Dieser Artikel beschreibt die Isolierung von Aortenklappenzellen der Maus durch ein zweistufiges Kollagenase-Verfahren. Isolierte Mausklappenzellen sind wichtig für die Durchführung verschiedener Assays, wie diesen In-vitro-Verkalkungsassay, und für die Untersuchung der molekularen Wege, die zur Aortenklappenmineralisierung führen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Isolierung von interstitiellen Klappenzellen der Maus zur Untersuchung der Verkalkung der Aortenklappe in vitro
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Verkalkung von Aortenklappenzellen ist das Kennzeichen der Aortenstenose und ist mit klappenhekrose Fibrose verbunden. Valve Interstitial Cells (VICs) spielen eine wichtige Rolle im Verkalkungsprozess bei Aortenstenosen durch die Aktivierung ihres Dedifferenzierungsprogramms gegenüber osteoblastenähnlichen Zellen. Maus-VICs sind ein gutes In-vitro-Werkzeug zur Aufklärung der Signalwege, die die Mineralisierung der Aortenklappenzelle vorantreiben. Die hier beschriebene Methode, die von diesen Autoren erfolgreich eingesetzt wird, erklärt, wie man frisch isolierte Zellen erhält. Ein zweistufiges Kollagenase-Verfahren wurde mit 1 mg/ml und 4,5 mg/ml durchgeführt. Der erste Schritt ist entscheidend, um die Endothelzellschicht zu entfernen und jegliche Kontamination zu vermeiden. Die zweite Kollagenase-Inkubation soll die Migration von VICs vom Gewebe zur Platte erleichtern. Darüber hinaus wird ein Immunfluoreszenz-Färbeverfahren zur Phänotypcharakterisierung der isolierten Mausklappenzellen diskutiert. Darüber hinaus wurde der Verkalkungsassay in vitro unter Verwendung des Calciumreagenz-Messverfahrens und der Alizarinrotfärbung durchgeführt. Die Verwendung von Mausklappenzellprimialkultur ist unerlässlich, um neue pharmakologische Ziele zur Hemmung der Zellmineralisierung in vitro zu testen.
Einleitung
Die verkalkte Aortenklappenerkrankung (CAVD) ist die häufigste Herzklappenerkrankung in der westlichen Bevölkerung und betrifft fast 2,5% der älteren Menschen über 65 Jahre1. CAVD betrifft über sechs Millionen Amerikaner und ist mit Veränderungen der mechanischen Eigenschaften der Blättchen verbunden, die den normalen Blutfluss beeinträchtigen1,2. Derzeit gibt es keine pharmakologische Behandlung, um das Fortschreiten der Krankheit zu stoppen oder die Mineralregression zu aktivieren. Die einzige wirksame Therapie zur Behandlung von CAVD ist der Aortenklappenersatz durch Operation oder d....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
HINWEIS: Alle hier beschriebenen Tierverfahren wurden von der Icahn School of Medicine am Mount Sinai Institutional Core and Use Committee genehmigt.
1. Vorbereitung vor der Ventilzellisolierung von erwachsenen Mäusen
- Reinigen und sterilisieren Sie alle in Abbildung 1A gezeigten chirurgischen Instrumente, indem Sie 70% v/v Ethanol verwenden und anschließend 30 min. autoklavieren. Reinigen Sie den chirurgischen Arbeitsbereich mit 70% Ethanol.
- 500 μL Penicillin-Streptomycin zu 50 ml 10 mm HEPES hinzufügen. Bereiten Sie ein Aliquot von 50 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor. Halt....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Da murine Aortenklappen typischerweise einen Durchmesser von 1 mm haben, müssen mindestens drei Klappen gebündelt werden, um eine Million lebensfähige Zellen für verschiedene experimentelle Verfahren zu sammeln. Die verschiedenen Schritte des VIC-Isolationsprozesses sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt. Da es schwierig ist, das Klappengewebe manuell abzukratzen, ist es vorzuziehen, die durch Wirbel erzeugte Scherspannung zu verwenden, um die VECs zu e.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll der Isolierung von Mausklappenzellen für die Primärkultur vor. Drei Aortenklappen von 8 Wochen alten Mäusen wurden gepoolt, um eine ausreichende Anzahl von Zellen zu erhalten. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll die Charakterisierung des VIC-Phänotyps und den In-vitro-Mineralisierungsassay. Die Methode wurde aus dem zuvor beschriebenen Protokoll von Mathieu et al.7adaptiert.
Bei der Isolierung vo.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 3 mm Schneideschere | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-Alpha glatte Muskulatur Aktin Antikörper | abcam | ||
| Anti-Maus, Alexa Fluor 488 Konjugat | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III Reagenzienset | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | ein Kit zur Messung der Konzentration von Calcium |
| Bonn Schere | F.S.T | 14184-09 | |
| Calciumhydroxid | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Kollagenase Typ I (125 Einheiten/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra feine Pinzette | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Feine Pinzette | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M Lösung | STAMMZELLEN TECHNOLOGIEN | ||
| L-Glutamin 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mykoplasmen-Eliminierungsreagenz |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| Penecillin Streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Natriumpyruvat 100 mM | Thermofisher Scientific | ||
| Zange mit Standardmuster | F.S.T | 11000-12 | |
| Chirurgische Schere - Scharf-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0,05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
Referenzen
- Rostagno, C. Heart valve disease in elderly. World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the Amer....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
