Synthetisches Mukoviszidose-Sputummedium (SCFM2) kann in Kombination mit konfokaler Laserscanning-Mikroskopie und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung verwendet werden, um bakterielle Aggregate mit hoher Auflösung zu beobachten. Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Bewertung aggregierter Populationen während der antimikrobiellen Behandlung als Plattform für zukünftige Studien.
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Methodenartikel
Werkzeuge zur Echtzeitbewertung eines Pseudomonas aeruginosa-Infektionsmodells
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Pseudomonas aeruginosa (Pa) ist einer der häufigsten opportunistischen Erreger im Zusammenhang mit Mukoviszidose (CF). Sobald die Pa-Besiedlung etabliert ist, bildet ein großer Teil der infizierenden Bakterien Biofilme im Atemwegssputum. Pa-Biofilme, die aus CF-Sputum isoliert wurden, wachsen nachweislich in kleinen, dichten Aggregaten von ~ 10-1.000 Zellen, die räumlich organisiert sind und klinisch relevante Phänotypen wie antimikrobielle Toleranz aufweisen. Eine der größten Herausforderungen bei der Untersuchung, wie Pa-Aggregate auf die sich verändernde Sputumumgebung reagieren, ist das Fehlen ernährungsrelevanter und robuster Systeme, die die Aggregatbildung fördern. Mit einem synthetischen CF-Sputummedium (SCFM2) kann die Lebensgeschichte von Pa-Aggregaten mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) und Bildanalyse mit der Auflösung einer einzelnen Zelle beobachtet werden. Dieses In-vitro-System ermöglicht die Beobachtung von Tausenden von Aggregaten unterschiedlicher Größe in Echtzeit, drei Dimensionen und im Mikrometerbereich. Auf Individueller und Populationsebene ermöglicht die Fähigkeit, Aggregate nach Phänotyp und Position zu gruppieren, die Beobachtung von Aggregaten in verschiedenen Entwicklungsstadien und deren Reaktion auf Veränderungen in der Mikroumgebung, wie z.B. Antibiotikabehandlung, präzise zu differenzieren.
Einleitung
Pseudomonas aeruginosa (Pa) ist ein opportunistischer Erreger, der chronische Infektionen bei immungeschwächten Personen hervorruft. Bei Menschen mit der Erbkrankheit Mukoviszidose (CF) können diese Infektionen den Verlauf eines Lebens umfassen. CF verursacht den Aufbau eines viskosen, nährstoffreichen Auswurfs in den Atemwegen, der im Laufe der Zeit von einer Vielzahl mikrobieller Krankheitserreger besiedelt wird. Pa ist einer der häufigsten CF-Erreger, der die Atemwege in der frühen Kindheit besiedelt und schwer zu behandelnde Infektionen etabliert1. Pa bleibt ein signifikantes klinisches Problem und gilt als eine d....
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Protokoll
1. Synthetisches Mukoviszidosemedium (SCFM2) vorbereiten
HINWEIS: Die Vorbereitung von SCFM2 umfasst drei Hauptphasen, die unten beschrieben werden (Abbildung 2). Ausführliche Informationen und Referenzen finden Sie unter9,10,12.
Abbildung 2: Vorbereitung und Impfung des Mediums SCFM2. (A....
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Ergebnisse
Diese Arbeit beschreibt Methoden zur Beobachtung von Pa-Aggregaten mit hoher Auflösung und in einer Umgebung, die der chronischen Infektion der CF-Lunge9,10,12ähnelt. SCFM2 bietet ein In-vitro-System, das die natürliche Aggregation von Pa-Zellen in Größen fördert, die denen ähneln, die während der tatsächlichen Infektion beobachtetwurden 10. Die Anpassungsfähigkeit von SCFM2 als.......
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Diskussion
Diese Arbeit hat Methoden eingeführt, die kombiniert werden können, um bakterielle Aggregatpopulationen in Gegenwart und Abwesenheit von Antibiotikabehandlung zu untersuchen. Hochauflösendes CLSM ermöglicht die Visualisierung von Veränderungen der aggregierten Biomasse und der strukturellen Orientierung von Aggregaten in Echtzeit, wenn sie Antibiotika ausgesetzt sind. Darüber hinaus können physikalische und strukturelle Merkmale der Biomasse, die nach der Behandlung mit Antibiotika übrig bleiben, quantifiziert werden, mi.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
S.E.D wird durch Start-up-Fonds des Department of Molecular Medicine, der University of South Florida, sowie ein CFF-Forschungsstipendium (DARCH19G0), das N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) und das USF Institute on Microbiomes unterstützt. Wir danken dem Whiteley-Labor für die kontinuierliche Zusammenarbeit mit Datensätzen zu diesem Manuskript. Wir danken Dr. Charles Szekeres für die Erleichterung der FACS-Sortierung. Die Figuren wurden von A.D.G und S.E.D mit Biorender.com erstellt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Aminosäuren | |||
| Alanin | Acros Organics | 56-41-7 | |
| Arginin HCl | MP | 1119-34-2 | |
| Asparagin | Acros Organics | 56-84-8 | Hergestellt in 0,5 M NaOH |
| Cystin HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| Glutaminsäure HCl | Acros Organics | 138-15-8 | |
| Glycin | Acros Organics | 56-40-6 | |
| Histidin HCl H2O | Alfa Aesar | A17627 | |
| Isoleucin | Acros Organics | 73-32-5 | |
| Leucin | Alfa Aesar | A12311 | |
| Lysin HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
| Methionin | Acros Organics | 63-68-3 | |
| Ornithin HCl | Alfa Aesar | A12111 | |
| Phenylalanin | Acros Organics | 63-91-2 | |
| Prolin | Alfa Aesar | A10199 | |
| Serin | Alfa Aesar | A11179 | |
| Threonin | Acros Organics | 72-19-5 | |
| Tryptophan | Acros Organics | 73-22-3 | zubereitet in 0,2 m NaOH |
| Tyrosin | Alfa Aesar | A11141 | Hergestellt in 1,0 m NaOH |
| Valin | Acros Organics | 72-18-4 | |
| Antibiotikum | |||
| Carbenicillin | Alfa Aesar | J6194903 | |
| Day-of Stocks | |||
| CaCl2 * 2H2 | O Fisher Chemical | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glukose) | Fisher Chemical | 50-99-7 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) | Fisher (Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | 15-20 min bei 37 & Grad schütteln; C zum Verdampfen von Chloroform |
| FeSO4 * 7H2O | Acros Organics | 7782-63-0 | dieser Stamm entspricht 1 mg/ml, MUSS frische |
| L-Milchsäure | Alfa Aesar | L13242 | pH-Stamm auf 7 mit NaOH |
| MgCl2 * 6H2O | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| N-Acetylglucosamin | TCI | A0092 | |
| Zubereitete | |||
| Schweinemuzin | Sigma | M1778-100G | UV-sterilisieren |
| Lachssperma DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
| Fleck | |||
| Propidiumiodid | Alfa Aesar | J66764MC | |
| Salze | |||
| K2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | Feststoff direkt auf gepufferte Basis |
| KNO3 | Acros Organics | 7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | Feststoff direkt auf gepufferte Basis geben |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | Feststoff hinzufügen direkt auf gepufferte Basis |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acros Organics | 12125-02-9 | fügen Feststoffe direkt zu gepufferten |
| Basis-Verbrauchsmaterialien | |||
| hinzuKonische Röhrchen (15 mL) | Olympus plastics | 28-101 | |
| Konische Röhrchen (50 mL) | Olympus plastics | 28-106 | |
| Kulturröhrchen mit Luftstromkappe | Olympus plastics | 21-129 | |
| 35 mm Vierkammer-Glasbodenschale | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani (LB) Bouillon | Genessee Scientific | 11-118 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Fisher Bioreagents | BP2944100 | |
| Pipettenspitzen (p200) | Olympus Kunststoffe | 23-150RL | |
| Pipettenspitzen (p1000) | Olympus Kunststoffe | 23-165RL | |
| Serologische Pipetten (5 mL) | Olympus Kunststoffe | 12-102 | |
| Serologische Pipetten (25 mL) | Olympus Kunststoffe | 12-106 | |
| Serologische Pipetten (50 mL) | Olympus plastics | 12-107 | |
| Reinstwasser (RNase/DNase-frei); Nanoreinstwasser | Genessee Scientific | 18-194 | Nanoreines Wasser zur Herstellung von Lösungen in Tabelle 1 |
| Spritzen (10 mL) | BD | 794412 | |
| Spritzen (50 mL) | BD | 309653 | |
| 0,22 mm PES-Spritzenfilter | Olympus plastics | 25-244 | |
| PS Küvette semi-mico | Olympus Kunststoffe | 91-408 | |
| Software | |||
| Biorender | Zur Vorbereitung der Figuren | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| Imaris | Bitplane | Version 9.6 | |
| Zen Schwarz | |||
| Ausstattung | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| LSM 880 konfokales Laser-Scanning-Mikroskop | Zeiss |
Referenzen
- Ramsay, K. A., et al. The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).
- Bessonova, L., et al. Data....
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Nachdrucke und Genehmigungen
