Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme menschlicher Aortenklappen, die während chirurgischer Aortenklappenersatzverfahren oder aus Leichengewebe extrahiert werden, und die anschließende Isolierung, Expansion und Charakterisierung patientenspezifischer primärer Klappenendothel- und interstitieller Zellen. Enthalten sind wichtige Details zu den Prozessen, die erforderlich sind, um die Zelllebensfähigkeit und Phänotypspezifität sicherzustellen.
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Methodenartikel
Isolierung humaner primärer Klappenzellen für die In-vitro-Krankheitsmodellierung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die kalzifische Aortenklappenerkrankung (CAVD) ist bei fast einem Drittel der älteren Bevölkerung vorhanden. Verdickung, Versteifung und Verkalkung der Aortenklappe verursacht Aortenstenose und trägt zu Herzinsuffizienz und Schlaganfall bei. Die Krankheitspathogenese ist multifaktoriell, und Belastungen wie Entzündungen, extrazelluläres Matrixumbau, turbulenter Fluss und mechanische Belastung und Belastung tragen zur osteogenen Differenzierung von Klappendothel- und Klappeninterstitialzellen bei. Die genauen auslösenden Faktoren, die den osteogenen Übergang einer gesunden Zelle in eine kalzifizierende Zelle vorantreiben, sind jedoch nicht vollständig definiert. Weiterhin ist die einzige aktuelle Therapie bei CAVD-induzierter Aortenstenose der Aortenklappenersatz, bei dem die native Klappe entfernt wird (chirurgischer Aortenklappenersatz, SAVR) oder eine vollständig zusammenklappbare Ersatzklappe über einen Katheter eingeführt wird (Transkatheter-Aortenklappenersatz, TAVR). Diese chirurgischen Eingriffe sind mit hohen Kosten und ernsthaften Risiken verbunden. Daher ist die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele für die Wirkstoffforschung unerlässlich. Zu diesem Zweck entwickelt die vorliegende Studie einen Workflow, bei dem chirurgisch entferntes Gewebe von Patienten und Spenderkadavergewebe verwendet werden, um patientenspezifische primäre Linien von Herzklappenzellen für die In-vitro-Krankheitsmodellierung zu erstellen. Dieses Protokoll führt die Verwendung einer Kühllagerlösung ein, die üblicherweise bei Organtransplantationen verwendet wird, um die Schäden zu reduzieren, die durch die oft lange Beschaffungszeit zwischen der Gewebeentfernung und der Laborverarbeitung verursacht werden, mit dem Vorteil, dass die Zellen des herausgeschnittenen Gewebes stark stabilisiert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass isolierte Klappenzellen ihre proliferative Kapazität und endothelialen und interstitiellen Phänotypen in Kultur über mehrere Tage nach der Klappenentfernung vom Spender behalten. Die Verwendung dieser Materialien ermöglicht die Sammlung von Kontroll- und CAVD-Zellen, aus denen sowohl Kontroll- als auch Krankheitszelllinien gebildet werden.
Einleitung
Die kalzifische Aortenklappenerkrankung (CAVD) ist eine chronische Pathologie, die durch Entzündung, Fibrose und Makroverkalzifizierung von Aortenklappenflügeln gekennzeichnet ist. Ein fortschreitender Umbau und eine Verkalkung der Blättchen (Aortensklerose genannt) kann zur Behinderung des Blutflusses (Aortenstenose) führen, was zum Schlaganfall beiträgt und zu Herzversagen führt. Derzeit ist die einzige Behandlung für CAVD der chirurgische oder Transkatheter-Aortenklappenersatz (SAVR bzw. TAVR). Es gibt keine nicht-chirurgische Möglichkeit, die CAVD-Progression zu stoppen oder umzukehren, und ohne Klappenersatz nähern sich die Sterblichkeitsraten innerhalb
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Protokoll
Alle Patientenproben stammen von Personen, die an Studien teilnehmen, die vom institutionellen Prüfungsausschuss der Universität Pittsburgh in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki genehmigt wurden. Leichengewebe, das über das Center for Organ Recovery and Education (CORE) gewonnen wurde, wurde vom University of Pittsburgh Committee for Oversight of Research and Clinical Training Involving Decedents (CORID) genehmigt.
1. Zulassung und Sicherheit
- Einholung der Genehmigung des Institutional Review Board (IRB) oder eines freigestellten Vermerks für die Entnahme von Patientenproben oder Leichengewebe gemäß der Deklaration v....
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Ergebnisse
Das obige Protokoll beschreibt die Schritte, die für den Umgang mit menschlichem Klappengewebe und die Isolierung und Etablierung lebensfähiger Zelllinien aus diesen Geweben erforderlich sind. Leaflets der Aortenklappe werden zur Paraffineinbettung verarbeitet, für die Langzeitlagerung für biochemische oder genetische Analysen eingefroren und zur Isolierung von VECs und VICs verdaut (Abbildung 1). Während chirurgische Proben wahrscheinlich eine klinische Diagnose einer Aortenstenose haben un.......
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Diskussion
Die Gewinnung von Kontroll- und Krankheitsgewebe vom Menschen ist entscheidend für die In-vitro- und Ex-vivo-Krankheitsmodellierung. Während man jedoch oft über die Herausforderungen spricht, die Lücke zwischen Bank und Krankenbett zu überbrücken, ist die umgekehrte Reihenfolge - vom OP-Raum zur Bank - oft genauso entmutigend. Wesentlich für einen Grundlagenwissenschaftler, um primäre menschliche Gewebeproben zu erhalten, ist eine Zusammenarbeit mit einem investierten Chirurgenwissenschaftler, der über ein Team von Krank.......
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Offenlegungen
IS erhält institutionelle Forschungsunterstützung von Atricure und Medtronic und fungiert als Berater für Medtronic Vascular. Keiner dieser Konflikte steht im Zusammenhang mit dieser Arbeit. Alle anderen Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken Jason Dobbins für die aufschlussreiche Diskussion und kritische Lektüre dieses Manuskripts. Wir möchten dem Center for Organ Recovery and Education für seine Hilfe und Unterstützung danken und danken den Gewebespendern und ihren Familien, die diese Studie ermöglicht haben. Alle Patientenproben stammen von Personen, die an Studien teilnehmen, die vom institutionellen Prüfungsausschuss der Universität Pittsburgh in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki genehmigt wurden. Leichengewebe, das über das Center for Organ Recovery and Education (CORE) gewonnen wurde, wurde vom University of Pittsburgh Committee for Oversight of Research and Clinical Traini....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ m Filter | Thermo Scientific | 7211345 | Präparationsplatte mit Kollagenbeschichtung |
| 10 cm Zellkulturplatte | Greiner Bio-One | 664160 | Zellkultur-/Zelllinienerweiterung |
| 10 mL serologische Pipette | Fisher | 14955234 | VEC/VIC Isolierung, Zellkultur, Zelllinienerweiterung |
| 1000 μ L-Filterspitzen | VWR | 76322-154 | Zellkultur-/Zelllinienerweiterung |
| 10XL Filterspitzen | VWR | 76322-132 | Zellkultur-/Zelllinienerweiterung |
| 15 mL konische Röhrchen | Thermo Scientific | 339650 | Gewebelagerung, VIC/VEC-Isolierung |
| 16 % wässrige Paraformaldehyd-Lösung | Elektronenmikroskopie Sciences | 15710S | Gewebe- und Zellfixiermittel |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Desinfektion |
| 1x DPBS: kein Kalzium, kein Magnesium | Gibco | 14190250 | Kochsalzlösung. VIC/VEC Isolierung |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Kochsalzlösung. Gewebeaufbereitung, VIC/VEC Isolierung |
| 20 μ L Filterspitzen | VWR | 76322-134 | Zellkultur-/Zelllinienerweiterung |
| 200 Proof Ethanol | Decon | 2701 | Entparaffinierung von Gewebeproben |
| 2-Propanol | Fisher | A416P 4 | Herstellung von kollagenbeschichteten Platten |
| 5 mL serologische Pipette | Fisher | 14955233 | VEC/VIC-Isolierung, Zellkultur, Zelllinienerweiterung |
| 50 mL konische Röhrchen | Thermo Wissenschaftliche | 339652 | Gewebelagerung, VIC/VEC-Isolierung |
| 60-mm-Schale | GenClone | 25-260 | VEC-Isolierung |
| 6-Well-Zellkulturplatte | Corning | 3516 | Zellkultur-/Zelllinienerweiterung |
| Essigsäure, Gletscher | Fisher | BP2401 500 | Herstellung von kollagenbeschichteten Platten |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluoreszierend f-actin Gegenfärbung |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Gewebespeicherlösung |
| Rinderserum Albumin, Fraktion V - Fettsäurefrei 25g | Bioworld | 220700233 | VEC Bestätigung mit CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 Antikörper | Abcam | ab46794 | Primärer Antikörper (VIC-positiver Farbstoff) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primärer Antikörper (VEC-positiver Farbstoff) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC-Bestätigung mit CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primärer Antikörper (VEC-positiver Farbstoff) |
| Zellsieb mit 0,70 μ m Poren | Corning | 431751 | VIC Isolierung |
| Kollagen 1, Rattenschwanzprotein | Gibco | A1048301 | Herstellung von kollagenbeschichteten Platten |
| Kollagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Gewebeverdauung. Gewebeaufbereitung, VIC/VEC-Isolierung |
| Conflikt Gebrauchsfertiges Desinfektionsspray | Decon | 4101 | Desinfektion |
| Countess II Automatisierter Zellzähler | Invitrogen | A27977 | Automatisierter Zellzähler |
| Countess II wiederverwendbare Objektträger | Invitrogen | 2026h | Automatisierter Zellzähler erforderlicher Objektträgerdeckel |
| Deckgläser | Fisher | 125485E | Einbetten von Ventilproben |
| Kryogene Fläschchen | Olympus Plastics | 24-202 | Einfrieren von Zell-/Gewebeproben |
| Desinfizierendes Bleichmittel mit CLOROMAX - Konzentrierte Formel | Clorox | N/A | Desinfektion |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Wachstumsmedien. VIC-Expansion |
| EBM - Endotheliales Zellmedium, Basalmedium, Phenolrotfrei 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Wachstumsmedien. VEC-Expansion |
| EGM-2 Endothelzelle Medium-2 - 1 Kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Nahrungsergänzungsmittel für Wachstumsmedien. VEC-Expansion |
| EVOS FL Mikroskop | Life Technologies | Modellnummer: AME3300 | Fluoreszenzbildgebung |
| EVOS XL Mikroskop | Life Technologies | AMEX1000 | Visualisierung von Zellen während der Zelllinienexpansion |
| Fötales Kälberserum - Premium Select | R& D Systems | S11550 | VIC-Expansion |
| Feine Schere | Fine Science Tools | 14088-10 | Gewebeaufbereitung, VIC/VEC-Isolierung |
| Fisherbrand Zellschaber | Fisher | 08-100-241 | VIC-Expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antimykotikum: Gewebeaufbereitung, VIC/VEC-Isolierung |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotikum: Gewebevorbereitung, VIC/VEC-Isolierung |
| Objektträger Objektträger | Globe Scientific Inc | 1358L | Montage Ventilproben |
| Ziege Anti-Maus 488 | Invitrogen | A11001 | Fluoreszierender Sekundärantikörper |
| Ziege Anti-Maus 594 | Invitrogen | A11005 | Fluoreszierender Sekundärantikörper |
| Ziege Anti-Kaninchen 488 | Invitrogen | A11008 | Fluoreszierend Sekundärer Antikörper |
| Ziege Anti-Kaninchen 594 | Invitrogen | A11012 | Fluoreszierender Sekundärantikörper |
| Invitrogen Countess II FL Wiederverwendbarer Objektträger | Invitrogen | A25750 | Automatisierter Zellzähler erforderlicher Objektträger |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagenz (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluoreszierender Zellkern-Gegenfärbemittel |
| LM-HyCryo-STEM - 2X Kryokonservierungsmedien für Stammzellen | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Lagerung von gefrorenen Zellen |
| Eindeckmedium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Einbettung von Proben |
| mit Ventil Mr. Frosty Gefrierbehälter | Nalgene | 51000001 | Behälter für kontrolliertes Einfrieren von Proben |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Desinfektion |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotikum. VIC-Expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-Mykoplasmen. VIC/VEC-Isolierung und -Expansion |
| SM22a-Antikörper | Abcam | ab14106 | Primärer Antikörper (VIC-positiver Farbstoff) |
| Schere mit Standardmuster | Fine Science Tools | 14001-14 | Gewebevorbereitung, VIC/VEC-Isolierung |
| Steriles Wattestäbchen | Puritan | 25806 10WC | VEC-Isolierung |
| Swingsette Kassette für menschliches Gewebe | Simport Scientific | M515-2 | Behälter für die Gewebeeinbettung |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Gewebevorbereitung, VIC/VEC-Isolierung |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | Zellzähllösung |
| TrypLE Express Enzym | Gibco | 12604021 | Spaltung von VIC/VECs |
| Von Kossa Kit | Polysciences | 246331 | Färben von Paraffinschnitten von Geweben zur Verkalkung |
| von-Willebrand-Faktor-Antikörper | Abcam | ab68545 | Primärantikörper (VEC-positiver Farbstoff) |
| Xylole | Fisher Chemical | X3S-4 | Entparaffinisierende Gewebeproben |
| αSMA-Antikörper | Abcam | ab7817 | Primärantikörper (VIC-positiver Farbstoff) |
Referenzen
- Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
- Nishimura, R. A., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
