Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-basierte quantitative Analyse der Aspergillus fumigatus Conidia-Verteilung in der optisch geklärten Mauslunge

Summary

Wir beschreiben die Methode zur quantitativen Analyse der Verteilung von Aspergillus fumigatus conidia (3 μm groß) in den Atemwegen von Mäusen. Die Methode kann auch für die Analyse von Mikropartikeln und Nanopartikelagglomeratverteilung in den Atemwegen in verschiedenen pathologischen Zustandsmodellen verwendet werden.

Abstract

Aspergillus fumigatus conidia sind luftgetragene Krankheitserreger, die in die menschlichen Atemwege eindringen können. Immunkompetente Menschen ohne Allergien zeigen Resistenz und immunologische Toleranz, während bei immungeschwächten Patienten Konidien die Atemwege besiedeln und schwere invasive Atemwegserkrankungen verursachen können. Verschiedene Zellen in verschiedenen Atemwegskompartimenten sind an der Immunantwort beteiligt, die das Eindringen von Pilzen verhindert; die räumlich-zeitlichen Aspekte der Erregereliminierung sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Die dreidimensionale (3D) Bildgebung von optisch gereinigten Ganzkörperorganen, insbesondere der Lunge von Versuchsmäusen, ermöglicht den Nachweis fluoreszierend markierter Krankheitserreger in den Atemwegen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion. In der vorliegenden Studie beschreiben wir einen Versuchsaufbau, um eine quantitative Analyse der Verteilung von A. fumigatus conidia in den Atemwegen durchzuführen. Mit Hilfe der fluoreszierenden konfokalen Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) verfolgten wir die Lage fluoreszierend markierter Konidien in den Bronchialästen und im Alveolarkompartiment 6 Stunden nach oropharyngealer Anwendung bei Mäusen. Der hier beschriebene Ansatz wurde bisher zum Nachweis des genauen Erregerortes und zur Identifizierung der pathogen-interagierenden Zellen in verschiedenen Phasen der Immunantwort verwendet. Der Versuchsaufbau kann verwendet werden, um die Kinetik der Erregerelimination unter verschiedenen pathologischen Zuständen abzuschätzen.

Introduction

Täglich atmen Menschen luftgetragene Krankheitserreger ein, darunter Sporen opportunistischer Pilze Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia), die in die Atemwege eindringen können¹. Die Atemwege von Säugetieren sind ein System von Atemwegen verschiedener Generationen, die durch die unterschiedlichen Strukturen der Atemwegswände^2,3,4gekennzeichnet sind . Tracheobronchialwände bestehen aus mehreren Zelltypen, darunter Flimmerzellen, die die mukokoziläre Clearance^{bereitstellen 5}. In den Alveolen gibt es keine ....

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden für Versuchstiere wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences (Protokollnummer 226/2017) genehmigt.

1. A. fumigatus conidia Anwendung

1. Um fluoreszierend markierte A. fumigatus conidia zu erhalten, fixieren Sie 5 × 10⁸ Konidien, indem Sie dem Conidia-Pellet 1 ml 3% Paraformaldehyd hinzufügen. Inkubieren Sie in einem 50 mL Reagenzglas für 2 h auf einem Shaker bei Raumtemperatur.
2. Conidia mit 20 mL Phosphatpuffersalzlösung (PBS) waschen: Zentrifuge bei 1.0....

Results

Nach dem obigen Protokoll wurde das 3D-Bild erhalten, das die Atemwege und A. fumigatus conidia im Lungenlappen einer Maus zeigt (Abbildung 1A). Streptavidin (das zur Visualisierung der Atemwege verwendet wurde) markierte Bronchien und Bronchiolen¹⁵. Zusätzlich werden die großen Gefäße, die durch ihre Morphologie leicht von den Atemwegen zu unterscheiden sind, und die Pleura im Atemwegskanal visualisiert (Abbildung 1A-C

Discussion

Die 3D-Bildgebung von Ganzen Organen ermöglicht die Gewinnung der Daten ohne Sezierung der Probe, was für die Untersuchung der räumlichen Aspekte der anatomischen Verteilung des Erregers im Organismus von großer Bedeutung ist. Es gibt verschiedene Techniken und Modifikationen der gewebeoptischen Reinigung, die helfen, die Laserlichtstreuung zu überwinden und die Bildgebung ganzer Organe zu ermöglichen^15,16,18,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 NHS Ester	ThermoFisher	A20004
Aspergillus fumigatus Konidien	ATCC	46645	Der Stamm AfS150, ein ATCC 46645 Derivat
Benzylalkohol	Panreac	141081.1611	98,0-100 %
Benzylbenzoat	Acros	AC10586-0010	99+
%C57Bl/6 Mäuse	Pushchino Tier Zuchtzentrum (Russland)		Rüde. 12 - 30 Wochen alt.
Katheter	Venisystems	G715-A01	18G
Cell Imaging Deckglas-Bodenkammer	Eppendorf	30742028	4 oder 8 Well-Kammer mit Deckglasboden
Zentrifuge	Eppendorf	5804R	Jede mitgelieferte Zentrifuge 1000 g kann verwendet werden
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	ZEISS	ZEISS LSM780
Dimethylsulfoxid	Sigma-Aldrich	276855	≥ 99.9%
FIJI Bildbearbeitungspaket	FIJI		Kostenlose Software
Pinzette	B. Braun Aesculap	BD557R
Zahnzange	B. Braun Aesculap	BD321R
Pinzette	Bochem	1727	Glatte
Glasflasche	DURAN	242101304	Mit eingeschliffenem
Deckel Grafikeditor Photoshop	Adobe Inc		Adobe Photoshop CS
GraphPad Software	GraphPad		Prism 8
Imaris Microscopy Imaging Software	Oxford Instruments		Die kostenlose Testversion ist verfügbar https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
Isofluran	Karizoo
NaHCO3	Panreac	141638
Zielsetzung	ZEISS	420640-9800-000	Plan-Apochromat, 10 > (NA = 0,3)
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	158127
PBS	Paneco	P060Π
Pipette	ProLine	722020	5 bis 50 μ L
Milchpulver	Roth	T145.2
Probenmischer	Dynal	MXIC1
Schere	B. Braun	BC257R	Blunt
Shaker	Apexlab	GS-20	50-300 U/min
Skalpel	Bochem	12646
Seidenfaden	B. Braun		3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Konjugat	ThermoFisher	S11223
Reagenzglas	SPL Lifesciences	50050	50 mL
Tris (Hydroxymethylaminomethan)	Helicon	H-1702-0,5	Herr 121.14; CAS-Nummer: 77-86-1
Triton X-100	Amresco	Am-O694-0.1
ZEN Mikroskopsoftware	ZEISS	ZEN2012 SP5 https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html