Methodenartikel

Profilierung flüchtiger Verbindungen in schwarzen Johannisbeerfrüchten mittels Headspace-Festphasen-Mikroextraktion gekoppelt an Gaschromatographie-Massenspektrometrie

DOI:

10.3791/62421

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9. Juni 2021

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1Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Campus de Teatinos, Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora”, Universidad de Málaga-Consejo Superior de Investigaciones Científicas

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Eine Headspace-Festphasen-Mikroextraktions-Gaschromatographie-Plattform wird hier für eine schnelle, zuverlässige und halbautomatische Identifizierung und Quantifizierung flüchtiger Stoffe in reifen Johannisbeerfrüchten beschrieben. Diese Technik kann verwendet werden, um das Wissen über das Fruchtaroma zu erweitern und Sorten mit verbessertem Geschmack für den Zweck der Züchtung auszuwählen.

Zusammenfassung

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Es besteht ein zunehmendes Interesse an der Messung flüchtiger organischer Verbindungen (VOC), die von reifen Früchten emittiert werden, um Sorten oder Sorten mit verbesserten organoleptischen Eigenschaften zu züchten und damit die Verbraucherakzeptanz zu erhöhen. Metabolomplattformen mit hohem Durchsatz wurden kürzlich entwickelt, um eine breite Palette von Metaboliten in verschiedenen Pflanzengeweben zu quantifizieren, einschließlich Schlüsselverbindungen, die für den Geschmack und die Aromaqualität von Früchten verantwortlich sind (Volatilomics). Eine Methode unter Verwendung der Headspace-Festphasenmikroextraktion (HS-SPME) in Verbindung mit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) wird hier zur Identifizierung und Quantifizierung von VOCs beschrieben, die von reifen Johannisbeerfrüchten emittiert werden, einer Beere, die wegen ihres Geschmacks und ihrer gesundheitlichen Vorteile sehr geschätzt wird.

Reife Früchte von Johannisbeerpflanzen (Ribes nigrum) wurden geerntet und direkt in flüssigem Stickstoff eingefroren. Nach der Gewebehomogenisierung zu einem feinen Pulver wurden die Proben aufgetaut und sofort mit Natriumchloridlösung vermischt. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand in ein Headspace-Glasfläschchen mit Natriumchlorid überführt. VOCs wurden dann unter Verwendung einer Festphasen-Mikroextraktionsfaser (SPME) und eines Gaschromatographen extrahiert, der mit einem Ionenfallen-Massenspektrometer gekoppelt war. Die flüchtige Quantifizierung wurde an den resultierenden Ionenchromatogrammen durchgeführt, indem der Peakbereich integriert wurde, wobei ein spezifisches m/z-Ion für jedes VOC verwendet wurde. Die korrekte VOC-Annotation wurde durch den Vergleich von Retentionszeiten und Massenspektren reiner kommerzieller Standards bestätigt, die unter den gleichen Bedingungen wie die Proben laufen. Mehr als 60 VOCs wurden in reifen schwarzen Johannisbeerfrüchten identifiziert, die an kontrastierenden europäischen Standorten angebaut wurden. Unter den identifizierten VOCs können wichtige Aromastoffe wie Terpenoide und C6-flüchtige Stoffe als Biomarker für die Qualität der schwarzen Johannisbeerfrüchte verwendet werden. Darüber hinaus werden Vor- und Nachteile der Methode diskutiert, einschließlich möglicher Verbesserungen. Darüber hinaus wurde die Verwendung von Kontrollen zur Chargenkorrektur und Minimierung der Driftintensität hervorgehoben.

Einleitung

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Geschmack ist ein wesentliches Qualitätsmerkmal für jede Frucht, beeinflusst die Verbraucherakzeptanz und damit die Marktfähigkeit erheblich. Die Geschmackswahrnehmung beinhaltet eine Kombination des Geschmacks- und geruchssystems und hängt chemisch von der Anwesenheit und Konzentration einer breiten Palette von Verbindungen ab, die sich in essbaren Pflanzenteilen ansammeln oder im Falle von VOCs von den reifen Früchten emittiert werden1,2. Während sich die traditionelle Züchtung auf agronomische Merkmale wie Ertrag und Schädlingsresistenz konzentriert hat, wurde die Verbesserung der Fruchtqualitätsmerkmale, einschließlich des Geschmacks, aufgrund der genetischen Komplexität und der Schwierigkeit, diese Eigenschaften richtig zu phänotypisieren, lange vernachlässigt, was zu Unzufriedenheit der Verbraucher führte3,4. Jüngste Fortschritte bei metabolomischen Plattformen waren erfolgreich bei der Identifizierung und Quantifizierung von Schlüsselverbindungen, die für den Geschmack und das Aroma von Früchten verantwortlich sind5,6,7,8. Darüber hinaus ermöglicht die Kombination von Metabolitenprofilen mit genomischen oder transkriptomischen Werkzeugen die Aufklärung der Genetik, die dem Fruchtgeschmack zugrunde liegt, was wiederum Züchtungsprogrammen helfen wird, neue Sorten mit verbesserten organoleptischen Eigenschaften zu entwickeln2,4,9,10,11,12,13,14.

Schwarze Johannisbeeren (Ribes nigrum) beeren werden wegen ihres Geschmacks und ihrer ernährungsphysiologischen Eigenschaften sehr geschätzt und werden in den gemäßigten Zonen Europas, Asiens und Neuseelands weit verbreitet angebaut15. Der größte Teil der Produktion wird für Lebensmittel und Getränke verarbeitet, die in den nordischen Ländern sehr beliebt sind, hauptsächlich aufgrund der organoleptischen Eigenschaften der Beeren. Die intensive Farbe und der Geschmack der Früchte sind das Ergebnis einer Kombination von Anthocyanen, Zuckern, Säuren und VOCs, die in den reifen Früchten vorhanden sind16,17,18. Die Analyse der flüchtigen Stoffe aus schwarzen Johannisbeeren geht auf die 1960er Jahre zurück19,20,21. In jüngerer Zeit haben sich mehrere Studien auf VOCs für schwarze Johannisbeeren konzentriert, wichtige Verbindungen für die Wahrnehmung des Fruchtaromas identifiziert und die Auswirkungen von Genotyp, Umwelt oder Lager- und Verarbeitungsbedingungen auf den VOC-Gehalt bewertet5,17,18,22,23.

Aufgrund seiner zahlreichen Vorteile ist HS-SPME/GC-MS24,25 die Technik der Wahl für die flüchtige Profilierung mit hohem Durchsatz. Eine Kieselsäurefaser, die mit einer polymeren Phase beschichtet ist, ist auf einer Spritzenvorrichtung montiert, die die Adsorption der flüchtigen Stoffe in der Faser ermöglicht, bis eine Gleichgewichtsphase erreicht ist. Die Headspace-Extraktion schützt die Faser vor den in der Matrix enthaltenen nichtflüchtigen Verbindungen24. SPME kann erfolgreich eine große Anzahl von VOCs isolieren, die in sehr unterschiedlichen Konzentrationen vorhanden sind (Teile pro Milliarde bis Teile pro Million)25. Darüber hinaus handelt es sich um eine lösungsmittelfreie Technik, die eine begrenzte Probenverarbeitung erfordert. Weitere Vorteile von HS-SPME sind die einfache Automatisierung und die relativ geringen Kosten.

Sein Erfolg kann jedoch begrenzt sein, abhängig von der chemischen Natur der VOCs, dem Extraktionsprotokoll (einschließlich Zeit, Temperatur und Salzkonzentration), der Probenstabilität und der Verfügbarkeit von ausreichend Fruchtgewebe26,27. Dieser Artikel stellt ein Protokoll für SCHWARZE JOHANNISBEER-VOCs vor, die durch HS-SPME isoliert und mittels Gaschromatographie in Verbindung mit einem Ionenfallen-Massenspektrometer analysiert werden. Es wurde ein Gleichgewicht zwischen der Menge des Pflanzenmaterials, der Probenstabilität und der Dauer der Extraktion und Chromatographie erreicht, um eine hohe Anzahl von Proben aus schwarzen Johannisbeeren verarbeiten zu können, von denen einige in dieser Studie vorgestellt wurden. Insbesondere werden VOC-Profile und/oder Chromatogramme von fünf Sorten ("Andega", "Ben Tron", "Ben Gairn", "Ben Tirran" und "Tihope") als Beispieldaten vorgestellt und diskutiert. Darüber hinaus wurde das gleiche Protokoll erfolgreich für die VOC-Messung bei anderen Fruchtbeerenarten wie Erdbeere (Fragaria x ananassa), Himbeere (Rubusidaeus) und Heidelbeere (Vaccinium spp.) in die Praxis umgesetzt.

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Protokoll

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1. Obsternte

  1. Wachsen Sie zwischen 4 und 6 Pflanzen pro Genotyp und / oder Behandlung, um ausreichend Fruchtmaterial und Variabilität zu gewährleisten.
  2. Wenn möglich, ernten Sie die Proben am selben Tag; Wenn nicht genügend Fruchtmaterial vorhanden ist, sammeln Sie Proben, die zu verschiedenen Terminen geerntet wurden.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, dass die Erntezeit (morgens, mittags, nachmittags) ungefähr identisch bleibt, da VOC-Profile durch den Tages-/circadianen Rhythmus beeinflusst werden28,29,30,31.
  3. Beurteilen Sie das Stadium der Fruchtreifung durch visuelle Beobachtung32. Poolfrüchte aus der gleichen Reifephase, da der Reifestatus die VOC-Emission stark beeinflusst. Entsorgen Sie alle beschädigten oder mit Krankheitserregern infizierten Früchte.
    HINWEIS: Um die Fruchtreife besser beurteilen zu können, kann eine Texturanalyse durchgeführt werden33. Darüber hinaus kann durch das Zählen von Tagen nach der Blüte sichergestellt werden, dass gepoolte Früchte zu einem ähnlichen Reifestadium gehören.
  4. Fügen Sie mindestens 10-15 Früchte pro biologischem Replikat (3 bis 5) für die VOC-Analyse hinzu.
    HINWEIS: Hier wurden im Sommer 2018 an zwei Standorten (Polen und Schottland) drei separate Pools mit 13-20 Früchten (biologische Replikate) von "Andega", "Ben Tron", "Ben Gairn", "Ben Tirran" und "Tihope" geerntet und direkt in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Proben wurden dann an das Labor geschickt und wie unten beschrieben verarbeitet.
  5. Nach der Ernte alle Früchte sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren und anschließend bei -80 °C bis zur Verarbeitung lagern.
    HINWEIS: Wenn möglich, können Früchte direkt nach der Ernte verarbeitet werden. In diesem Fall können frische Früchte in einem Mischer homogenisiert, gewogen und direkt analysiert werden (ab Schritt 3.1). Um jedoch zu verhindern, dass Früchte weitere Abbauprozesse nach der Ernte durchlaufen, sollte das frische Material in einem Kühler (4 °C) gelagert und so schnell wie möglich verarbeitet werden. Wenn flüssiger Stickstoff nicht richtig gehandhabt wird, kann er kalte Verbrennungen verursachen und in schlecht belüfteten Räumen Ersticken verursachen.

2. Fruchtprobe und Reagenzienvorbereitung

  1. Mahlen Sie die Früchte zu einem feinen Pulver und achten Sie darauf, sie immer mit Hilfe von flüssigem Stickstoff eingefroren zu halten. Verwenden Sie eine kryogene Mühle, eine Perlenmühle oder einen Mörtel und Stößel zur Homogenisierung. Vorkühlen Sie rostfreie Mahlgläser oder Mörtel und Stößel mit flüssigem Stickstoff, um ein Auftauen der Proben zu vermeiden.
    HINWEIS: Es ist wichtig, Proben zu einem feinen Pulver zu homogenisieren, um eine ordnungsgemäße VOC-Extraktion zu gewährleisten.
  2. 1 g gefrorenes Material (ab Schritt 2.1.) wird in einem zuvor in flüssigem Stickstoff gekühlten 5-ml-Röhrchen gewogen und das genaue Gewicht notiert. Das Material bis zum Verarbeitungsschritt 3.1 bei -80 °C belassen.
  3. Beziehen Sie "Referenz-" oder "Kontroll"-Proben in die Analyse ein, um technische Abweichungen, einschließlich VOC-Extraktion und HS-SPME/GC-MS-Leistung, zu überprüfen. Zu diesem Zweck eine Mischung aus zufällig ausgewählten Fruchtproben zusammenlegen und mindestens eine Kontrollprobe pro Tag für die VOC-Analyse einschließen. Verwenden Sie außerdem einen internen Standard, wie in Schritt 2.5 beschrieben, um die Auswirkungen der Intensitätsdrift zu minimieren.
  4. Herstellen einer 20%igen (w/v) Natriumchloridlösung in Hochleistungswasser in Flüssigchromatographie (HPLC) (im Folgenden als NaCl-Lösung bezeichnet). Lösen Sie NaCl mit Hilfe eines Magnetrührers auf; die Verfügbarkeit von 1 ml der Lösung pro Probe sicherstellen.
  5. Herstellung einer 1 ppm Lösung in HPLC-Methanol von N-Pentadecan (D32, 98%) aus dem reinen kommerziellen Standard (im Folgenden als interner Standard bezeichnet).
    HINWEIS: N-Pentadecan-d32 wird als interner Standard verwendet, und es werden 5 μL pro Probe benötigt. Methanol sollte unter einem Abzug manipuliert werden.
  6. Herstellung von 1 ppm Lösungen in HPLC-Methanol reiner kommerzieller Standards zur VOC-Identifizierung (siehe Tabelle 1 für die Liste der in dieser Studie verwendeten kommerziellen Standards).
  7. Bereiten Sie 10 ml Schraubverschluss-Headspace-Fläschchen vor, indem Sie 0,5 g NaCl in jede benötigte Durchstechflasche geben. Stellen Sie sicher, dass die Schraubverschlüsse ein Septum enthalten, das aus einem weichen Material, d. H. Silikon, mit einem dünnen Polytetrafluorethylenfilm auf der Innenseite besteht, um eine Kontamination zu vermeiden.

3. Probenvorbereitung

  1. 1 ml NaCl-Lösung in das 5-ml-Röhrchen geben, das die gewogene gefrorene Probe enthält. Schütteln Sie das Röhrchen, bis die Probe vollständig aufgetaut und homogenisiert ist.
  2. Zentrifuge bei 5000 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
  3. Übertragen Sie den Überstand mit einer 1000 μL Pipettenspitze auf das NaCl-haltige Headspace-Fläschchen. Schneiden Sie das Ende der Spitze ab, um diesen Vorgang zu erleichtern.
  4. Jeder probenhaltigen Headspace-Durchstechflasche werden 5 μL interner Standard zugesetzt.

4. HS-SPME/GC-MS Datenerfassung

  1. Legen Sie die durchstechflasche mit geschlossenem Headspace in einen GC-MS-Autosampler bei Raumtemperatur für einen automatisierten HS-SPME/GC-MS-Lauf, der in Abschnitt 4 beschrieben wird. Platzieren Sie biologische Replikate nicht an aufeinanderfolgenden Positionen im Autosampler; Verteilen Sie sie stattdessen nach dem Zufallsprinzip, um die Auswirkungen der Intensitätsdrift zu minimieren.
    HINWEIS: Ungefähr 10-12 Durchstechflaschen können gleichzeitig in den Autosampler gelegt werden, ohne die Probenstabilität zu beeinträchtigen.
  2. Die Headspace-Fläschchen 10 min bei 50 °C mit Rühren bei 17 x g vorinkubieren.
  3. Setzen Sie ein SPME-Gerät in die Durchstechflasche ein, um die Faser für 30 min bei 50 °C mit Rühren bei 17 x g dem Kopfraum für die VOC-Extraktion auszusetzen.
  4. Führen Sie die Faser für 1 min bei 250 °C im Splitless-Modus zur flüchtigen Desorption in den Injektionsanschluss ein.
  5. Reinigen Sie die Faser in einer SPME-Reinigungsstation mit Stickstoff (1 bar N2, ≥ 99,8% rein) für 5 min bei 250 °C. Verwenden Sie die Faser ca. 100x wieder.
  6. Analysieren Sie VOCs mit einem Gaschromatographen, der an ein Ionenfallen-Massenspektrometer gekoppelt ist (siehe Materialtabelle), und führen Sie eine Chromatographie unter einem konstanten Heliumfluss (He ≥ 99,9999% Reinheit) von 1 ml / min mit einer Säule durch, die Abmessungen von 60 m x 0,25 mm x 1 μm Dicke hat. Verwenden Sie ein Ofentemperaturprogramm, das bei 40 °C für 3 min isotherm ist, gefolgt von einer Rampe von 8 °C/min auf 250 °C und einer 5-minütigen Haltung bei 250 °C. Stellen Sie für die Massenspektrometrie die Temperaturen der Übertragungsleitung und der Ionenquelle auf 260 °C bzw. 230 °C ein. Stellen Sie die Ionisationsenergie auf 70 eV und den aufgezeichneten Massenbereich auf m/z 35-220 bei 6 Scans pro s.
  7. Extrahieren und analysieren Sie 1 ppm Lösungen kommerzieller Standards wie oben beschrieben. Führen Sie außerdem vor der Probendatenerfassung eine Mischung mit allen verdünnten kommerziellen Standards durch, die mit 300 μL NaCl-Lösung und 900 μL HPLC-Wasser gemischt sind, um die korrekte Kalibrierung der Ausrüstung zu überprüfen. Darüber hinaus ist in jeder Charge eine Blindprobe, die naCl-Lösung enthält, enthalten.

5. Analyse von GC-MS-Profilchromatogrammen: VOC-Identifizierung und Semi-Quantifizierung

  1. Öffnen Sie unformatierte GC-MS-Profildateien mit der vom Hersteller bereitgestellten Software. Um Verbindungen zu identifizieren, vergleichen Sie ihre Retentionszeiten und Massenspektren und Kovats linearen Retentionsindizes, die aus den Chromatogrammen der Proben bestimmt werden, mit Retentionsindizes, die aus authentischen Standards stammen. Kommentieren Sie für jeden kommerziellen Standard die Retentionszeit und die am häufigsten vorkommenden m / z-Ionen . Wählen Sie dann für jede VOC ein spezifisches m/z-Ion aus (Tabelle 1).
  2. Automatische Integration von VOC-Peaks basierend auf Standard-Retentionszeiten und ausgewählten m/z-Ionen der ausgewählten GC-MS-Rohdateien. Geben Sie dazu eine Liste für jedes VOC mit Retentionszeit und ausgewähltem m/z-Ion an. Obwohl die Software automatisch eine Peakfläche integriert, die der gleichen Retentionszeit und dem gleichen m/z-Ion entspricht wie im Sequenzaufbau, überprüfen Sie die korrekte Integration jedes Peaks und korrigieren Sie ihn gegebenenfalls manuell.
  3. Berechnen Sie die Peakfläche jeder VOC relativ zu der des internen Standards, um instrumentelle Variation und Intensitätsdrift zu minimieren.
    HINWEIS: Bei der Analyse von Früchten verschiedener Genotypen oder Wachstums- und Lagerbedingungen wird dringend empfohlen, den VOC-Gehalt relativ zum Trockengewicht der Früchte zu bestimmen, um Verdünnungseffekte aufgrund von Unterschieden im Wassergehalt auszuschließen.
  4. Zur Korrektur des Batch-Effekts normalisieren Sie den VOC-Peakbereich jeder Probe auf den entsprechenden Peakbereich in der Kontrollprobe, die im selben Durchlauf analysiert wurde.
    ANMERKUNG: Es wird eine relative VOC-Quantifizierung erhalten; Für die Zwecke des Experiments kann der VOC-Gehalt dann jedoch relativ zu jeder Probe bestimmt werden (z. B. unbehandelte Früchte, um die Auswirkungen der Lagerung auf den VOC-Gehalt zu vergleichen).

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Ergebnisse

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Für eine genaue Aromaphänotypisierung ist eine VOC-Profilierung mit hohem Durchsatz in einer großen Gruppe von Obstkulturen erforderlich, die unter verschiedenen Bedingungen oder An verschiedenen Standorten angebaut werden oder zu unterschiedlichen Genotypen gehören. Hier wird eine schnelle und teilautomatisierte HS-SPME/GC-MS-Plattform zur relativen VOC-Quantifizierung in Schwarzen Johannisbeersorten vorgestellt. Der NACHWEIS und die Identifizierung von VOC basierten auf einer Bibliothek, die entwickelt wurde, um Beeren...

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Diskussion

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Die Züchtung auf Fruchtarom wurde lange Zeit durch die komplexe Genetik und Biochemie behindert, die der Synthese flüchtiger Verbindungen zugrunde liegt, und durch das Fehlen von Technologien für eine ordnungsgemäße Phänotypisierung. Jüngste Fortschritte bei metabolomischen Plattformen, kombiniert mit genomischen Werkzeugen, ermöglichen jedoch endlich die Identifizierung der Metaboliten, die für die Verbraucherpräferenzen verantwortlich sind, und die Züchtung von Pflanzen mit verbessertem Geschmack3

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

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Die Autoren danken den Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación der Universität Málaga für die HS-SPME/GC-MS Messungen. Wir würdigen die Unterstützung von Sara Fernández-Palacios Campos bei der volatilen Quantifizierung. Wir danken auch den Mitgliedern des Konsortiums von GoodBerry für die Bereitstellung des Fruchtmaterials.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 mL Headspace-Fläschchen mit SchraubverschlussThermo Scientific10-HSV
18 mm Schraubverschluss Silikon/PTFEThermo Scientific18-MSC
5 mL Röhrchen mit HDPE-SchraubverschlussVWR216-0153
ZentrifugeThermo Scientific75002415
Methanol für HPLCMerck34860-1L-R
N-Pentadecan (D32, 98%)Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-1283-1
NatriumchloridMerckS9888
SPME-Faser PDMS/DVBMerck57345-U
Rostfreie Mahlbecher für TissueLyserQiagen69985
TissueLyser IIQiagen85300Kann durch Mörser und Stößel oder kryogene Mühle ersetzt werden
Spuren-GC-Gaschromatograph-ITQ900 Ionenfallen-MassenspektrometerThermo Scientific
Triplus RSH Autosampler mit automatisiertem SPME-GerätThermo Scientific1R77010-0450
Wasser für HPLCMerck270733-1L
Xcalibur 4.2 SP1Thermo ScientificSoftware

Referenzen

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Volatile Organic CompoundsBlackcurrant FruitHeadspace Solid Phase MicroextractionGas Chromatography Mass SpectrometryFruit Aroma ProfilingVOC QuantificationMetabolomic PlatformsAroma BiomarkersPrincipal Component AnalysisTerpenoid Compounds

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