Kartierung von R-Schleifen und RNA:DNA-Hybriden mit S9.6-basierten Immunpräzipitationsmethoden

Zusammenfassung

R-Schleifen stellen eine vorherrschende Klasse von transkriptionsgesteuerten Nicht-B-DNA-Strukturen dar, die in allen Genomen in Abhängigkeit von der DNA-Sequenz und der topologischen Begünstigung vorkommen. In den letzten Jahren wurden R-Schleifen mit einer Vielzahl von adaptiven und maladaptiven Rollen in Verbindung gebracht und mit genomischer Instabilität im Zusammenhang mit menschlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Die genaue Kartierung dieser Strukturen im Genom ist daher für viele Forscher von großem Interesse. DRIP-seq (DNA:RNA Immunpräzipitation gefolgt von Hochdurchsatz-Sequenzierung) wird hier beschrieben. Es handelt sich um eine robuste und reproduzierbare Technik, die eine genaue und semiquantitative Kartierung von R-Schleifen ermöglicht. Eine neuere Iteration des Verfahrens wird ebenfalls beschrieben, bei der die Fragmentierung mit Hilfe der Beschallung (sDRIP-seq) durchgeführt wird, die ein strangspezifisches und hochauflösendes Mapping von R-Schleifen ermöglicht. sDRIP-seq adressiert somit einige der üblichen Einschränkungen der DRIP-seq-Methode in Bezug auf Auflösung und Litzenfestigkeit, was sie zu einer Methode der Wahl für das R-Loop-Mapping macht.

Zusammenfassung

R-Schleifen stellen eine vorherrschende Klasse von transkriptionsgesteuerten Nicht-B-DNA-Strukturen dar, die in allen Genomen in Abhängigkeit von der DNA-Sequenz und der topologischen Begünstigung vorkommen. In den letzten Jahren wurden R-Schleifen mit einer Vielzahl von adaptiven und maladaptiven Rollen in Verbindung gebracht und mit genomischer Instabilität im Zusammenhang mit menschlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Die genaue Kartierung dieser Strukturen im Genom ist daher für viele Forscher von großem Interesse. DRIP-seq (DNA:RNA Immunpräzipitation gefolgt von Hochdurchsatz-Sequenzierung) wird hier beschrieben. Es handelt sich um eine robuste und reproduzierbare Technik, die eine genaue und semiquantitative Kartierung von R-Schleifen ermöglicht. Eine neuere Iteration des Verfahrens wird ebenfalls beschrieben, bei der die Fragmentierung mit Hilfe der Beschallung (sDRIP-seq) durchgeführt wird, die ein strangspezifisches und hochauflösendes Mapping von R-Schleifen ermöglicht. sDRIP-seq adressiert somit einige der üblichen Einschränkungen der DRIP-seq-Methode in Bezug auf Auflösung und Litzenfestigkeit, was sie zu einer Methode der Wahl für das R-Loop-Mapping macht.

Einleitung

R-Schleifen sind dreisträngige Nukleinsäurestrukturen, die sich hauptsächlich während der Transkription bilden, wenn das entstehende RNA-Transkript mit dem Matrizen-DNA-Strang hybridisiert wird. Dies führt zur Bildung eines RNA:DNA-Hybrids und bewirkt die Verschiebung des Nicht-Template-DNA-Strangs in einen einzelsträngigen geloopten Zustand. Die biochemische Rekonstitution ^1,2,3,4 und die mathematische Modellierung⁵ in Kombination mit anderen biophysikalischen Messungen ^6,7

Protokoll

Das folgende Protokoll ist für die in Kultur gezüchtete humane Ntera-2-Zelllinie optimiert, wurde aber erfolgreich ohne Modifikation an eine Reihe anderer humaner Zelllinien (HEK293, K562, HeLa, U2OS), Primärzellen (Fibroblasten, B-Zellen) sowie an andere Organismen mit kleinen Modifikationen (Mäuse, Fliegen) angepasst.

1. Zellernte und Lyse

1. Kultivieren Sie Ntera-2-Zellen auf eine Konfluenz von 75 % bis 85 %. Stellen Sie sicher, dass die optimale Zellzahl 5 bis 6 Millionen Zellen mit einer lebensfähigen Anzahl von >90 % beträgt, um ein DRIP-Verfahren zu starten.
2. Waschen Sie die Zellen ....

Ergebnisse

Sowohl DRIP als auch sDRIP können durch qPCR (Abbildung 2A) und/oder Sequenzierung (Abbildung 2B) analysiert werden. Nach dem Immunpräzipitationsschritt muss die Qualität des Experiments zunächst durch qPCR an positiven und negativen Kontrollloci sowie mit RNase H-behandelten Kontrollen bestätigt werden. Primer, die häufig verwendeten Loci in mehreren menschlichen Zelllinien entsprechen, sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Ergebnisse der qPCR soll.......

Diskussion

Hier werden zwei Protokolle beschrieben, um R-Loop-Strukturen in potenziell jedem Organismus unter Verwendung des S9.6-Antikörpers zu kartieren. DRIP-seq ist die erste entwickelte genomweite R-Loop-Kartierungstechnik. Es handelt sich um eine einfache, robuste und reproduzierbare Technik, die es ermöglicht, die Verteilung von R-Schleifen entlang eines beliebigen Genoms abzubilden. Die zweite Technik, sDRIP-seq genannt, ist ebenfalls robust und reproduzierbar, erreicht aber eine höhere Auf.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15-ml-Röhrchen Maxtract Phasen-Lock-Gel mit hoher Dichte	Qiagen	129065
2-ml-Röhrchen Phasen-Lock-Gel light	VWR	10847-800
Agarose A/G-Kügelchen	ThermoFisher Scientific	20421
Agencourt AMPure XP-Kügelchen	Beckman Coulter	A63881
AmpErase Uracil N-Glykosylase	ThermoFisher Scientific	N8080096
Indexadapter	Illumina		Entspricht dem TrueSeq Single Indexes
Klenow Fragment (3' bis 5' exo-)	New England BioLabs	M0212S
NEBNext End Repair Module	New England BioLabs	E6050
PCR Primer für die Bibliotheksamplifikation			Grundierung 1.0 P5 (5' AATGATACGGCGACCGAGA TCTACACTCTTTCCCTACACGA 3')
PCR-Primer für die Bibliotheksamplifikation			PCR-Primer 2.0 P7 (5' CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT 3')
Phenol/Chloroform Isoamylalkohol 25:24:1	Affymetrix	75831-400ML
Phusion Flash High-Fidelity PCR Mastermix	ThermoFisher Scientific	F548S
Quick Ligation Kit	New England BioLabs	M2200S
Ribonuklease H	New England BioLabs	M0297S
S9.6 Antikörper	Kerafast	ENH001	Diese drei Quellen sind äquivalent
S9.6 Antikörper	Millipore/Sigma	MABE1095
S9.6 Antikörper	Abcam	ab234957