiablagekammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Befeuchtete Haube. Um das Injektionszielfernrohr herum wurde eine mit einem Luftbefeuchter ausgestattete Haube angebracht, um Zugluft zu minimieren und die Luftfeuchtigkeit während der Handhabung der Embryonen aufrechtzuerhalten. Klappen können über den Eingang geklappt werden, nachdem der Arbeiter an Ort und Stelle ist, um die Aufrechterhaltung der richtigen Luftfeuchtigkeit zu unterstützen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Entnahme von Embryonen zur Vorbereitung auf Injektionen . (A) Embryonen, die im Eiablagemedium abgelegt wurden. Mit einer feinen Pinzette werden Embryonen aus dem Medium entnommen und auf dessen Oberfläche platziert. (B) Ein schmaler Streifen aus doppelseitigem Klebeband von 1 mm x 15 mm auf einem Deckglas von 22 mm x 30 mm. (C) Das Deckglas kann auf das Eiablagemedium gelegt werden, um den Transfer der Embryonen von der Oberfläche des Mediums auf das Klebeband auf dem Deckglas zu erleichtern. (D) Die Embryonen von P. maidis sind bananenförmig, wobei ein Ende schmaler ist als das andere (schmales Ende mit roter Pfeilspitze angedeutet; breiteres Ende mit gelber Pfeilspitze im Beispielembryo angedeutet). Das breite Ende des Embryos sollte auf das Tape gelegt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 8: Injektion . (A) Die Injektionsplattform ist eine Petrischale, die bis zum Rand mit 1%igem Agar gefüllt ist. Das Deckglas mit einem Klebebandstreifen, der die Embryonen enthält, sollte direkt auf die Oberfläche der Injektionsplattform gelegt werden. (B) Der Injektionsdruck sollte vor der Injektion von Embryonen getestet werden, indem eine kleine Menge Injektionslösung in einen Tropfen Wasser "injiziert" wird. Diese Methode kann auch jederzeit während des Injektionsvorgangs angewendet werden, um die Nadel auf Verstopfungen zu überprüfen. (C) Embryonen sollten injiziert werden, indem die Nadel in das größere Ende des Embryos eingeführt wird. Die Injektionslösung sollte sichtbar sein, wenn die Injektion erfolgreich war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 9: Pflege nach der Injektion . (A) Sobald alle Embryonen auf einem Deckglas injiziert wurden, sollte das Deckglas in eine frische Petrischale mit 1 % Agarose gelegt werden. (B) Die Petrischale mit dem Deckglas kann dann in einer Feuchtigkeitskammer (wie der gezeigten) aufbewahrt werden, bis die Embryonen schlüpfen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 10: Pmw-Knockout-Phänotyp. (A) Altersangepasste Kontroll- und (B) Pmw-Knockout-Embryonen mit sich entwickelnden Augen, die durch schwarze Pfeilspitzen gekennzeichnet sind. Der Embryo in B ist ein Mosaik, wie ein kleiner Streifen der Pigmentierung zu sehen ist. (C) Altersangepasste Kontroll- und (D) Pmw-Knockout-Jungtiere , wobei die Einschübe einen anderen Winkel auf den Augen zeigen. Das Jungtier in D ist ebenfalls ein Mosaik. Ein weißer Pfeil zeigt auf einen Bereich im Hauptbild, der den Pigmentverlust zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 11: Pmw-Knockout-Sequenz . (A) Maßstabsgetreues Modell der Pmw-mRNA , markiert in 500-bp-Schritten, mit Angabe der Positionen der gRNA-Bindungsstellen: G1, blau; G2, gelb; G3, rosa. Alle Frame-Shift-Mutationen, die an diesem Punkt generiert werden, stören den Großteil des Übersetzungsprodukts. (B) Genomischer Kontext von gRNA-Stellen, alle in einem Exon (fett geschriebener Text). Hilfsbindungsstellen werden in den gleichen Farben wie A hervorgehoben und PAMs unterstrichen. Die Spanne beträgt ~300 bp. Die In-Frame-Übersetzung des Exons ist oben als einbuchstabige Abkürzungen in Großbuchstaben dargestellt. Markiert sind zwei Motive, die spezifisch für Augenpigmenttransporter sind. Das CDEPT-Motiv der funktionellen Walker-B-Domäne ist violett und das IHQP-Motiv der H-Schleifendomäne grün eingerahmt. Beide Domänen sind für die Funktion des ATP-Transporters von entscheidender Bedeutung. (C) Die Pmw-Zielregion wurde mittels zweier PCR-Runden amplifiziert. Das Produkt der zweiten Runde wurde an einem Gel auf Anzeichen einer Größenverschiebung untersucht, die auf die erfolgreiche Entfernung des Bereichs zwischen den Führungen zurückzuführen ist. Bahnen: L = 100 bp Leiter; 1 = PCR-Wasserkontrolle; 2 = Eingespeiste Eizellen puffern; 3-4 = zwei separate Sätze von Eiern, die mit einer Drei-Führungsmischung injiziert werden. Nur Embryonen, die die Drei-Guide-Mischung erhielten, produzierten sowohl die WT-Bande (roter Pfeil) als auch die Bande, die aus einer vollständigen Exzision resultierte (weißer Pfeil). (D) Um die Identität der unteren (weißer Pfeil) Bande zu bestätigen, wurde diese DNA gereinigt, kloniert und sequenziert. Die oberste Zeile ist die Wildtyp-Sequenz. Die anderen beiden Zeilen sind Sequenzen von zwei Klonen. Drei weitere Klone stimmten mit der unteren Sequenz überein. Die blaue Hervorhebung zeigt die Bindungsstelle von Guide 1 an, während die rosa Hervorhebung die Bindungsstelle von Guide 3 anzeigt. In beiden Allelen wurde die gesamte Region zwischen diesen beiden Leitstellen gelöscht. Abkürzungen: Pmw = Peregrinus maidis weißes Gen; gRNA = Leit-RNA; PAM = Protospacer-benachbartes Motiv; ATP = Adenosintriphosphat; PCR = Polymerase-Kettenreaktion; WT = Wildtyp; KO = K.O. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Repräsentative Eisammlungen aus der Umgebung der künstlichen Eiablage. Es werden Daten aus vier Sätzen von Eiersammelbechern angezeigt, wobei die Eierzählung am zweiten Tag nach dem Einrichten beginnt und bis zum neunten Tag läuft.

Tabelle 2: Überlebens- und Knockout-Raten aus Injektionen von 3 verschiedenen Injektionsmischungen.

Die Autoren haben nichts zu verraten.