Screening von Peptiden, die MRGPRX2 mit engineered HEK Cells aktivieren

Mastzellen sind ein integraler Bestandteil des Immunsystems und spielen eine entscheidende Rolle sowohl bei angeborenen als auch bei adaptiven Immunantworten. Mastzellen werden in erster Linie entweder durch die Bindung eines Antigens an den Immunglobulin E (IgE) - FcεRI-Rezeptorkomplex oder durch den kürzlich entdeckten mas-verwandten G-Proteinrezeptor-X2 (MRGPRX2)¹aktiviert. Die MRGPRX2-Aktivierung wurde mit mehreren Immun- und Entzündungskrankheiten in Verbindung gebracht, und daher ist es wichtig, den Bindungsmechanismus des Rezeptors an seine Liganden zu verstehen². Dazu wurde eine Bibliothek kleiner Peptidmoleküle entwickelt und gegen MRGPRX2-Rezeptoren gescreent, die in HEK-Zellen überexprimiert wurden. In der Studie wurde die Peptidbibliothek mit den einfachen und vielseitigen Techniken des Alanin-Scannings und der Aminosäurekürzung konstruiert. Beim Alanin-Scanning werden bestimmte Aminosäuren durch einen Alaninrest ersetzt. Da Alanin klein und neutral ist, entfernt es dem Peptid die spezifischen Eigenschaften, die der ersetzte Rückstand verleiht, und unterstreicht nacheinander die Bedeutung der jeweiligen physikalisch-chemischen Eigenschaften der Aminosäure in Rezeptorinteraktionen. Im Gegenteil, bei der Aminosäurekürzung sind Peptidsequenzen so konzipiert, dass ein oder mehrere Aminosäurereste aus dem N-Terminal, C-Terminal oder beiden fehlen. Dieser Satz von Peptiden wurde verwendet, um die Aminosäuresequenzen zu identifizieren, die für die MRGPRX2-Bindung entscheidend sind.

Die Erfahrung mit menschlichen Mastzellenlinien (LAD-2) hat gezeigt, dass diese Zellen schwer zu kulturieren und in vitrozu pflegen sind: eine Verdopplungszeit von zwei Wochen, teure mittlere Ergänzungen und direkte Aufmerksamkeit während des Passierens^{erforderlich 3}. Diese Eigenschaften machen die Zellen ungeeignet für ein großflächiges Screening potenzieller Liganden. Hierin wurden stabil transfizierte HEK-Zellen, die den MRGPRX2-Rezeptor (HEK-X2) exprimieren, verwendet, um die Peptidbibliothek¹zu screenen. HEK-293-Zellen sind weit verbreitet und werden für die heterologe Expression von Oberflächenrezeptoren aufgrund ihrer hohen Transfektionseffizienz, schnelleren Verdopplungsrate und der Notwendigkeit, untentbstliche mittlere Ergänzungen im Labor kultiviert zu^{werden, untersucht 4}. Das Protokoll zur Transfektiose der HEK-293-Zelllinie wurde nachgewiesen und ist gut etabliert⁵. HEK-293-Zellen, die stabil den MRGPRX2-Rezeptor exprimieren (Passage 13-19), wurden mit den Peptiden aktiviert, die durch N-Kürzung, C-Trunkierung, N + C-Kürzung und Alanin-Scanning erzeugt wurden¹. Wildtyp-HEK-Zellen (HEK-WT) (Passage 16-21) wurden als Kontrolle verwendet. Die intrazelluläre Kalziumfreisetzung bei Aktivierung wurde überwacht, um die MRGPRX2-basierte Aktivierung zu untersuchen.

Auf die Zellaktivierung durch MRGPRX2 folgt eine zytosolische Calciummobilisierung. Diese regulierte intrazelluläre Kalziumfreisetzung in Mastzellen wird durch den speicherbetriebenen Kalziumeintrag (SOCE) reguliert, der durch das stromale Wechselwirkungsmolekül 1 (STIM1) koordiniert wird; und ist zentral für die Immunantwortkaskade^6,7. Verschiedene Methoden wurden verwendet, um die intrazelluläre Kalziumkonzentration nachzuweisen, einschließlich Patch-Clamps und fluoreszierende Farbstoffe⁸. Von allen verfügbaren Techniken werden fluorometrische Calciumfarbstoffe in Konjugation mit verschiedenen Nachweistechniken weit verbreitet verwendet⁹. Zwei Arten von fluorometrischen Farbstoffen, die Interesse gewonnen haben, sind nämlich Einzelwellenlängenfarbstoffe wie Fluo-4 und duale wellenlängenverhältnismetrische Farbstoffe wie Indo-1 und Fura-2. Der Vorteil, den ratiometrische Farbstoffe mit zwei Wellenlängen gegenüber Farbstoffen mit einer Wellenlänge bringen, besteht darin, dass die ratiometrischen Farbstoffe experimentelle Fehler wie Farbstoffbeladung, Fotobleichen und Fokussieren^{korrigieren 10,11}.

Fura-2-Acetoxymethylester (Fura-2 AM) ist ein zelldurchlässiger, grün fluoreszierender Farbstoff, dessen Anregung sich bei der Calciumbindung auf eine niedrigere Wellenlänge verschiebt. Experimentell wird Fura-2 bei 340 und 380 nm angeregt, während die Emission bei 510 nm aufgezeichnet wird. Bei der Calciumbindung nimmt die Fluoreszenzintensität bei 340 nm zu, während die von 380 nm abnimmt, wie in Abbildung 1gezeigt. Die Daten werden als Verhältnis der Fluoreszenzintensität nach Anregung bei 340 nm (F340) zu der Intensität nach Anregung bei 380 nm (F380) dargestellt, d. h. F340/F380. Das F340/F380-Verhältnis ist proportional zu intrazellulärem Kalzium, dessen Wert durch die Grynkiewicz-Gleichung¹²berechnet werden kann. Da das Fluoreszenzsignal aus der Anregung des Farbstoffs bei zwei Wellenlängen (340 nm und 380 nm) gewonnen wird, korrigiert das Verhältnis der Fluoreszenzsignale experimentelle Faktoren wie Farbstoffbelastung, Farbstoffleckage, Photobleaching und Zelldichten.

1. Design und Entwicklung der Peptidbibliothek

1. Um die Liganden des MRGPRX2-Rezeptors der Mastzelle basierend auf einem bekannten Liganden, d. H. PAMP-12^13,zu identifizieren, führen Sie die folgenden Schritte aus.
   1. Generieren Sie eine N-verkürzte Peptidbibliothek, indem Sie die N-terminalen Aminosäurereste des Liganden nacheinander durch Festphasenpeptidsynthese (SPPS) abschneiden.
   2. Generieren Sie eine C-verkürzte Peptidbibliothek, indem Sie die C-terminalen Aminosäurereste des bekannten Liganden nacheinander durch SPPS abschneiden.
   3. Basierend auf den Ergebnissen von 1.1.1 und 1.1.2 generieren Sie eine N+C-verkürzte Peptidbibliothek mit SPPS, indem Sie die gewünschten Rückstände aus dem N- bzw. C-Terminal abschneiden.
   4. Verwenden Sie die Festphasenpeptidsynthese, um die Peptide zu synthetisieren¹³.
   5. Modifizieren Sie die N-terminale zu Acetyl (Ac) -Gruppe und C-terminal zu Amid-Gruppe.
   6. Charakterisieren Sie das Peptid für seine Reinheit mit Hilfe der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) und für die Masse mit einem Massenspektrophotometer.
2. Um die Bedeutung bestimmter Aminosäuren innerhalb des PAMP-12-Ausgangsmoleküls zu untersuchen, führen Sie die folgenden Schritte aus.
   1. Generieren Sie eine Alanin-Scanning-Peptidbibliothek, indem Sie die jeweiligen Aminosäurereste im Peptidmolekül durch Alanin ersetzen, einer nach dem anderen mit SPPS. Modifizieren Sie die N-terminale zu Acetyl (Ac) -Gruppe und C-terminal zu Amid-Gruppe.
   2. Charakterisieren Sie das Peptid für seine Reinheit mit Hilfe der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) und für die Masse mit einem Massenspektrophotometer.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die synthetisierten Peptide von hoher Reinheit sind. Charakterisieren Sie die Peptide mittels Massenspektroskopie und HPLC.

2. In-vitro-Zellkultur

1. Kulturieren Sie HEK-X2- und HEK-WT-Zellen, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Bereiten Sie das Kulturmedium vor, indem Sie DMEM mit hohem Glukosegehalt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin ergänzen.
   2. Die Zellen werden in mit Gewebekultur (TC) behandelten T-75-Kulturkolben durchgesiweise und wachsen in einem Inkubator bei 37 °C mit 5% CO_2,bis sie zu 75-80% konfluent sind.
   3. Sobald 75% konfluent, waschen Sie die Zellen und fügen Sie 2-3 ml Trypsin für 2 - 3 min hinzu. Inkubieren Sie in einem 37 °C, 5% CO₂ Inkubator, um die Zellen zu lösen.
   4. Sobald sich die Zellen gelöst haben, sammeln Sie die Zellen in Trypsin. Fügen Sie 6-9 ml frisches Medium hinzu.
   5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1620 x g für 3-5 min.
   6. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen, um das Pellet zu sammeln. Resuspendieren Sie die Zellen in einem frischen Kulturmedium. Verdünnen Sie die Zellen gemäß der gewünschten Konzentration.
      HINWEIS: HEK-Zellen sind schnell wachsende Zellen und optimieren daher die Zellmediumergänzungen. HEK-Zellen sind adhärente Zellen; Sie werden in TC-behandelten Kulturkolben zur Unterstützung der Haftung eingesetzt.
2. Bereiten Sie eine 96-Well-Assay-Platte für das Experiment vor.
   1. Fügen Sie 200 μL der Zellsuspension in jeder Vertiefung mit einer Konzentration von 200.000 Zellen / ml hinzu, um 40.000 Zellen / Well zu säen.
   2. Züchten Sie die Zellen für 24 h in einem 37 °C, 5% CO₂ Inkubator.
      HINWEIS: Optimieren Sie die Zelldichte pro Vertiefung basierend auf der Plattengröße und dem Zellstammtyp. Führen Sie das Experiment in Triplikaten in einer schwarzen TC-behandelten 96-Well-Platte mit flachem transparentem Boden durch.

3. Fura-2 AM Calcium-Assay

1. Bereiten Sie den Farbstoff vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Verwenden Sie Fura-2 AM Farbstoff für das Experiment.
   2. Bereiten Sie den Pufferpuffer (HTB) von HEPES-Tyrode vor, der 25 mM HEPES-Puffer, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mg/ml Glukose, 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) und frisch zugegebene 1,8 mM CaCl₂ in autoklavsterilisiertem Wasser enthält.
   3. Fügen Sie 50 μL DMSO in 50 μg Fura-2 AM-Durchstechflasche hinzu, um 1 mM Stammlösung von Fura-2 AM-Farbstoff herzustellen. Fügen Sie 1 μL 1 mM Fura-2 AM-Farbstoff pro ml frisches Medium hinzu, um das Farbstoffbeladungsmedium mit einer Farbstoffkonzentration von 1 μM herzustellen.
   4. Entfernen Sie die 96-Well-Platte aus dem Inkubator und entsorgen Sie das Medium. Ersetzen Sie das Medium durch ein frisches Farbstofflademedium. Fügen Sie 200 μL Farbstoffbeladungsmedium in jede Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 30-40 min in einem 37 °C, 5% CO₂ Inkubator_.
   5. Nach 40 Minuten Inkubation das Medium entfernen. Waschen Sie die Zellen mit dem HTB-Puffer. Fügen Sie 100 μL HTB-Puffer zum Fluoreszenzlesen hinzu. Nehmen Sie die Platte zum Fluoreszenzlesen.
      HINWEIS: Optimieren Sie die Farbstoffkonzentration im Farbstoffbeladungsmedium. Farbstoffleckage und Photobleaching sind mögliche Bedenken im Zusammenhang mit dem Farbstoff. Fügen Sie CaCl₂ frisch in den HTB-Puffer hinzu, um Niederschlag zu vermeiden.

4. Zellaktivierung und fluoreszierende Ablesung

HINWEIS: Fluoreszenzplattenleser mit einem automatisierten Pipettiersystem ermöglicht den automatischen Transfer von Verbindungen von einer Verbindungsquelle auf die Assayplatte, ohne die Platte aus dem Plattenleser zu nehmen.

1. Während die Zellen inkubiert werden, stellen Sie den Plattenleser ein.
   1. Stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein.
   2. Wählen Sie unter Einstellungendie Option Flexaus.
   3. Stellen Sie den Lesemodus auf Fluoreszenz und Bottom readein.
   4. Legen Sie unter Wellenlängen die Anzahl der Wellenlängen auf 2 fest. Stellen Sie die Anregung auf 340 nm und 380 nm ein. Stellen Sie die Emission auf 510 nm ein.
   5. Belassen Sie die Empfindlichkeit auf Standard.
   6. Legen Sie unter Timingdas Intervall auf 3,9 s fest. Stellen Sie die Laufzeit auf 94 s ein, um 25 Lesevorgänge zu erhalten.
   7. Wählen Sie als Nächstes den Assay-Plattentyp aus.
   8. Wählen Sie als Nächstes die zu lesenden Wells aus.
   9. Legen Sie in Compound Transfer (Compound Transfer) die Option Transfers (Transfers to 1) und Initial Volume (Anfangsvolumen) auf 100 μL (100 μL), Volume (Volume auf 50 μL) und Time Point (Zeitpunkt auf 36 s) fest, um die Verbindung beim 10. Messwert hinzuzufügen.
   10. Wählen Sie als Nächstes den Plattentyp Compound Source aus.
   11. Lassen Sie Triturate auf Nicht verwendet.
   12. Wählen Sie die Spitzen im Layout der Pipettenspitzen aus.
   13. Stellen Sie bei Compound- und Tip-Säulensicher, dass sich die zu übertragenden Verbindungen in Spalte 1 der Verbundplatte befinden. Legen Sie die Spitzenspalte auf 1 und die zusammengesetzte Spalte auf 1 fest.
   14. Lassen Sie die Automatische Kalibrierung auf EIN.
   15. Klicken Sie auf OK.
2. Wenn die Temperatur 37 °C erreicht hat, laden Sie die Platten in den Plattenleser.
   1. Drücken Sie die Lesekammer, um die Assay-Platte in den Fluoreszenzplattenleser einzulegen.
   2. Drücken Sie die Quelle, um die zusammengesetzte Platte einzulegen. Die Verbindungsplatte wird durch Zugabe von 200 μL der entsprechenden Peptide, Ionomycin und Ethylenglykol-Bis(β-Aminoethylether)-N,N,N′,N′-Tetraessigsäure (EGTA)-Triton X-100-Lösungen hergestellt.
   3. Drücken Sie das Tip Rack, um die Tip Boxzu platzieren. Verwenden Sie eine schwarze Spitze, um eine Autofluoreszenz der Spitze zu vermeiden.
   4. Sobald die Platten geladen sind, überprüfen Sie die Einstellungen der Software und drücken Sie Lesen.

5. Datenanalyse

1. Bestimmen Sie die Kalziumkonzentration aus dem Fluoreszenzverhältnis durch die Grynkiewicz-Gleichung -
   
   wobei K_d die Dissoziationskonstante von Fura-2 AM ist, R das Emissionsverhältnis nach Anregung bei 340 nm und 380 nm (F340/F380) für die jeweiligen Peptide, R_max das maximale Fluoreszenzverhältnis, das durch Die Zugabe von 50 μL von 30 μM Ionomycin beobachtet wird, R_min die minimale Fluoreszenz ist, die durch die Zugabe von 50 μL von 100 mM EGTA/2,5% Triton X-100 beobachtet wird, und F380_min und F380_max sind die absolute Fluoreszenzintensität von Fura-2 AM im calciumfreien bzw. gebundenen Zustand.
   HINWEIS: Die Maschine dosiert die Flüssigkeit mit etwas Kraft. Stellen Sie die Peptiddosierhöhe nicht zu nahe an den Boden der Platte ein; es kann die Zellen lösen. Verwenden Sie schwarze Pipettenspitzen, um Autofluoreszenz zu vermeiden. Lesen Sie die maximale Fluoreszenz und die minimale Fluoreszenz für jede Platte für jedes Experiment.

Tabelle 1 enthält die Peptidsequenzen, die durch terminale Aminosäurekürzung und Alanin-Scanning erzeugt werden. Wie in Tabelle 1gezeigt, fehlt der Peptidsequenz RKKWNKWALSR N-terminales Phenylalanin (F) in Bezug auf sein Mutterteil PAMP-12 und ist daher ein repräsentatives Peptid in der N-verkürzten Bibliothek. In ähnlicher Weise wurde in FRKKWNKWALS PAMP-12 C-terminales Serin entfernt, das eine C-verkürzte Peptidbibliothek darstellt, die von PAMP-12 abgeleitet ist. In der N+C-verkürzten Peptidbibliothek werden Aminosäuren sowohl aus N- als auch aus C-terminalen Entfernt. Die Kürzung von 4 Aminosäuren aus dem N-Terminal und 1 Rückstand aus dem C-Terminal von PAMP-12 führt zu WNKWALS. Die peptidbibliothek, die aus dem Alanin-Scanning gewonnen wird, hat eine Aminosäure durch Alanin ersetzt, wie bei ARKKWNKWALSR, wo N-terminales Phenylalanin durch Alanin ersetzt wird. Fura-2 AM-Farbstoff wurde verwendet, um das Aktivierungspotenzial von Peptiden gegen MRGPRX2-transfizierte HEK-Zellenzu untersuchen 1. Die Daten wurden auf einem Fluoreszenzplattenleser aufgezeichnet. Wenn der Peptidligand die Zelle aktiviert, steigt die bei 340 nm (F340) gepumpte Fluoreszenz an, während die gleiche für 380 nm Wellenlänge (F380) abnimmt(Abbildung 1a). Für einen Rohling (oder eine nicht aktivierende Peptid- oder HEK-WT-Kontrolle) wäre der relative Anstieg und die relative Abnahme jedoch jeweils gering, wie in Abbildung 2agezeigt. Die Kalziumkonzentration wird jedoch durch das Verhältnis F340/F380 dargestellt, wie in Abbildung 1b,2bdargestellt. Das Verhältnis F340/F380 kann in der Grynkiewicz-Gleichung weiter substituiert werden, um die Kalziumkonzentration mit in situ-Kalibrierungen zu erhalten (Abbildung 3). Die in Tabelle 1 aufgeführten Peptide wurden durch Massenspektroskopie (Abbildung 4a) und HPLC (Abbildung 4b) charakterisiert und als hochrein befunden.

Tabelle 1: Repräsentative Peptidsequenzen, die nach N,C- und N+C-Kürzung und Alanin-Scanning erzeugt werden. Das N-Terminal der Peptide war acetylmodifiziert, während das C-Terminal eine Amidgruppe enthielt.

Abbildung 1: Repräsentative Daten für ein aktivierendes Peptid. (a) Die Fluoreszenzsignale für ein aktivierendes Peptid. Die dargestellten Daten entsprechen PAMP-12 (FRKKWNKWALSR). Peptid wurde hinzugefügt, nachdem eine Baseline für 10 Lesezyklen (36 s) generiert wurde, wie der Pfeil zeigt. b) Das Verhältnis der Fluoreszenzemission nach Anregung bei 340 nm (F340) zu der Fluoreszenzemission nach Anregung bei 380 nm (F380) (F340/F380). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative Daten für den Rohling. (a) Die Fluoreszenzsignale für den Rohling. HTB wurde hinzugefügt, nachdem eine Baseline für 10 Lesezyklen (36 s) generiert wurde, wie der Pfeil zeigt. b) Das Verhältnis der Fluoreszenzemission nach Anregung bei 340 nm (F340) zu der Fluoreszenzemission nach Anregung bei 380 nm (F380) (F340/F380). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative Daten für die Standards für die Farbstoffkalibrierung. (a) Ionomycin wurde bei 10. Messwerten, wie durch den Pfeil dargestellt, hinzugefügt, um eine maximale Fluoreszenz im Ca+ 2-gebundenen Zustand zu erhalten. EGTA-Triton X-100 wurde nach 20 Messwerten hinzugefügt, wie der Pfeil zeigt, um ein minimales Signal zu erhalten. b) Das Verhältnis der Fluoreszenzemission nach Anregung bei 340 nm (F340) zu der Fluoreszenzemission nach Anregung bei 380 nm (F380) (F340/F380). Diese Werte werden weiter in die Grynkiewicz-Gleichung aufgenommen, um die intrazelluläre Kalziumkonzentration zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Charakterisierung eines repräsentativen Peptids zur Bestätigung der Sequenz und Reinheit. (a) Die theoretische Masse der repräsentativen Peptidsequenz WNKWAL betrug 857,90 Da, was durch das m/z-Verhältnis in der Massenspektroskopie gezeigt wurde. b)Die Reinheit des Peptids von 99 %, wie durch HPLC bestätigt. Dieses Peptid gehört zur N+C-verkürzten Peptidbibliothek. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Autoren erklären keine Interessenkonflikte.