Ein einfach zu bedienendes RNA-Pulldown-Protokoll wurde für die Identifizierung von RNAs entwickelt, die an einer direkten RNA/RNA-Interaktion mit einer langen nicht-kodierenden RNA beteiligt sind. Das Protokoll verwendet Psoralen als Fixiermittel, um nur RNA/RNA-Wechselwirkungen zu vernetzen, und liefert das gesamte direkte RNA-Interaktom einer langen nicht-kodierenden RNA, wenn es mit RNA-Sequenzierung gekoppelt ist.
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Methodenartikel
Identifizierung von RNAs, die an einer direkten RNA-RNA-Interaktion mit einer langen nicht-kodierenden RNA beteiligt sind
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die wachsende Rolle, die heutzutage langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) in der Physiologie und Pathophysiologie zugeschrieben wird, macht es entscheidend, ihr Interaktom durch die Identifizierung ihrer molekularen Partner, DNA, Proteine und/oder RNAs, zu charakterisieren. Letztere können über Netzwerke, an denen Proteine beteiligt sind, mit lncRNA interagieren, aber auch an direkten RNA/RNA-Interaktionen beteiligt sein. Wir haben daher ein einfach anzuwendendes RNA-Pulldown-Verfahren entwickelt, das die Identifizierung von RNAs ermöglicht, die an einer direkten RNA/RNA-Interaktion mit einer lncRNA beteiligt sind, indem wir Psoralen verwenden, ein Molekül, das nur RNA/RNA-Wechselwirkungen vernetzt. Die bioinformatische Modellierung der lncRNA-Sekundärstruktur ermöglichte die Auswahl mehrerer spezifischer Antisense-DNA-Oligonukleotidsonden mit einer starken Affinität zu Regionen, die eine geringe Wahrscheinlichkeit einer internen Basenpaarung aufweisen. Da die spezifischen Sonden, die entwickelt wurden, auf zugängliche Regionen über die gesamte Länge der lncRNA abzielten, konnten die RNA-Interaktionszonen in der Sequenz der lncRNA abgegrenzt werden. In Verbindung mit einer Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung kann dieses Protokoll für die gesamten direkten RNA-Interaktomstudien einer lncRNA von Interesse verwendet werden.
Einleitung
Lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs) sind nicht-proteinkodierende Transkripte, die länger als 200 Nukleotide sind. Ihre Zahl nimmt ständig zu, beim Menschen sind es mehr als 58.000. Darüber hinaus ist es aufgrund ihrer entscheidenden Rolle in der Physiologie und Pathophysiologie unerlässlich, ihre molekularen Partner zu charakterisieren, die es ihnen ermöglichen, ihre regulatorischen Funktionen umzusetzen. Ein Ansatz, um die Funktionen von lncRNAs zu verstehen, ist der Nachweis der interagierenden molekularen Partner jeder lncRNA.
Die molekularen Ziele von lncRNAs können DNA, Proteine oder RNAs sein, und es wurden verschiedene Techniken entwickelt, um sie zu identifizieren. In diesem Zusammenhang ist die Identifizierung von Proteinen, die mit lncRNAs interagieren, das Ziel verschiedener Protokolle, einschließlich verschiedener RNA-Immunpräzipitationsverfahren (RIP), bei denen ein Antikörper gegen das interessierende Protein verwendet wird, um lncRNAs spezifisch abzubauen (für eine Übersichtsarbeit1). Andere Techniken wie die Capture-Hybridisierungsanalyse von RNA-Targets2 (CHART) oder die Chromatinisolierung durch RNA-Aufreinigung3 (ChIRP) ermöglichen es, lncRNAs zusammen mit den zugehörigen Proteinkomplexen herunterzuziehen. Bei diesen letztgenannten Techniken wird die lncRNA als Köder verwendet. CHART und ChIRP sind ebenfalls leistungsfähige Techniken zur Identifizierung genomischer Karten, die die lncRNA-Belegung zeigen 2,3. Darüber hinaus ermöglichen diese RNA-Pull-down-Methoden, die RNA-Partner einer lncRNA zu identifizieren. Es wurde ein Verfahren beschrieben, das den Einfang von RNAs ermöglicht, die von einer lncRNA angesteuert werden. Biotinylierte DNA-Oligonukleotidsonden von Antisense wurden für Regionen mit geringer Wahrscheinlichkeit einer internen Basenpaarung entwickelt, wie durch bioinformatische Modellierung der lncRNA-Sekundärstrukturbestimmt wurde 4. Bei diesem Verfahren wird jedoch nicht unterschieden, ob die RNA-Partner indirekt über ein Proteinnetzwerk oder direkt über direkte RNA/RNA-Wechselwirkungen mit der lncRNA interagieren. Es wurde gezeigt, dass die Vernetzung mit Psoralenderivaten die Methode der Wahl ist, um direkte RNA/RNA-Wechselwirkungen zu selektieren, die durch Basenpaarung vermittelt werden5. Psoralen-Derivate sind in der Tat in der Lage, in doppelsträngige DNA oder RNA zu interkalieren und Pyrimidine nach Bestrahlung mit UV-Licht (365 nm) kovalent zu verknüpfen6. Die Kopplung des RNA-Pulldowns mittels biotinylierter Oligonukleotidsonden mit der Vernetzung mit Psoralen ist ein hier vorgeschlagenes einfach anzuwendendes Verfahren zur Identifizierung der RNAs, die an direkten RNA/RNA-Wechselwirkungen mit einer lncRNA beteiligt sind. Darüber hinaus kann dieses Verfahren die Abgrenzung der RNA-Interaktionszonen in der Sequenz der lncRNA ermöglichen, wenn unterschiedliche Oligonukleotidsonden verwendet werden, die entlang der Länge der lncRNA ausgelegt sind.
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Protokoll
1. Design der Sonde
- Generieren Sie die Sekundärstruktur der lncRNA mit einer speziellen kostenlosen Webserver-Software: RNAstructure Software7 oder Vienna RNA Web Suite8. Wählen Sie Regionen aus, die eine geringe Wahrscheinlichkeit einer internen Basenpaarung aufweisen, und entwerfen Sie Antisense-Oligonukleotidsonden mit 25 Basen für verschiedene Regionen dieser lncRNA.
- Überprüfen Sie alle Oligonukleotide, die mit der kostenlosen akademischen Software AmplifX (https://inp.univ-amu.fr/en/amplifx-manage-test-and-design-your-primers-for-pcr) entwickelt wurden, um verschiedene Informationen über diese Sonden zu erhalten und diejenigen mit den besten Parametern auszuwählen.
HINWEIS: Überprüfen Sie die optimalen Parameter in der Software wie folgt. GC-Anteil: zwischen 40 und 60%, 3'-Stabilität, Komplexität, Eigenenddimer: "gut". Die Schmelztemperatur(TM) spielt keine Rolle, da die Affinität bei Raumtemperatur durchgeführt wird. - Stellen Sie mit einem Alignment-Suchwerkzeug (z. B. Blast usw.) sicher, dass die ausgewählten Antisense-Oligonukleotidsonden keine Nukleotidsequenzen in einer anderen RNA erkennen, die in den Zellen der Wahl exprimiert wird.
- Entwerfen Sie eine 25 Basen lange unspezifische DNA-Oligonukleotidsonde. Stellen Sie sicher, dass diese Sonde weder eine Affinität für die interessierende lncRNA noch für andere RNA-Sequenzen im interessierenden Genom aufweist.
- Bestellen Sie alle Sonden mit einer Biotin-Modifikation an ihrem 3'-Ende, die zusammen mit einem Triethylenglycerin-Spacer (TEG) hinzugefügt wird. Dieser Spacer vergrößert den Oligo-Biotin-Abstand, um sterische Behinderungen zu vermeiden.
HINWEIS: Um ein optimales Ergebnis zu erhalten und die Spezifität der Ergebnisse des Pulldowns zu beurteilen, entwerfen Sie mindestens zwei verschiedene Antisense-Oligonukleotidsonden in derselben Region und vergleichen Sie dann ihre Effizienz experimentell.
2. Vernetzung
- Züchten Sie Zellen (z. B. GH4C1-Zellen, die in diesem Experiment verwendet wurden) bis zum Zusammenfluss in 78,5 cm2 Zellkulturschalen. Nach dem Entfernen des Zellkulturmediums spülen Sie die Zellschicht mit 5 ml kalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung, angereichert mit Ca2+ und Mg2+ (PBS+), und fügen Sie 3 ml Psoralen-abgeleitete Moleküllösung (4"-Aminomethyltrioxsalenhydrochlorid) hinzu, die in PBS+ in einer Konzentration von 0,1 mg/ml hergestellt wurde.
- Stellen Sie die Kulturplatte für 30 min in einen Säugetierzellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2. Nach 30 min den Deckel abnehmen, Kulturschalen in einem Abstand von 2,5 cm zu 365 nm UV-Röhren für 10 min auf Eis in einen UV-Vernetzer stellen. Rühren Sie das Geschirr vorsichtig um und stellen Sie die UV-Strahlung für einen weiteren Zeitraum von 10 Minuten wieder her.
- Verwerfen Sie das Medium durch Aspiration, fügen Sie 1 ml PBS+ hinzu, um die Zellen mit einem Zellschaber zu sammeln, und geben Sie es in ein Mikroröhrchen. Zentrifugieren bei 4 °C, 400 x g für 5 min. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich und lagern Sie die Pellets bei -80 °C.
3. Zelllyse
- Bereiten Sie Proteinase K-Puffer vor, indem Sie 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA, 0,5 % SDS und 5 μl/ml RNase-Inhibitor hinzufügen.
- Resuspendieren Sie die Zellpellets in diesem Puffer (ca. 200 μl pro 1 x 107 Zellen). Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 0,1 μg/μl zugeben und 45 min bei 50 °C inkubieren. Dann 10 min bei 95 °C inkubieren, um die Proteinase K zu inaktivieren.
4. Beschallung
- 100 μl dieses Lysats (entsprechend 5,106 Zellen) werden in zwei Mikroröhrchen verteilt und 200 μl Hybridisierungspuffer (700 mM NaCl, 70 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA, 1,25 % SDS, 5 μL/ml RNase-Inhibitorlösung und 15 % Formamid) in jedes Röhrchen gegeben.
- Legen Sie die Röhren in das 4 °C heiße Wasserbad eines Ultraschallgeräts und starten Sie die Beschallung mit 2 Serien von 30 s Impulsen (hohe Intensität), die durch 30 s Abstand voneinander getrennt sind.
- Sammeln Sie 20 μl Proben, die als Eingangskontrollproben dienen, und lagern Sie sie bei -80 °C.
HINWEIS: Dieses Beschallungsverfahren wurde zuvor für die GH4C1-Zelllinie optimiert, um RNA-Fragmente im Bereich von 2.000 Nukleotidenzu erhalten 9. Bei anderen Zelllinien muss das Beschallungsverfahren optimiert werden. Wenn diese Technik durchgeführt wird, um die RNA-Partner einer sehr langen nicht-kodierenden RNA zu untersuchen, erweist sich der Ultraschallschritt als unverzichtbar, um eine adäquate Rückgewinnung der lncRNA zu erhalten. In diesem Fall ist es daher notwendig, mehrere Sonden mit einer Bindungsstelle zu entwerfen, die sich alle maximal 4.000 Nukleotide entlang der lncRNA-Länge befindet. Um die volle Länge der lncRNA wiederherzustellen, verwenden Sie einen Pool aus mehreren spezifischen Sonden. Wenn es jedoch darum geht, die Regionen der lncRNA zu identifizieren, die an der RNA-RNA-Bindung beteiligt sind, müssen die spezifischen Sonden separat verwendet werden. Darüber hinaus sollten bei der Untersuchung von RNA-Partnern einer kleineren lncRNA Experimente durchgeführt werden, um festzustellen, ob der Ultraschallschritt erforderlich ist.
5. RNA-Pulldown
- Tag 1 - Schritt der Hybridisierung
- Geben Sie 150 pmol (1,5 μl einer 100 μM Stammlösung) einer biotinylierten spezifischen oder unspezifischen Sonde in jedes Probenröhrchen. 4 h unter Rühren auf einem Röhrenrotator bei Raumtemperatur (RT) (ca. 30 U/min) inkubieren.
- Nehmen Sie das erforderliche Volumen an magnetischen Kügelchen (d. h. 40 μl Kügelchen pro 150 pmol der Sonden Hybridisierungsreaktion). Verwenden Sie eine Magnethalterung, um die Perlen von kommerziellen Medien zu trennen. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Kügelchen mit 900 μl des Hybridisierungspuffers. Sobald dies erledigt ist, resuspendieren Sie die magnetischen Kügelchen im gleichen Volumen des Hybridisierungspuffers.
- Fügen Sie in jedes Probenröhrchen magnetische Beads hinzu (40 μl Kügelchen pro 150 pmol Sonden Hybridisierungsreaktion). Über Nacht unter Rühren auf einem Röhrenrotator bei RT (ca. 30 U/min) inkubieren.
- Tag 2 - Schritt der RNA-Isolierung
- Trennen Sie die Kügelchen mit Hilfe einer Magnethalterung vom Zelllysat (2-3 min). Den Überstand verwerfen und die Kügelchen mit 900 μl des Waschpuffers (0,5 % SDS, 2x SSC) mit 5 min Inkubation unter Rühren auf dem Rotator bei RT waschen. Diese Wäsche 5 Mal wiederholen.
- Nachdem Sie die letzte Wäsche entfernt haben, geben Sie 95 μl Proteinase K-Puffer auf die Kügelchen. Tauen Sie die Eingangsproben auf und fügen Sie 75 μl Proteinase K-Puffer hinzu. 5 μl Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 1 μg/μl in alle Röhrchen (Proben und Eingangsproben) geben. Inkubieren Sie 45 Minuten lang bei 45 °C und anschließend 10 Minuten lang bei 95 °C.
- Bewahren Sie die Probe auf Eis auf. Verwenden Sie einen magnetischen Träger, um die Kügelchen von den im Überstand vorhandenen RNAs zu trennen. Aufreinigung von RNAs mit einem RNA-Aufreinigungskit, das einen DNase-Verdauungsschritt enthält. Lagern Sie gereinigte RNAs bei -80 °C.
HINWEIS: Eluierte RNA kann einer RT-qPCR oder einer Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung unterzogen werden, um angereicherte Transkripte nachzuweisen. Für die RNA-Sequenzierungsanalyse können die Reads dann mit kostenloser Software wie STAR10 oder HISAT211 auf das interessierende Genom ausgerichtet werden, und die Quantifizierung kann mit FeatureCounts12 oder HTSeqCount 13 erfolgen.
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Ergebnisse
Die Aufklärung des lncRNA-Interaktoms, d.h. der zellulären Komponenten, die mit lncRNAs, Proteinen, RNA und DNA interagieren, ist von zentraler Bedeutung für das Verständnis der Funktionen von lncRNAs. Zur Charakterisierung des lncRNA-Interaktoms wurden verschiedene Techniken entwickelt, darunter RIP, CHART, ChIRP und RNA-Pull-down. Letzteres hat sich zwar als leistungsfähig bei der Identifizierung von RNA-Zielen von lncRNAs erwiesen, aber diese Verfahren zeigen nicht an, ob die RNA-Partner indirekt über ein Proteinnetzw...
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Diskussion
Zahlreiche lncRNAs erfüllen ihre Funktion durch komplementäre Basenpaarung zu mRNAs. Daher ist es wichtig, Verfahren zu entwickeln, die es ermöglichen, das direkte RNA-Interaktom der lncRNAs zu charakterisieren. Daher wurde ein Verfahren entwickelt, das die Verwendung von Psoralen als Vernetzungsreagenz mit der RNA-Pull-Down-Technik kombiniert.
In dem beschriebenen RNA-Pull-down-Protokoll basieren das Design und die Auswahl der biotinylierten Oligonukleotidson...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Universität Aix-Marseille und dem Centre National Recherche Scientifique unterstützt und durch ein Stipendium der Sandoz Laboratories finanziert.
Finanzierung der Open-Access-Gebühr: Universität Aix-Marseille und Centre National Recherche Scientifique
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 4′-Aminomethyltrioxsalenhydrochlorid | Sigma | A4330 | Vernetzerreagenz |
| Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | Sonicator |
| Biotynilierte Sonden | IDT | Oligonukleotidsonden | |
| CFX96 Real Time System | BioRad | 4351107 | qPCR-Gerät |
| DNA Olignukleotide | IDT | Primer für die qPCR | |
| Dynabeads My One | Thermo-Fisher | 65001 | Magnetische Streptavidin-Kügelchen |
| Formamid | Thermo-Fisher | 15515-026 | Formamid |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725124 | qPCR-Reagenz |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | Proteinase K |
| RNA zu DNA | Thermo-Fisher | 4387405 | Reverse Transkriptionskit |
| RNA XS Aufreinigungskit | Macherey-Nagel | 740902 | RNA Aufreinigungskit |
| RNAseOUT | Thermo-Fisher | 10777-019 | RNAse Inhibitor |
| Tube Rotator | Stuart | SB2 | Eppendorf Tube Rotator |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | #400072 | UV Vernetzer |
Referenzen
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