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Methodenartikel

Isolierung humaner primärer Klappenzellen für die In-vitro-Krankheitsmodellierung

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DOI:

10.3791/62439

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16. April 2021

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1Division of Cardiology, Department of Medicine, and the Pittsburgh Heart, Lung, and Blood Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Cardiothoracic Surgery, University of Pittsburgh and Heart and Vascular Institute, University of Pittsburgh Medical Center, 3Department of Bioengineering, University of Pittsburgh

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme menschlicher Aortenklappen, die während chirurgischer Aortenklappenersatzverfahren oder aus Leichengewebe extrahiert werden, und die anschließende Isolierung, Expansion und Charakterisierung patientenspezifischer primärer Klappenendothel- und interstitieller Zellen. Enthalten sind wichtige Details zu den Prozessen, die erforderlich sind, um die Zelllebensfähigkeit und Phänotypspezifität sicherzustellen.

Zusammenfassung

Die kalzifische Aortenklappenerkrankung (CAVD) ist bei fast einem Drittel der älteren Bevölkerung vorhanden. Verdickung, Versteifung und Verkalkung der Aortenklappe verursacht Aortenstenose und trägt zu Herzinsuffizienz und Schlaganfall bei. Die Krankheitspathogenese ist multifaktoriell, und Belastungen wie Entzündungen, extrazelluläres Matrixumbau, turbulenter Fluss und mechanische Belastung und Belastung tragen zur osteogenen Differenzierung von Klappendothel- und Klappeninterstitialzellen bei. Die genauen auslösenden Faktoren, die den osteogenen Übergang einer gesunden Zelle in eine kalzifizierende Zelle vorantreiben, sind jedoch nicht vollständig definiert. Weiterhin ist die einzige aktuelle Therapie bei CAVD-induzierter Aortenstenose der Aortenklappenersatz, bei dem die native Klappe entfernt wird (chirurgischer Aortenklappenersatz, SAVR) oder eine vollständig zusammenklappbare Ersatzklappe über einen Katheter eingeführt wird (Transkatheter-Aortenklappenersatz, TAVR). Diese chirurgischen Eingriffe sind mit hohen Kosten und ernsthaften Risiken verbunden. Daher ist die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele für die Wirkstoffforschung unerlässlich. Zu diesem Zweck entwickelt die vorliegende Studie einen Workflow, bei dem chirurgisch entferntes Gewebe von Patienten und Spenderkadavergewebe verwendet werden, um patientenspezifische primäre Linien von Herzklappenzellen für die In-vitro-Krankheitsmodellierung zu erstellen. Dieses Protokoll führt die Verwendung einer Kühllagerlösung ein, die üblicherweise bei Organtransplantationen verwendet wird, um die Schäden zu reduzieren, die durch die oft lange Beschaffungszeit zwischen der Gewebeentfernung und der Laborverarbeitung verursacht werden, mit dem Vorteil, dass die Zellen des herausgeschnittenen Gewebes stark stabilisiert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass isolierte Klappenzellen ihre proliferative Kapazität und endothelialen und interstitiellen Phänotypen in Kultur über mehrere Tage nach der Klappenentfernung vom Spender behalten. Die Verwendung dieser Materialien ermöglicht die Sammlung von Kontroll- und CAVD-Zellen, aus denen sowohl Kontroll- als auch Krankheitszelllinien gebildet werden.

Einleitung

Die kalzifische Aortenklappenerkrankung (CAVD) ist eine chronische Pathologie, die durch Entzündung, Fibrose und Makroverkalzifizierung von Aortenklappenflügeln gekennzeichnet ist. Ein fortschreitender Umbau und eine Verkalkung der Blättchen (Aortensklerose genannt) kann zur Behinderung des Blutflusses (Aortenstenose) führen, was zum Schlaganfall beiträgt und zu Herzversagen führt. Derzeit ist die einzige Behandlung für CAVD der chirurgische oder Transkatheter-Aortenklappenersatz (SAVR bzw. TAVR). Es gibt keine nicht-chirurgische Möglichkeit, die CAVD-Progression zu stoppen oder umzukehren, und ohne Klappenersatz nähern sich die Sterblichkeitsraten innerhalb von 2-3 Jahren 50% 1,2,3. Die Definition der zugrunde liegenden Mechanismen, die dieser Pathologie zugrunde liegen, wird potenzielle neue therapeutische Ansätze identifizieren.

Bei einem gesunden Erwachsenen sind die Aortenklappenflügel etwa einen Millimeter dick und ihre Hauptfunktion besteht darin, den unidirektionalen Blutfluss aus dem linken Ventrikel aufrechtzuerhalten4. Jedes der drei Blättchen besteht aus einer Schicht von Klappendothelzellen (VECs), die die äußere Oberfläche des Blattes auskleidet und als Barriere fungiert. VECs halten die Klappenhomöostase aufrecht, indem sie die Permeabilität, die entzündliche Zelladhäsion und die parakrine Signalisierung regulieren 5,6,7. Klappeninterstitielle Zellen (VICs) umfassen die Mehrheit der Zellen innerhalb des Klappenblattes8. VICs sind in drei unterschiedlichen Schichten in der Packungsbeilage angeordnet. Diese Schichten sind als Ventricularis, Spongiosa und Fibrosa9 bekannt. Die Ventricularis ist dem linken Ventrikel zugewandt und enthält Kollagen- und Elastinfasern. Die mittlere Schicht, die Spongiosa, enthält einen hohen Proteoglykangehalt, der während des Herzzyklus für Scherflexibilität sorgt. Die äußere Fibrosaschicht befindet sich in der Nähe der Ausflussoberfläche auf der Aortenseite und ist reich an fibrillärem Kollagen Typ I und Typ III, das Kraft zur Aufrechterhaltung der Koaptation während der Diastole10,11,12 bietet. VICs befinden sich in einem Ruhezustand, jedoch können Faktoren wie Entzündungen, Umbau der extrazellulären Matrix (ECM) und mechanischer Stress die VIC-Homöostase 8,9,13,14,15,16 stören. Mit Verlust der Homöostase aktivieren und erwerben VICs einen myofibroblastenähnlichen Phänotyp, der zur Proliferation, Kontraktion und Sekretion von Proteinen fähig ist, die das extrazelluläre Millieu17 umgestalten. Aktivierte VICs können in kalzifizierende Zellen übergehen, was an die Differenzierung einer mesenchymalen Stammzelle (MSC) in einen Osteoblasten 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25 erinnert.

Die Verkalkung scheint in der kollagenreichen Fibrosaschicht durch Beiträge von VECs und VICs zu beginnen, dehnt sich jedoch aus und dringt in die anderen Schichten des Blättchensein 8. So ist es klar, dass sowohl VECs als auch VICs auf Reize reagieren, um die Expression osteogener Gene hochzuregulieren, aber die genauen Ereignisse, die die Aktivierung osteogener Gene vorantreiben, sowie das komplexe Zusammenspiel zwischen den Zellen und der extrazellulären Matrix des Blättchens bleiben unklar. Murine Modelle sind keine ideale Quelle, um nicht-genetische Treiber der CAVD-Pathogenese zu untersuchen, da Mäuse kein CAVD de novo26,27 entwickeln, daher ist die Verwendung von primärem menschlichem Gewebe und den aus diesen Geweben isolierten primären Zelllinien notwendig. Insbesondere ist es unerlässlich, diese Zellen in hoher Anzahl und guter Qualität zu erhalten, da sich das Feld der 3D-Zellkulturen und der Organoidmodellierung erweitert und wahrscheinlich zu einer ex vivo humanbasierten Alternative zu Mausmodellen wird.

Der Zweck der vorliegenden Methode besteht darin, einen Workflow zu teilen, der die Bedingungen für die effiziente Isolierung und Züchtung von VECs und VICs, die aus chirurgisch entfernten Ventilen von menschlichen Spendern gewonnen werden, geschaffen hat. Frühere Studien haben eine erfolgreiche Isolierung von VECs und VICs aus Schweineklappen28 und murinen Klappen29 gezeigt, nach unserem Wissen ist dies die erste, die die Isolierung dieser Zellen in menschlichem Gewebe beschreibt. Das hier beschriebene Protokoll ist auf menschliche herausgeschnittene Klappen anwendbar und umgeht und verbessert den Schaden, der durch die oft lange Beschaffungszeit zwischen der Gewebeentfernung und der Laborverarbeitung verursacht wird, erheblich, indem es die Verwendung einer Kühllagerlösung einführt, einer gepufferten Lösung, die klinisch bei Organtransplantationen verwendet wird und die Zellen des ausgeschnittenen Gewebes stark stabilisiert. Das hier beschriebene Protokoll zeigt auch, wie der Zellphänotyp bestimmt und eine hohe Effizienz des Zellüberlebens bei minimaler Zellkreuzkontamination gewährleistet werden kann.

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Protokoll

Alle Patientenproben stammen von Personen, die an Studien teilnehmen, die vom institutionellen Prüfungsausschuss der Universität Pittsburgh in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki genehmigt wurden. Leichengewebe, das über das Center for Organ Recovery and Education (CORE) gewonnen wurde, wurde vom University of Pittsburgh Committee for Oversight of Research and Clinical Training Involving Decedents (CORID) genehmigt.

1. Zulassung und Sicherheit

  1. Einholung der Genehmigung des Institutional Review Board (IRB) oder eines freigestellten Vermerks für die Entnahme von Patientenproben oder Leichengewebe gemäß der Deklaration von Helsinki.
  2. Nehmen Sie an der erforderlichen institutionellen Ausbildung teil, um mit menschlichem Gewebe zu arbeiten, z. B. Bloodborne Pathogens Training, Biomedical Human Subjects Research, Privacy and Information Security sowie Transport und Versand von biologischem Material.

2. Logistik und Vorbereitung

  1. Chirurgische Proben
    1. Stellen Sie sicher, dass ein Kühlschrank verfügbar ist und sich in der Nähe des Operationssaals befindet. Bewahren Sie 50-ml-konische Röhrchen mit einer anonymisierten Nomenklatur vor, die 40 ml sterile Aliquots der Kühllagerlösung enthält, in diesem Kühlschrank für die Verwendung durch chirurgisches Personal. Diese Röhrchen sind bis zum Verfallsdatum auf der Originalverpackung bei 4 °C stabil.
    2. Legen Sie nach der Extraktion Klappengewebe in diese Röhrchen. Legen Sie die Röhrchen in einen versiegelten sekundären Behälter, z. B. einen auslaufsicheren Plastikbeutel oder einen Kunststoffbehälter, der mit einem Biogefahrenetikett gekennzeichnet ist. Gewebe werden nach institutionellen Protokollen für den Transport von Biogefahren aufgenommen und auf Eis transportiert.
  2. Leichenproben
    1. Geborgene Organe in Kühllagerlösung tauchen, in ein versiegeltes sekundäres Sicherheitsgefäß geben und auf Eis gemäß den institutionellen Protokollen für den Transport biologischer Gefahren transportieren.

3. Zubereitung der Reagenzien

  1. Machen Sie kollagenbeschichtete Teller mindestens am Vortag.
    1. Mischen Sie in einem 50-ml-konischen Röhrchen 5 ml Isopropylalkohol, 8,7 ml Essigsäure und 0,5 μg Kollagen-I-Pulver. Bis zu 50 ml mit sterilem Wasser bringen. Mischen und filtrieren Sie durch einen 0,45-μm-Filter.
    2. Unter einer sterilen Zellkulturhaube genügend Kollagenlösung zu 6 Well-Platten und 10 cm Geschirr hinzufügen, um den gesamten Boden zu bedecken. Den Teller abdecken und 4-6 h bei Raumtemperatur ruhen lassen. Entfernen Sie die überschüssige Lösung mit einer sterilen Pipette, geben Sie sie in ein neues steriles 50-ml-konisches Röhrchen und speichern Sie bei 4 °C, um zusätzliche Platten herzustellen. Die Lösung kann mehrere Monate bei 4 °C gelagert werden.
    3. Trocknen Sie die Platten über Nacht in einem 37 °C Inkubator und lagern Sie sie anschließend in einem wiederverschließbaren Beutel bei 4 °C. Kollagenbeschichtete Teller und Geschirr können mehrere Monate gelagert werden.
  2. Autoklavieren Sie die folgenden Artikel: Gewebezange, Taschentuchschere, Wattestäbchen und Mullpads.
  3. VEC-Wachstumsmedien: Bereiten Sie das Wachstumsmedium für Endothelzellen gemäß den Protokollen des Herstellers vor und verwenden Sie es. Im Dunkeln bei 4 °C lagern. Kurz vor der Anwendung auf Zellen auf 37 °C erwärmen, Medien nicht länger als nötig im Wärmebad lassen (10-15 min sind ausreichend). Verwenden Sie die Medien innerhalb eines Monats nach der Vorbereitung.
  4. VIC-Wachstumsmedien: Ergänzung DMEM-Basismedium (4,5 g / L Glukose, L-Glutamin-Ergänzung, 110 mg / L Natriumpyruvat)30 mit 10% hitzeinaktiviertem FBS und 100 I.E./ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin. Im Dunkeln bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern. Kurz vor der Anwendung auf Zellen auf 37 °C erwärmen, Medien nicht länger als nötig im Wärmebad lassen (10-15 min sind ausreichend).
  5. Stellen Sie kurz vor Gebrauch eine sterile Spüllösung her. Ergänzen Sie steriles PBS mit 2,5 μg/ml Fungizid, 0,05 mg/ml Gentamicin und 5 μg/ml Bakterizid.
  6. Stellen Sie kurz vor Gebrauch sterile Kollagenaselösung her. Fügen Sie 5 mg Kollagenase II zu 5 ml sterilem frischem DMEM-Basismedium hinzu. Mischen Sie gut und sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie einen 0,45-μm-Filter passieren. Bis zum Gebrauch auf Eis halten.

4. Gewebeaufbereitung und -verarbeitung

HINWEIS: Vor Beginn der Arbeiten muss eine institutionelle Genehmigung für die Verwendung von menschlichem Gewebe eingeholt werden. Beim Umgang mit Geweben muss die folgende persönliche Schutzausrüstung (PSA) getragen werden: ein Einweg-Flüssigkeitsbarriere-Wickelkittel oder ein spezieller Laborkittel mit Flüssigkeitsbarriere um die Schürze und Einweg-Ärmelklee; ein Vollgesichtsschutz oder eine Schutzbrille mit einer chirurgischen Maske; Doppelhandschuhe; enge Schuhe; und Kleidung, um die Beine zu bedecken. Umfassende Workflow-Diagramme der Gewebevorbereitung für die Verkalkungsbeurteilung (Abschnitt 5) und die Zellisolierung (Abschnitte 6 und 7) sind in Abbildung 1A,B dargestellt.

  1. Nach Erhalt der Leichenorganprobe die Aortenwurzel herausschneiden und in ein 50 ml konisches Röhrchen steriler Spüllösung tauchen. Nach Erhalt der chirurgischen Probe aus den Transportgefäßen entnehmen und in ein 50 ml konisches Röhrchen steriler Spüllösung tauchen. Röhrchen mit dem Gewebe in Eiskübel auf Wippe legen und 10 min bei Raumtemperatur (RT) mischen.
    HINWEIS: Die Verarbeitung von Geweben so nah wie möglich am Zeitpunkt der Extraktion führt zur besten Zellerholung, jedoch können lebensfähige Zellen bis zu 61 Stunden nach der Exzision gesammelt werden, und die Daten zeigen, dass VICs mit zunehmender Zeit robuster sind als VECs. Wenn das Gewebe nicht sofort verarbeitet werden kann, entfernen Sie, wenn möglich, das Gewebe, führen Sie Schritt 4.1 durch, legen Sie das Gewebe dann wieder in eine frische, sterile Kühllösung und bewahren Sie es bei 4 °C auf, bis Sie fortfahren können. Ventile, die während Nacht- oder Wochenendoperationen gesammelt werden, können in 40 ml Kühllagerlösung bei 4 °C gelagert werden und sind noch in der Lage, lebensfähige Zellen mehr als 2 Tage nach der Extraktion zu liefern.
  2. Sprühen Sie die Röhrchen mit 70% Ethanol ein und geben Sie sie in eine sterile Haube. Entfernen Sie das Gewebe und entfernen Sie zwei Klappenflügel (Abbildung 2A). Geben Sie ein Blättchen in eine kryogene Durchstechflasche (oder 2-3 Durchstechflaschen, wenn mehrere kleinere Stücke für zukünftige Analysen benötigt werden) und frieren Sie ein, indem Sie flüssigen Stickstoff eintauchen und dann bei -80 °C lagern.
    1. Wenn das Ventil bikuspid ist, schneiden Sie nur eine Packungsbeilage aus. Schneiden Sie das Blättchen mit einer Schere vom Knötchen bis zum Scharnier in zwei Hälften. Verwenden Sie eine Hälfte der Packungsbeilage für das Einfrieren von Schnappschüssen und die andere Hälfte für Schritt 4.3.
  3. Verarbeiten Sie die zweite Packungsbeilage für die Paraffineinbettung, um den Verkalkungsgehalt zu beurteilen, indem Sie sie von Knötchen zu Scharnier halbieren. Legen Sie beide Teile in eine Kassette, die in 4% Paraformaldehyd (PFA) getaucht ist, und legen Sie sie dann für mindestens 2 h, aber nicht mehr als 4 h auf eine Wippe bei RT.
    HINWEIS: Längere Fixierungszeiten erzeugen mehr Hintergrund mit immunfluoreszierender Färbung. Sobald die Schritte 4.2 und 4.3 ausgeführt wurden, fahren Sie sofort mit Abschnitt 6 fort und kehren nach Schritt 6.12 zu Schritt 4.4 zurück.
  4. Nach der Fixierung waschen Sie das Gewebe durch Eintauchen in frisches PBS für 1 h 3-4 mal. Nach diesen Wäschen können die Proben bei Bedarf mehrere Monate in PBS bei 4 °C verbleiben. Fahren Sie kurz vor dem Einbetten mit dem nächsten Schritt fort.
  5. Wechseln Sie allmählich von PBS zu 70% Ethanol. Waschen Sie 30-60 Minuten pro Schritt mit 1:4 70% Ethanol:PBS; 1:1 70% Ethanol:PBS, 4:1 70% Ethanol:PBS; 70% Ethanol.
  6. Betten Sie das Gewebe so ein, dass Abschnitte die drei Schichten des Blattes (Abbildung 1A) gemäß den festgelegten Protokollen31 offenbaren. Alternativ und falls verfügbar, bringen Sie das Gewebe zu einem Pathologiekern zum Einbetten und Schneiden.
  7. Entsorgen oder lagern Sie PSA nach dem Umgang mit Taschentüchern und waschen Sie sich sofort die Hände. Dekontamination aller Geräte, Oberflächen sowie fester und flüssiger Abfälle mit einer 1:10-Verdünnung von Bleichmittel oder Reinigungsmitteldesinfektionsmittel. Lassen Sie 20 Minuten für die Dekontamination, dann folgen Sie mit einer 70% Ethanol-Spülung. Behandeln Sie die Zellkulturhaube mit Mykoplasmenspray gemäß den Anweisungen des Herstellers.

5. Von Kossa-Färbung für Calciumgehalt

HINWEIS: Dies kann gut nach der Zellisolierung und Linienetablierung erfolgen, aber stellen Sie sicher, dass Sie den Verkalkungsgrad des Gewebes mit Dokumenten verknüpfen, die sich auf die etablierte primäre Zelllinie beziehen.

  1. 5 oder 10 μm dicke Paraffinscheiben auf Glasobjektträger schneiden und Objektträger bei 65 °C 1 h backen, dann auf RT abkühlen lassen.
  2. Mit frischen Lösungen die Objektträger wie folgt entparaffinieren: 100% Xylol für 30 min, 2x; 100% Ethanol für 3 min, 2x; 90% Ethanol für 3 min; 80% Ethanol für 3 min; 70% Ethanol für 3 min; 50% Ethanol für 3 min; Reinstwasser für 3 min; Bis zu den nächsten Schritten in Reinstwasser aufbewahren.
    HINWEIS: Die oben genannten Zeiten sind minimal, jeder Schritt kann länger dauern.
  3. Fahren Sie mit der Von Kossa-Färbung gemäß den Protokollen des Herstellers fort.
  4. Beurteilen Sie den gesamten Klappenbereich mikroskopisch und weisen Sie ein Kontrollgewebe (keine Anzeichen einer Verkalkung) oder CAVD (Anzeichen einer Verkalkung, Abbildung 2B) zu.

6. Isolierung, Expansion und Bestätigung von Klappendothelzellen (VEC)

  1. Öffnen Sie in einer sterilen Zellkulturhaube das konische Röhrchen mit dem verbleibenden Ventilflügel und legen Sie das Blättchen in ein neues 50-ml-konisches Röhrchen, das mit eiskaltem PBS gefüllt ist. Kappenrohr und vorsichtig umdrehen oder für 2 min bei RT auf eine Wippe legen.
  2. Entfernen Sie das Gewebe in eine 60 mm große Schale, die mit 5-7 ml kalter Kollagenaselösung gefüllt ist. Tauchen Sie mit einer Pinzette beide Seiten des Blättchens 3-4 Mal in die Lösung. Inkubieren Sie das Gewebe für 5-10 min im Zellkulturinkubator bei 37 °C und schaukeln Sie das Gewebe vorsichtig alle 2 min 3-4 mal.
  3. Nehmen Sie 2 ml der Lösung aus der Schale und geben Sie sie in ein steriles 15 ml konisches Röhrchen. Legen Sie eine Pinzette an den Knoten und verwenden Sie ein trockenes steriles Wattestäbchen, um von der Pinzette zum Scharnier zu streichen, wobei Sie den Tupfer drehen, während Sie ihn entlang des Blättchens bewegen. Zwischen jedem Wischen schwenken Sie den Tupfer in der Lösung im 15-ml-Konikusröhrchen, um die Zellen zu entfernen. Wiederholen Sie, um die Oberfläche des Gewebes vollständig abzutupfen, drehen Sie sich dann um und wiederholen Sie auf der anderen Seite.
  4. Halten Sie das Ventilblatt mit einer Pinzette in der einen Hand und eine 1-ml-Pipette in der anderen Hand und spülen Sie die Oberflächen des Flügels mit der Lösung in der Schale ab. Nach dem Spülen wird die gesamte Lösung, die die VECs in der Schale enthält, in dasselbe 15-ml-konische Röhrchen mit den Zellen aus dem Tupfer gegeben und mit Schritt 6.5 fortgefahren. Legen Sie das verbleibende Klappengewebe in ein neues 15-ml-konisches Röhrchen mit 7 ml steriler Kollagenaselösung und fahren Sie mit Schritt 7.1 fort.
  5. Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit den VECs bei 180 x g für 5 min, um die isolierten VECs zu pelletieren. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie ihn in 3 ml VEC-Wachstumsmedium. Zentrifugieren Sie noch einmal und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Wachstumsmedien und bestimmen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau.
  6. Resuspendieren Sie das VEC-Pellet in 2 ml VEC-Wachstumsmedien und legen Sie die Zellen in eine kollagenvorbeschichtete Vertiefung einer 6-Well-Platte bei etwa 5 x 105 Zellen /cm2. Lassen Sie die Zellen mindestens 3-4 Tage wachsen, entfernen Sie dann Medien und füllen Sie sie mit frischen Medien auf. Wiederholen Sie den Medienwechsel alle 4 Tage. VECs wachsen in kopfsteinpflasterförmigen Flecken (Abbildung 3B, linke Felder).
  7. Wenn VEC-Pflaster >80% der Platte bedecken, teilen Sie die Zellen bei etwa 1,3 x 104 Zellen / cm 2, je nachdem, wie schnell sie wachsen (wenn sie 80% in weniger als 1 Woche erreichen, teilen Sie sich bei einer etwas geringeren Anzahl von Zellen / cm2).
  8. Um zu spalten, waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml DPBS und fügen Sie dann genügend Dissoziationsreagenz hinzu, um nur die Oberfläche der Zellen zu bedecken. Inkubieren Sie für 2-3 min bei 37 °C, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht überbrütet sind. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie das gleiche Volumen VEC-Wachstumsmedien hinzufügen und Flüssigkeit in ein 15-ml-Röhrchen überführen. Bei 180 x g für 5 min zentrifugieren, Überstand entfernen und in geeignetem Medienvolumen für die Anzahl der benötigten Vertiefungen/Platten resuspendieren.
    HINWEIS: Einmal zu einer 10 cm großen Platte expandiert, können VECs manchmal ihre Morphologie verlieren und den Phänotyp ändern, wenn sie sich vermehren. Dies tritt tendenziell auf, wenn VECs während des Auf- und Ausbaus der Zelllinie an einem geringen Konfluenz ausgesät werden.
  9. Um eine reine Kultur zu gewährleisten, sollten Sie bei jeder Spaltung superparamagnetische CD31+-Perlen verwenden.
  10. Für 1 x 108 oder weniger Zellen (eine 10-cm-Schale oder weniger) bereiten Sie 25 μL superparamagnetische Perlen durch Waschen gemäß den Protokollen des Herstellers vor.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, Schritt 6.10 vor der Trypsinisierung von VECs durchzuführen.
  11. Zellen wie in Schritt 6.8 ablösen, aber in 500 μL PBS mit 0,1% BSA, pH 7,4 resuspendieren und in ein 2 mL Zentrifugenröhrchen geben. 500 μL gewaschene und resuspendierte Kügelchen in das 2-ml-Zellröhrchen geben und 20 min bei 4 °C auf einem Rotator inkubieren.
  12. Legen Sie die Schläuche für 2 min auf den Magneten. Während sich die Röhre noch im Magneten befindet, entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Röhrchen vom Magneten entfernen, 1 ml frisches PBS mit 0,1% BSA hinzufügen, 2-3 Mal vorsichtig pipetten und dann wieder für 2 min auf den Magneten legen. Wiederholen Sie 2 weitere Male. Nach dem endgültigen Entfernen des Puffers resuspendieren Sie die Zellen in Wachstumsmedien in einem für die Replattierung erforderlichen Volumen.
    HINWEIS: Zellen haben immer noch Perlen, aber diese beeinflussen das Wachstum nicht und werden in nachfolgenden Passagen entfernt.
  13. Sobald die Zellen expandiert wurden, bestätigen Sie zusätzlich zur Morphologie den VEC-Phänotyp durch positive Färbung für Immunfluoreszenzmarker wie von-Willebrand-Faktor (vWF), Cadherin 5 (CDH5) oder PECAM-1/CD31 und negative Färbung für VIC-Marker wie Calponin 1 (CNN) oder alpha-2-Aktin der glatten Muskulatur (αSMA, Abbildung 4, linkes Bild).

7. Isolierung, Expansion und Speicherung von Ventilzellen (VIC)

  1. Wie in Schritt 6.4 angegeben, wird das Blättchen nach Entfernung von VECs aus dem Klappengewebe in ein 15 ml konisches Röhrchen mit 7 ml Kollagenaselösung gegeben. Inkubieren Sie für 12 h im Zellkulturinkubator mit leicht geöffneter Kappe, um den Gasaustausch zu ermöglichen. Eine erfolgreiche Isolierung von VICs kann noch mit bis zu 18 h in Kollagenaselösung erfolgen.
  2. Nach der Inkubation in einer sterilen Zellkulturhaube das Gewebe vorsichtig durch Pipettieren mit einer serologischen Pipette mischen, um die Freisetzung von VICs aus dem Blättchengewebe sicherzustellen.
  3. Entfernen Sie die Zellsuspension und geben Sie einen 0,70-μm-Filter in ein 50-ml-konisches Röhrchen.
  4. 7 mL VIC-Wachstumsmedium in das 50-ml-Röhrchen geben und bei 180 x g für 5 min zentrifugieren. Überstand aspirieren und Zellpellet in 1 ml VIC-Wachstumsmedien resuspendieren und die Zellzahl bestimmen. Die VICs werden in einer mit 60 mm Gewebekultur behandelten Schale mit 1,3 x 104 Zellen/cm2 beschichtet.
  5. Lassen Sie die Zellen mindestens 1-2 Tage wachsen, bevor Sie Medien ersetzen. Entfernen Sie Medien und waschen Sie zweimal DPBS, um Restablagerungen zu entfernen und durch frisches Wachstumsmedium zu ersetzen. Medium alle 2-3 Tage auffüllen. VICs wachsen in Fibroblastenform (Abbildung 3B, rechte Felder).
  6. Wenn VICs einen Konfluency von >90% erreichen, waschen Sie zweimal mit DPBS, um das überschüssige Medium zu entfernen, und lösen Sie die Zellen durch Zugabe eines geeigneten Volumens eines vorgewärmten Dissoziationsreagenzes ab, um die Platte abzudecken (dh 2-3 ml pro 10 cm Schale). Die Schale in einem 37 °C heißen Inkubator ausbrüten. VICs lösen sich nach 2-3 min Inkubation von der Schale. Fügen Sie 4-6 ml vorgewärmtes Medium hinzu.
    HINWEIS: Wenn Zellen länger als 3 Minuten brauchen, um von der Platte abzuheben, kann das Dissoziationsreagenz seine Wirksamkeit verloren haben. Bei Bedarf kann ein Zellschaber verwendet werden, um die Zellen sanft anzuheben.
  7. Die Zellsuspension in ein Röhrchen geben und bei 180 x g vorsichtig für 5 min zentrifugieren. Nach dem Entfernen des Überstands das Zellpellet vorsichtig in vorgewärmten VIC-Wachstumsmedien resuspendieren und die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau bestimmen. Säen Sie die lebensfähigen Zellen mit einer Dichte von 1: 2 der ursprünglichen Schale (dh ~ 1 × 106 Zellen pro 10 cm Schale oder 1,3 x 104 Zellen / cm2).
  8. Beurteilen Sie den VIC-Phänotyp durch positive Färbung für immunfluoreszierende Marker wie αSMA, CNN oder SM22α und negative Färbung für VEC-Marker wie CD31, CDH5 oder vWF (Abbildung 4, rechte Felder).
    HINWEIS: Der hier vorgestellte Protokoll-Workflow wählt unvoreingenommen ein Merkblatt für die Isolierung von VECs und VICs aus, während die restlichen Packungsbeilagen für die Von Kossa-Färbung (Abschnitt 5) und das Einfrieren von Snap verwendet werden.

8. Langfristige Zellspeicherung

  1. Nach der Expansion frieren Sie die Zellen für die Langzeitlagerung ein. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 2-5 ml DPBS und fügen Sie dann genügend Dissoziationsreagenz hinzu, um die Zellen wie in den Schritten 6.8 und 7.6 zu lösen. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie das gleiche Volumen VEC oder VIC Wachstumsmedien und Transferzellsuspension in ein 15 ml Röhrchen geben.
  2. Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau.
  3. Zentrifuge bei 180 x g für 5 min.
  4. Resuspendieren Sie Zellen in gekühlten konditionierten Wachstumsmedien auf eine Zelldichte von ~ 3 × 106 Zellen / ml.
  5. Vorsichtig mit Schwenken ein gleiches Volumen gekühltes 2x Kryokonservierungsmedium hinzufügen. Dies bringt die Zellkonzentration auf ~ 1,5 × 106 Zellen / ml.
  6. Aliquot 1 ml in Kryokonservierungsfläschchen. Legen Sie die Durchstechflaschen in einen Zellgefrierbehälter, schließen Sie sie und kehren Sie sie 5-6 Mal um, um sicherzustellen, dass die Zellen suspendiert bleiben. Stellen Sie den Behälter bei -80 °C für 6-72 h oder gemäß dem Gefrierbehälterprotokoll auf. Durchstechflaschen aus -80 °C entnehmen und zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführen.

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Ergebnisse

Das obige Protokoll beschreibt die Schritte, die für den Umgang mit menschlichem Klappengewebe und die Isolierung und Etablierung lebensfähiger Zelllinien aus diesen Geweben erforderlich sind. Leaflets der Aortenklappe werden zur Paraffineinbettung verarbeitet, für die Langzeitlagerung für biochemische oder genetische Analysen eingefroren und zur Isolierung von VECs und VICs verdaut (Abbildung 1). Während chirurgische Proben wahrscheinlich eine klinische Diagnose einer Aortenstenose haben un...

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Diskussion

Die Gewinnung von Kontroll- und Krankheitsgewebe vom Menschen ist entscheidend für die In-vitro- und Ex-vivo-Krankheitsmodellierung. Während man jedoch oft über die Herausforderungen spricht, die Lücke zwischen Bank und Krankenbett zu überbrücken, ist die umgekehrte Reihenfolge - vom OP-Raum zur Bank - oft genauso entmutigend. Wesentlich für einen Grundlagenwissenschaftler, um primäre menschliche Gewebeproben zu erhalten, ist eine Zusammenarbeit mit einem investierten Chirurgenwissenschaftler, der über ein Team von Krank...

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Offenlegungen

IS erhält institutionelle Forschungsunterstützung von Atricure und Medtronic und fungiert als Berater für Medtronic Vascular. Keiner dieser Konflikte steht im Zusammenhang mit dieser Arbeit. Alle anderen Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Jason Dobbins für die aufschlussreiche Diskussion und kritische Lektüre dieses Manuskripts. Wir möchten dem Center for Organ Recovery and Education für seine Hilfe und Unterstützung danken und danken den Gewebespendern und ihren Familien, die diese Studie ermöglicht haben. Alle Patientenproben stammen von Personen, die an Studien teilnehmen, die vom institutionellen Prüfungsausschuss der Universität Pittsburgh in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki genehmigt wurden. Leichengewebe, das über das Center for Organ Recovery and Education (CORE) gewonnen wurde, wurde vom University of Pittsburgh Committee for Oversight of Research and Clinical Training Involving Decedents (CORID) genehmigt.

Einige Figuren, die mit Biorender.com erstellt wurden.

CSH wird vom National Heart, Lung and Blood Institute K22 HL117917 und R01 HL142932, der American Heart Association 20IPA35260111 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,45 μ m FilterThermo Scientific7211345Präparationsplatte mit Kollagenbeschichtung
10 cm ZellkulturplatteGreiner Bio-One664160Zellkultur-/Zelllinienerweiterung
10 mL serologische PipetteFisher14955234VEC/VIC Isolierung, Zellkultur, Zelllinienerweiterung
1000 μ L-FilterspitzenVWR76322-154Zellkultur-/Zelllinienerweiterung
10XL FilterspitzenVWR76322-132Zellkultur-/Zelllinienerweiterung
15 mL konische RöhrchenThermo Scientific339650Gewebelagerung, VIC/VEC-Isolierung
16 % wässrige Paraformaldehyd-LösungElektronenmikroskopie Sciences15710SGewebe- und Zellfixiermittel
190 proof ethanolDecon2801Desinfektion
1x DPBS: kein Kalzium, kein MagnesiumGibco14190250Kochsalzlösung. VIC/VEC Isolierung
1x PBSFisherBP2944100Kochsalzlösung. Gewebeaufbereitung, VIC/VEC Isolierung
20 μ L FilterspitzenVWR76322-134Zellkultur-/Zelllinienerweiterung
200 Proof EthanolDecon2701Entparaffinierung von Gewebeproben
2-PropanolFisherA416P 4Herstellung von kollagenbeschichteten Platten
5 mL serologische PipetteFisher14955233VEC/VIC-Isolierung, Zellkultur, Zelllinienerweiterung
50 mL konische RöhrchenThermo Wissenschaftliche339652Gewebelagerung, VIC/VEC-Isolierung
60-mm-SchaleGenClone25-260VEC-Isolierung
6-Well-ZellkulturplatteCorning3516Zellkultur-/Zelllinienerweiterung
Essigsäure, GletscherFisherBP2401 500Herstellung von kollagenbeschichteten Platten
AlexaFluor 488 PhalloidinInvitrogenA12379Fluoreszierend f-actin Gegenfärbung
Belzer UW Cold Storage Transplant SolutionBridge to LifeBUW0011LGewebespeicherlösung
Rinderserum Albumin, Fraktion V - Fettsäurefrei 25gBioworld220700233VEC Bestätigung mit CD31+ Dynabeads
Calponin 1 Antikörper Abcamab46794Primärer Antikörper (VIC-positiver Farbstoff)
CD31 (PECAM-1) (89C2)Cell Signaling3528Primärer Antikörper (VEC-positiver Farbstoff)
CD31+ DynabeadsInvitrogen11155DVEC-Bestätigung mit CD31+ Dynabeads
CDH5Cell Signaling2500Primärer Antikörper (VEC-positiver Farbstoff)
Zellsieb mit 0,70 μ m PorenCorning431751VIC Isolierung
Kollagen 1, RattenschwanzproteinGibcoA1048301Herstellung von kollagenbeschichteten Platten
Kollagenase IIWorthington Biochemical CorporationLS004176Gewebeverdauung. Gewebeaufbereitung, VIC/VEC-Isolierung
Conflikt Gebrauchsfertiges DesinfektionssprayDecon4101Desinfektion
Countess II Automatisierter ZellzählerInvitrogenA27977Automatisierter Zellzähler
Countess II wiederverwendbare ObjektträgerInvitrogen2026hAutomatisierter Zellzähler erforderlicher Objektträgerdeckel
DeckgläserFisher125485EEinbetten von Ventilproben
Kryogene FläschchenOlympus Plastics24-202Einfrieren von Zell-/Gewebeproben
Desinfizierendes Bleichmittel mit CLOROMAX - Konzentrierte Formel CloroxN/ADesinfektion
DMEMGibco10569044Wachstumsmedien. VIC-Expansion
EBM - Endotheliales Zellmedium, Basalmedium, Phenolrotfrei 500Lonza WalkersvilleCC3129Wachstumsmedien. VEC-Expansion
EGM-2 Endothelzelle Medium-2 - 1 Kit SingleQuot KitLonza WalkersvilleCC4176Nahrungsergänzungsmittel für Wachstumsmedien. VEC-Expansion
EVOS FL MikroskopLife TechnologiesModellnummer: AME3300Fluoreszenzbildgebung
EVOS XL MikroskopLife TechnologiesAMEX1000Visualisierung von Zellen während der Zelllinienexpansion
Fötales Kälberserum - Premium SelectR& D SystemsS11550VIC-Expansion
Feine SchereFine Science Tools14088-10Gewebeaufbereitung, VIC/VEC-Isolierung
Fisherbrand ZellschaberFisher08-100-241VIC-Expansion
FungizoneGibco15290-026Antimykotikum: Gewebeaufbereitung, VIC/VEC-Isolierung
GentamicinGibco15710-064Antibiotikum: Gewebevorbereitung, VIC/VEC-Isolierung
Objektträger ObjektträgerGlobe Scientific Inc1358LMontage Ventilproben
Ziege Anti-Maus 488InvitrogenA11001Fluoreszierender Sekundärantikörper
Ziege Anti-Maus 594InvitrogenA11005Fluoreszierender Sekundärantikörper
Ziege Anti-Kaninchen 488InvitrogenA11008Fluoreszierend Sekundärer Antikörper
Ziege Anti-Kaninchen 594InvitrogenA11012Fluoreszierender Sekundärantikörper
Invitrogen Countess II FL Wiederverwendbarer ObjektträgerInvitrogenA25750Automatisierter Zellzähler erforderlicher Objektträger
Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagenz (DAPI)InvitrogenR37606Fluoreszierender Zellkern-Gegenfärbemittel
LM-HyCryo-STEM - 2X Kryokonservierungsmedien für StammzellenHyClone Laboratories, Inc.SR30002Lagerung von gefrorenen Zellen
EindeckmediumFisher Chemical PermountSP15-100Einbettung von Proben
mit Ventil Mr. Frosty GefrierbehälterNalgene51000001Behälter für kontrolliertes Einfrieren von Proben
Mycoplasma-ExS SprayPromoCellPK-CC91-5051Desinfektion
Penicillin-StreptomycinGibco15140163Antibiotikum. VIC-Expansion
PlasmocinInvivogenANTMPTAnti-Mykoplasmen. VIC/VEC-Isolierung und -Expansion
SM22a-AntikörperAbcamab14106Primärer Antikörper (VIC-positiver Farbstoff)
Schere mit StandardmusterFine Science Tools14001-14Gewebevorbereitung, VIC/VEC-Isolierung
Steriles WattestäbchenPuritan25806 10WCVEC-Isolierung
Swingsette Kassette für menschliches GewebeSimport ScientificM515-2Behälter für die Gewebeeinbettung
Taylor Forceps (17cm)Fine Science Tools11016-17Gewebevorbereitung, VIC/VEC-Isolierung
Trypan Blue Solution, 0,4%Gibco15250061Zellzähllösung
TrypLE Express EnzymGibco12604021Spaltung von VIC/VECs
Von Kossa KitPolysciences246331Färben von Paraffinschnitten von Geweben zur Verkalkung
von-Willebrand-Faktor-AntikörperAbcamab68545Primärantikörper (VEC-positiver Farbstoff)
XyloleFisher ChemicalX3S-4Entparaffinisierende Gewebeproben
αSMA-AntikörperAbcamab7817Primärantikörper (VIC-positiver Farbstoff)

Referenzen

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