Wir beschreiben die Methode zur quantitativen Analyse der Verteilung von Aspergillus fumigatus conidia (3 μm groß) in den Atemwegen von Mäusen. Die Methode kann auch für die Analyse von Mikropartikeln und Nanopartikelagglomeratverteilung in den Atemwegen in verschiedenen pathologischen Zustandsmodellen verwendet werden.
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Methodenartikel
Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-basierte quantitative Analyse der Aspergillus fumigatus Conidia-Verteilung in der optisch geklärten Mauslunge
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Aspergillus fumigatus conidia sind luftgetragene Krankheitserreger, die in die menschlichen Atemwege eindringen können. Immunkompetente Menschen ohne Allergien zeigen Resistenz und immunologische Toleranz, während bei immungeschwächten Patienten Konidien die Atemwege besiedeln und schwere invasive Atemwegserkrankungen verursachen können. Verschiedene Zellen in verschiedenen Atemwegskompartimenten sind an der Immunantwort beteiligt, die das Eindringen von Pilzen verhindert; die räumlich-zeitlichen Aspekte der Erregereliminierung sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Die dreidimensionale (3D) Bildgebung von optisch gereinigten Ganzkörperorganen, insbesondere der Lunge von Versuchsmäusen, ermöglicht den Nachweis fluoreszierend markierter Krankheitserreger in den Atemwegen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion. In der vorliegenden Studie beschreiben wir einen Versuchsaufbau, um eine quantitative Analyse der Verteilung von A. fumigatus conidia in den Atemwegen durchzuführen. Mit Hilfe der fluoreszierenden konfokalen Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) verfolgten wir die Lage fluoreszierend markierter Konidien in den Bronchialästen und im Alveolarkompartiment 6 Stunden nach oropharyngealer Anwendung bei Mäusen. Der hier beschriebene Ansatz wurde bisher zum Nachweis des genauen Erregerortes und zur Identifizierung der pathogen-interagierenden Zellen in verschiedenen Phasen der Immunantwort verwendet. Der Versuchsaufbau kann verwendet werden, um die Kinetik der Erregerelimination unter verschiedenen pathologischen Zuständen abzuschätzen.
Einleitung
Täglich atmen Menschen luftgetragene Krankheitserreger ein, darunter Sporen opportunistischer Pilze Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia), die in die Atemwege eindringen können1. Die Atemwege von Säugetieren sind ein System von Atemwegen verschiedener Generationen, die durch die unterschiedlichen Strukturen der Atemwegswände2,3,4gekennzeichnet sind . Tracheobronchialwände bestehen aus mehreren Zelltypen, darunter Flimmerzellen, die die mukokoziläre Clearancebereitstellen 5. In den Alveolen gibt es keine ....
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Protokoll
Alle hier beschriebenen Methoden für Versuchstiere wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences (Protokollnummer 226/2017) genehmigt.
1. A. fumigatus conidia Anwendung
- Um fluoreszierend markierte A. fumigatus conidia zu erhalten, fixieren Sie 5 × 108 Konidien, indem Sie dem Conidia-Pellet 1 ml 3% Paraformaldehyd hinzufügen. Inkubieren Sie in einem 50 mL Reagenzglas für 2 h auf einem Shaker bei Raumtemperatur.
- Conidia mit 20 mL Phosphatpuffersalzlösung (PBS) waschen: Zentrifuge bei 1.0....
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Ergebnisse
Nach dem obigen Protokoll wurde das 3D-Bild erhalten, das die Atemwege und A. fumigatus conidia im Lungenlappen einer Maus zeigt (Abbildung 1A). Streptavidin (das zur Visualisierung der Atemwege verwendet wurde) markierte Bronchien und Bronchiolen15. Zusätzlich werden die großen Gefäße, die durch ihre Morphologie leicht von den Atemwegen zu unterscheiden sind, und die Pleura im Atemwegskanal visualisiert (Abbildung 1A-C
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Diskussion
Die 3D-Bildgebung von Ganzen Organen ermöglicht die Gewinnung der Daten ohne Sezierung der Probe, was für die Untersuchung der räumlichen Aspekte der anatomischen Verteilung des Erregers im Organismus von großer Bedeutung ist. Es gibt verschiedene Techniken und Modifikationen der gewebeoptischen Reinigung, die helfen, die Laserlichtstreuung zu überwinden und die Bildgebung ganzer Organe zu ermöglichen15,16,18,
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Offenlegungen
Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten in dieser Arbeit.
Danksagungen
Die Autoren danken Prof. Sven Krappmann (Universitätsklinikum Erlangen und FUA Erlangen-Nürnberg) für die Bereitstellung des Aspergillus fumigatus conidia Stamms AfS150. Die Autoren danken miPT Press Office. V.B. erkennt das Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation an (#075-00337-20-03, Projekt FSMG-2020-0003). Die Arbeiten zur Bildgebung und Quantifizierung von A. fumigatus conidia wurden durch RSF Nr. 19-75-00082 unterstützt. Die Arbeiten zur Bildgebung der Atemwege wurden durch RFBR Nr. 20-04-60311 unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus Konidien | ATCC | 46645 | Der Stamm AfS150, ein ATCC 46645 Derivat |
| Benzylalkohol | Panreac | 141081.1611 | 98,0-100 % |
| Benzylbenzoat | Acros | AC10586-0010 | 99+ |
| %C57Bl/6 Mäuse | Pushchino Tier Zuchtzentrum (Russland) | Rüde. 12 - 30 Wochen alt. | |
| Katheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell Imaging Deckglas-Bodenkammer | Eppendorf | 30742028 | 4 oder 8 Well-Kammer mit Deckglasboden |
| Zentrifuge | Eppendorf | 5804R | Jede mitgelieferte Zentrifuge 1000 g kann verwendet werden |
| Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethylsulfoxid | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥ 99.9% |
| FIJI Bildbearbeitungspaket | FIJI | Kostenlose Software | |
| Pinzette | B. Braun Aesculap | BD557R | |
| Zahnzange | B. Braun Aesculap | BD321R | |
| Pinzette | Bochem | 1727 | Glatte |
| Glasflasche | DURAN | 242101304 | Mit eingeschliffenem |
| Deckel Grafikeditor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Die kostenlose Testversion ist verfügbar https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isofluran | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Zielsetzung | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 > (NA = 0,3) |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 bis 50 μ L |
| Milchpulver | Roth | T145.2 | |
| Probenmischer | Dynal | MXIC1 | |
| Schere | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 U/min |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Seidenfaden | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 Konjugat | ThermoFisher | S11223 | |
| Reagenzglas | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (Hydroxymethylaminomethan) | Helicon | H-1702-0,5 | Herr 121.14; CAS-Nummer: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN Mikroskopsoftware | ZEISS | ZEN2012 SP5 https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
Referenzen
- O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
- Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Re....
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Nachdrucke und Genehmigungen
