$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Experimente mit hPS-Zellen wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt und in einer Biosicherheitshaube der Klasse II mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt. Alle Reagenzien sind Zellkulturqualität, sofern nicht anders angegeben. Alle Kulturen werden bei 37 °C, 5% CO2 Luftatmosphäre inkubiert. In allen Stadien des Assays können embryonale Körper oder Nierenorganoide gesammelt und fixiert oder für die Analyse vorbereitet werden. Die hPSC-Leitungen, die zur Generierung dieser Daten verwendet wurden, wurden vollständig charakterisiert undveröffentlicht 18.
1. Vorbereiten von Kulturplatten
HINWEIS: Beschichten Sie ca. 1 h vor dem Aufspalten von hPSCs 2 x 100 mm große Gewebekulturplatten mit einem stammzellqualifizierten Basalmembranmatrixextrakt (BME). Man darf die Platten vorbeschichten, mit einer Paraffinfolie versiegeln und nach Herstellerangaben bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie 2 x 100 mm Gewebekultur-behandelte Platten (1 für Nierenorganoid-Assay, 1 zur Aufrechterhaltung der Zelllinie) und einen 15 ml konischen Schlauch in der Biosicherheitshaube der Klasse II vor.
- Aliquot 8 ml kaltes, serumfreies Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) in ein 15 mL konisches Rohr und ~ 4 ml in jede der 100 mm Platten, genug, um den Boden jeder Platte mit Medium zu bedecken.
- Nehmen Sie ein 100 μL Aliquot BME aus dem Gefrierschrank (-20 °C). Nehmen Sie mit einer serologischen 2-ml-Pipette ~ 1 ml kaltes DMEM aus der 15 ml konischen Röhre. Tauen Sie das BME-Aliquot langsam auf, indem Sie mit dem kalten DMEM sanft auf und ab pipettieren und Blasen vermeiden.
HINWEIS: Lassen Sie BME aliquot nicht bei Raumtemperatur sitzen. Sofort verwenden.
- Überführen Sie das aufgetaute DMEM/BME mit dem restlichen DMEM zurück in das 15 ml konische Rohr. Mischen Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette den verdünnten BME vorsichtig, indem Sie mindestens 8 Mal auf und ab pipettieren, um den BME gleichmäßig zu verteilen und Blasen zu vermeiden.
- Übertragen Sie 4 ml des verdünnten BME mit DMEM in jede Platte und schwenken Sie die Platte vorsichtig, so dass der BME gleichmäßig verteilt ist. Inkubieren Sie die beschichtete Platte für 1 h bei Raumtemperatur oder 30 min bei 37 °C.
HINWEIS: Verwenden Sie 50 μL BME pro 100 mm Platte. Die Verwendung anderer hPSC-Kulturmedien und Zelllinien kann unterschiedliche Konzentrationen von BME erfordern.
2. Weitergabe von hPSCs
HINWEIS: Für die routinemäßige hPSC-Kultur sind die Passage von Zelllinien bei 70-80% Konfluenz.
- Saugen Sie das Kulturmedium von der hPSC-Platte ab, die durchgelassen werden soll. Geben Sie ~ 8 ml Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) in die hPSC-Platte und schwenken Sie sie vorsichtig, um die Zellen zu waschen.
- Aspirieren Sie DBPS und fügen Sie 2 ml sanftes Zelldissoziationsreagenz (GCDR) zu der 100-mm-Platte hinzu, tropfenweise darüber, um die Zellen abzudecken.
HINWEIS: Andere Dissoziationsreagenzien können ebenfalls verwendet werden. Passen Sie sich entsprechend an.
- Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für ~ 6-8 Minuten, bis die Kolonien aufbrechen und die Zellen unter Phasenkontrast refraktiv sind (Abbildung 2A).
HINWEIS: Das Timing kann zwischen den Zelllinien variieren. Passen Sie sich entsprechend an.
- Bereiten Sie während der Inkubation eine 50 ml konische Röhre vor. 16 ml hPSC-Medium (8 ml pro 100 mm Platte) zugeben und Rho-assoziierten Kinase-Inhibitor (ROCKi) zu einer Endkonzentration von 5 μM hinzufügen.
- Aspirieren Sie DMEM aus den BME-beschichteten Platten und fügen Sie jeder Platte 8 ml hPSC-Medium plus ROCKi hinzu.
- Wenn die Zellen bereit sind (wie in Punkt 2.3, Abbildung 2A beschrieben), saugen Sie den GCDR ab und neigen Sie die Platte um ~ 45 ° in Richtung des Experimentators und kratzen Sie die Zellen mit einem Zelllifter.
HINWEIS: Wenn die Zellen detatieren, lassen Sie die aspirierende GCDR weg und fahren Sie fort.
- Drehen Sie die Platte um ~ 90 ° und kratzen Sie erneut, um die verbleibenden Zellen anzuheben. Halten Sie die Platte ~ 45 ° und waschen Sie die Zellen mit 3 ml hPSC-Medium mit einer serologischen 10 ml Pipette ab.
- Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um große Klumpen aufzubrechen (nicht mehr als 2-3 Mal) und säen Sie die Zellen im für die interessierenden Zelllinie geeigneten Verhältnis auf die vorbereiteten Platten. Legen Sie die Platte mit den Zellen in den Inkubator und bewegen Sie die Platte vorsichtig in acht Bewegungen, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
HINWEIS: In diesem Experiment wurden hPSC-Linien im Verhältnis 1:5 aufgeteilt, dies kann für andere Zelllinien und Bedingungen variieren. Lassen Sie den Teller über Nacht ungestört.
- Nach ~ 24 h untersuchen Sie die Zellen auf Anhaftung. Suchen Sie nach kleinen einzelnen Kolonien, die angeschlossen sind. Das verbrauchte Medium absaugen und mit 8 ml frischem hPSC-Medium (kein ROCKi hinzugefügt) auffüllen.
- Beobachten und füttern Sie täglich, bis die Zellen ~ 60% Konfluenz erreichen, um den Nierenorganoid-Assay zu starten (normalerweise 48 bis 72 h nach dem Passieren erreicht). Die Kolonien sind idealerweise diskret und verschmelzen nicht (Abbildung 2B).
HINWEIS: Es ist sehr wichtig, die Zellen auf nicht mehr als 80% Konfluenz zu begrenzen, um ihren Pluripotenzzustand aufrechtzuerhalten. Konfluierende Kulturen, grobe Handhabung oder höhere Passagen können zu unerwünschter spontaner Differenzierung oder geringer Effizienz der Nierenorganoidbildung führen.
3. Tag 0 - Einrichtung des Nierenorganoid-Assays
- Bevor Sie beginnen, bereiten Sie sowohl das E5-ILP- als auch das Stage II-Medium gemäß den Formulierungen vor (Tabelle 1 und Tabelle 2).
HINWEIS: Die Medien können bis zu 14 Tage bei 4 °C gelagert werden.
- Für einen Nierenorganoid-Assay (eine 100-mm-Kulturplatte wird für eine 6-Well-Platte benötigt) ist ein komplettes E5-ILP-Medium in einem 50 mL konischen Röhrchen herzustellen: 18 ml E5-ILP, ergänzt mit 8 μM CHIR99021 (14,4 μL), 3,3 μM ROCKi (6 μL), 0,1 mM Beta-Mercaptoethanol (32,7 μL).
- Legen Sie 2 ml vollständiges E5-ILP-Medium in jede Vertiefung einer 6-Well-Ultra-Low-Befestigungsplatte.
- Waschen Sie hPSCs bei ~ 60 % Konfluenz (Abbildung 2B) zweimal mit ~ 8 ml DPBS. Aspirieren Sie DPBs, fügen Sie dann 2 ml Dispase pro 100 mm Platte hinzu, tropfenweise um die Zellen abzudecken und inkubieren Sie für 6 Minuten bei 37 ° C.
HINWEIS: Nach 6 Minuten beginnen sich die Ränder der Kolonien zusammenzurollen (Abbildung 2C, rote Pfeile), während der Rest der Kolonie befestigt bleibt. Wenn dies nach 6 min nicht erreicht wird, legen Sie die Zellen für weitere 30 s wieder in den Inkubator. Andere hPSC-Medien und -Matrix sind möglicherweise nicht mit diesem Timing kompatibel. Die BME-Beschichtung auf Lamininbasis ist nicht mit Dispase kompatibel. Wenn lamininbasierte BME die Standard-hPSC-Matrix sind, beschichten Sie eine der Platten in Abschnitt 1 mit dem in diesem Verfahren beschriebenen BME, der für den Nierenorganoid-Assay verwendet werden soll.
- Waschen Sie Zellen 3x mit ~ 10 ml DPBS. Aspirations-DPBS neigen dann die Platte um ~ 45 ° und kratzen Sie mit einem Zellenheber nach unten.
HINWEIS: Dispase ist nicht deaktiviert, daher muss es gründlich ausgewaschen werden. Reduzieren Sie nicht die Anzahl der Wäschen.
- Waschen Sie die Kolonien von oben mit 6 ml vollständigem E5-ILP-Medium mit einer serologischen Pipette von 10 ml ab. Pipette sanft auf und ab, um große Kolonien aufzubrechen (2 oder 3 Mal ist normalerweise genug).
- Verteilen Sie die Koloniecluster gleichmäßig, indem Sie 1 ml pro Well in die 6-Well-Platte geben. Legen Sie die Platte auf einen Orbitalschüttler (Einstellungen: Orbital = 30, Kehrwert = 330°, Vibration = 5° - 2 s), der in den 37 °C Inkubator gelegt wird (Abbildung 2D).
HINWEIS: Das Vibrationsmerkmal ist wichtig für eine ausreichende Verteilung von Organoiden und um ein Verklumpen zu verhindern.
4. Tag 2 - Fütterung durch Halb-Medium-Wechsel
HINWEIS: Innerhalb der 48 h bilden Koloniecluster embryonale Körper.
- Bereiten Sie das komplette Medium vor: Für eine 6-Well-Platte bereiten Sie 12 ml E5-ILP-Medium + 8 μM CHIR99021 in einem konischen 15-ml-Rohr vor.
HINWEIS: Beta-Mercaptoethanol und ROCKi sind nicht erforderlich.
- Lassen Sie die embryonalen Körper sich an der Unterseite der Platte absetzen, neigen Sie die Platte ~ 45 ° und saugen Sie das Medium dann langsam von oben ab, lassen Sie ~ 1 ml pro Well.
HINWEIS: Embryonale Körper in diesem Stadium verklumpen schnell. Lassen Sie sie nicht für > 5 Minuten zufrieden geben.
- Pro Vertiefung werden 2 ml vorbereitetes Vollmedium (Abschnitt 4.1) zugegeben. Bringen Sie die Platte zurück auf den Shaker.
5. Tag 3 - Transfer von embryonalen Körpern in Stadium II Medium
- Bereiten Sie ein konisches 50-ml-Rohr und DMEM (Low Glucose) vor. Lassen Sie die embryonalen Körper sich am Boden der Platte niederlassen. Neigen Sie die Platte ~ 45 ° und saugen Sie das Medium langsam von oben ab, lassen Sie ~ 1 ml pro Well.
- Sammeln Sie alle embryonalen Körper sorgfältig aus jedem Brunnen mit einer serologischen Pipette von 10 ml und übertragen Sie sie in die 50 ml konische Röhre.
- Waschen Sie jede Welle, um alle verbleibenden embryonalen Körper mit ~ 1 ml DMEM (niedrige Glukose) zu sammeln und fügen Sie sie in die gleiche 50 ml konische Röhre hinzu.
- Lassen Sie die embryonalen Körper sich am Boden der Röhre absetzen, ~ 5 min. Fügen Sie während des Wartens 2 ml Medium der Stufe II zu jeder Vertiefung der 6-Well-Platte hinzu. Große embryonale Körper (>300 μm) mit einem 200 μm Zellsieb abtrennen (Abbildung 2E).
- Verwenden Sie ein neues konisches 50-ml-Rohr und legen Sie das 200-μm-Zellsieb darauf. Pipettieren Sie alle embryonalen Körper mit einer serologischen Pipette von 10 ml vorsichtig über das Zellsieb.
- Spülen Sie das Zellsieb mit zusätzlichen ~ 5 ml DMEM (niedrige Glukose) ab, um alle embryonalen Körper zu sammeln, die im Zellsieb stecken. Lassen Sie die embryonalen Körper sich am Boden der konischen Röhre absetzen.
- Wenn sich die embryonalen Körper abgesetzt haben, aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit ~ 10 ml DMEM (Low Glucose).
- Aspirieren Sie DMEM und suspendieren Sie die embryonalen Körper in 6 ml Medium im Stadium II.
- Übertragen Sie die embryonalen Körper zurück in die 6 Well Ultra-Low-Attachment-Platte und verteilen Sie sie gleichmäßig auf die 6 Wells.
- Führen Sie jeden zweiten Tag einen halben Medienwechsel durch, wie in den Schritten 4.2 und 4.3 beschrieben.
HINWEIS: Ab Tag 3 haben die embryonalen Körper ein "goldenes" und glattes, kugelförmiges Aussehen (Abbildung 2F). Ab ~ Tag 6 wird sich die Tubulusbildung in einzelnen embryonalen Körpern zeigen, wobei die Anzahl der Tubuli in den folgenden Tagen bis zum 14. Tag eine optimale Anzahl und ein optimales Wachstum erreicht (Abbildung 2G, H). Um gelegentliche Verklumpungsbildungen zu vermeiden, sieben Sie bei visueller Beobachtung der Nierenorganoide oder sehr kleiner embryonaler Körper ohne Tubuli die Organoide <200 und große Organoide >500 μm mit einem Zellsieb von 500 und 200 μm aus, wie in den Schritten 5.4.1 und 5.4.2 beschrieben.
6. Überführung in den Spinnerkolben und Fütterung
HINWEIS: Ein Spinnkolben kann jederzeit ab Tag 3 für Experimente verwendet werden, die eine große Anzahl von Organoiden erfordern. Der routinemäßige Transfer von Organoiden erfolgt in unserem Labor zwischen den Tagen 6-8. Bitte lesen Sie den Diskussionsabschnitt für Alternativen, wenn keine Ausrüstung verfügbar ist.
- Transfer embryonaler Körper in einen 125 ml Spinnerkolben mit 45 ml Medium im Stadium II. Stellen Sie die magnetische Rührerdrehzahl auf 120 U/min ein und geben Sie sie in den Inkubator (Abbildung 2I).
- Um embryonale Körper oder Nierenorganoide zu füttern, lassen Sie die Nierenorganoide sich kurz am Boden des Spinnerkolbens absetzen. Heben Sie den Deckel von einem Seitenarm des Kolbens an und legen Sie die Ansaugpipette hinein, wobei die Spitze die gegenüberliegende Innenwand berührt.
- Winkeln Sie die Ansaugpipette langsam nach unten und aspirieren Sie etwa die Hälfte des Mediums. Mit 20 ml frischem Medium der Stufe II auffüllen, indem Sie es durch dieselbe Öffnung pipettieren.
7. Einrichten einer magnetischen 6-Well-Rührplatte (6MSP)
HINWEIS: Das 6MSP-Format kann anstelle von Spinnerkolben verwendet werden, wenn mehrere Bedingungen getestet werden müssen. Verwenden Sie den 6MSP für zusammengesetzte oder Nephrotoxin-Behandlungen. Dies spart die Menge an Medium, die in der zweiten Stufe verwendet wird, während die Nährstoffverfügbarkeit durch Diffusion erhalten bleibt.
- Reinigen Sie die ovalen magnetischen Rührstäbe in einem konischen 50-ml-Röhrchen, indem Sie es in einem für eine Gewebekultur geeigneten Reinigungsmittel kurz waschen (falls nie verwendet) oder bei vorherigem Gebrauch > 1 h einweichen.
- 3x in sterilem DPBS kurz waschen.
- Waschen Sie 1x für 5 min in 70% Ethanol, 1x in sterilem DPBS.
- Mit Antihaftlösung abspülen und 1x in sterilen DPBS waschen und aspirieren.
- Vorsichtig mit langen sterilen Pinzetten platzieren Sie einen magnetischen Rührstab in jede Vertiefung der 6-Well-Platte mit embryoiden Körpern oder Nierenorganoiden.
- Legen Sie die Platte auf den 6MSP und stellen Sie die Drehzahl auf 120 U/min ein (Abbildung 2J). Nierenorganoide mit halbem Mediumwechsel gemäß Abschnitt 4.2 und 4.3 beibehalten.
HINWEIS: Damit die magnetischen Rührstäbe in Position schnappen und sich drehen können, müssen Sie möglicherweise zuerst das Leistungsniveau kurz auf 100 setzen, und dann, sobald sie sich alle drehen, das Leistungsniveau auf 25 senken.