Mikroinjektion von Maiszikade, Peregrinus maidis, Embryonen für die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung

Bisher wurde CRISPR nur bei einer Handvoll Hemipteren eingesetzt. Das hier beschriebene Protokoll könnte Forschern helfen, CRISPR und die Keimbahntransformation auch bei anderen Hemiptera-Arten anzuwenden. Dieses Protokoll wurde speziell für Insektenembryonen entwickelt, die empfindlich auf Austrocknung reagieren.

Viele Schritte des Protokolls könnten möglicherweise die Ergebnisse bei anderen Insektenarten verbessern. Die Fähigkeit, transgene Zikaden zu erzeugen, öffnet die Tür für neuartige Bekämpfungsmethoden, wie z. B. die Erzeugung von Insekten, die keine Viren mehr übertragen können. Diese Technik wird revolutionär sein, um die Genfunktion bei anderen Schädlingen wie dem westlichen Blütenthrips zu untersuchen.

Wir haben diese CRISPR-Technik für Thrips-Embryonen adaptiert – mit vielversprechenden Ergebnissen. Wir finden, dass Übung in diesem System für den Erfolg unerlässlich ist. Die hier gezeigten Methoden sollten, wenn sie routinemäßig durchgeführt werden, einen flexiblen Einsatz in einer Vielzahl von Umgebungen ermöglichen.

Um eine Kammer für die erwachsenen Peregrinus maidis-Insekten zu bauen, schneiden Sie ein Loch in den Boden eines Ein-Unzen-Bechers und kleben Sie ein Sieb über das Loch für den Luftaustausch. Für die Selektion der eine Woche alten erwachsenen weiblichen Insekten saugen Sie die Kolonie eine Stunde lang in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen ab, bevor Sie die Insekten kurz auf Eis abkühlen lassen. Identifizieren Sie die Weibchen anhand des Ovipositors, der normalerweise dunkler ist als der Rest des Abdomens, auf der ventralen Seite des Abdomens.

Übertragen Sie die Weibchen in den Becher, während sie gesammelt werden. Wenn 15 Weibchen ausgewählt wurden, versiegeln Sie den Becher mit einem fünf mal fünf Zentimeter großen Stück Paraffinwachsfilm. Tragen Sie 400 Mikroliter einer 10%igen Saccharoselösung auf die Oberseite der Folie auf und legen Sie ein zweites fünf mal fünf Zentimeter großes Stück Folie über die Lösung.

Stellen Sie die adulte Kammer auf eine Eierauffangschale, wobei die Seite der Kunststoff-Paraffinwachsfolie in direktem Kontakt mit dem Eiablagemedium steht, und wickeln Sie die gesamte Eiablagekammer mit Plastikfolie ein, ohne die Luftlöcher zu verdecken. Stellen Sie die Kammer dann auf 25 Grad Celsius mit 70% Luftfeuchtigkeit und 14 Stunden Licht, 10 Stunden Dunkelzyklus. Für die Embryonenentnahme kleben Sie nach der gewünschten Eiablagezeit einen 15 Millimeter großen Streifen doppelseitigen Klebebandes auf ein 22 x 30 Millimeter großes Deckglas und legen das Deckglas auf das Eiablagemedium der Eiablagekammer.

Bewegen Sie mit einem feinen Pinsel und einem Präpariermikroskop einzelne halbtransparente Embryonen von der Agaroberfläche auf das doppelseitige Klebeband. Wenn etwa 25 Embryonen ausgewählt wurden, ordnen Sie die bananenförmigen Embryonen auf ihren Seiten an, wobei die größeren Enden auf das Klebeband geklebt werden. Für die Mikroinjektion der Embryonen wird zunächst das Deckglas auf eine 100 x 15 Milliliter große Petrischale mit 1%igem Agar unter einem Präpariermikroskop in einer befeuchteten Haube gelegt.

Um den Injektionsdruck zu überprüfen, legen Sie die Spitze einer Quarz-Injektionsnadel in einen Tropfen Wasser und starten Sie den Injektionszyklus. Nachdem Sie die Druckeinstellung bestätigt haben, führen Sie die Nadel von der linken Seite des Deckglases in das größere Ende eines Embryos ein. Geben Sie die Injektionslösung in das Ei und ziehen Sie die Nadel schnell heraus.

Wenn alle Eizellen injiziert wurden, legen Sie das Deckglas auf die Oberfläche einer neuen 1%igen Agar-Schale und stellen Sie die Schale in eine Feuchtigkeitskammer. Übertragen Sie die überlebenden Embryonen nach sechs Tagen mit sauberem Wasser und einer feinen Bürste in eine 35 x 10 Millimeter große Petrischale mit wasserangefeuchtetem Filterpapier. Versiegeln Sie die Petrischale mit einer Paraffinwachsfolie aus Kunststoff und stellen Sie die Schlupfkammer in einen 25 Grad Celsius heißen Inkubator.

Übertragen Sie nach sechs bis acht Tagen mit einem feinen Pinsel alle aufstrebenden Nymphen des ersten Stadiums in eine Petrischale mit Blattausschnitten und versiegeln Sie die Schale mit einer Paraffinwachsfolie aus Kunststoff. Nach 48 Stunden bei 25 Grad Celsius alle zwei Tage alten Nymphen mit einer feinen Bürste in einen Aufzuchtkäfig mit Maispflanzen umpflanzen. Wenn injizierte Insekten mit sichtbarem Phänotyp in ausreichender Anzahl gefunden werden, werden diese Insekten separat in einen Käfig gesperrt, um die Erholung des Zielmerkmals in der nächsten Generation zu maximieren.

Ziehen Sie die Insekten unter den entsprechenden Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen auf, wobei Sie sie bei Bedarf regelmäßig auf frische Maispflanzen übertragen und die Nachkommen regelmäßig auf erwartete Phänotypen untersuchen, indem Sie Individuen, die den gewünschten Phänotyp aufweisen, in ihre eigenen Käfige setzen, um homozygote Linien zu etablieren. In dieser repräsentativen Analyse wurden innerhalb von vier Wochen insgesamt 6.483 Eier von insgesamt 645 Weibchen entnommen. Die Weibchen beginnen in der Regel nach zwei Tagen mit der Eiablage und liefern die meisten Eier vom vierten bis zum sechsten Tag, wobei sich die Eiablageaktivität am neunten Tag verlangsamt.

Die Injektion von Cas9 nine hat keinen Einfluss auf die Entwicklung von P.maidis, da die Entwicklungsraten für Embryonen, die mit Injektionspuffer, Injektionspuffer mit Cas9 und Injektionspuffer mit Cas9 und drei Leit-RNAs behandelt wurden, ähnlich sind. Die Schraffurraten für die Puffer- und Cas9-Steuerelemente sind ebenfalls ähnlich. Die Schlupfraten von Individuen, die den Drei-Guide-Mix erhalten, sind jedoch in der Regel relativ niedrig.

In diesem repräsentativen Experiment zeigten von den 71 Individuen, die sich entwickelten, 23 einen gewissen Grad an Pigmentverlust und neun schlüpften, was zu einer Knockout-Rate von etwa 30 % führte. Es wird erwartet, dass die Drei-Guide-Mischung etwa 180 Basenpaare aus dem weißen Locus entfernt, wie in den PCR-Produkten beobachtet wurde, die aus genomischer DNA amplifiziert wurden, die von injizierten Individuen isoliert wurde. sowie in den zugehörigen Sequenzdaten, die aus diesen Produkten generiert werden. Wir empfehlen die Verwendung von abgeschrägten Nadeln, um das Injektionstrauma zu minimieren. Wenn die Embryonen nach der Injektion undicht zu sein scheinen, untersuchen Sie Ihre Nadelspitzen, um bessere Ergebnisse zu erzielen.

Fortgesetztes Üben wird das Überleben der Embryonen erhöhen. Bisher gibt es keine Publikationen, die die Keimbahntransformation bei Hemipteren beschreiben. Wir haben dieses Protokoll jedoch verwendet, um Cas9-exprimierende Zikaden herzustellen.

Insgesamt öffnet die Fähigkeit, eine Keimbahntransformation bei Hemipteren durchzuführen, die Tür zu einer Vielzahl von genetischen Schädlingsbekämpfungsstrategien, wodurch der Einsatz von Insektiziden reduziert wird.