Co-Kultivierung von Mikroglia und kortikalen Neuronen, differenziert von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Unterscheidung von Mikroglia von humanen iPSCs und zur Aufrechterhaltung in Co-Kultur mit iPSC-abgeleiteten kortikalen Neuronen, um die mechanistischen Grundlagen neuroimmuner Interaktionen mit menschlichen Neuronen und Mikroglia zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Möglichkeit, Mikroglia aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zu erzeugen, bietet neue Werkzeuge und Wege zur Erforschung der Rolle von Mikroglia bei Gesundheit und Krankheit. Darüber hinaus können iPSC-abgeleitete Mikroglia in Co-Kultur mit iPSC-abgeleiteten kortikalen Neuronen erhalten werden, was die Untersuchung von Mikroglia-Neuron-Interaktionen ermöglicht, von denen angenommen wird, dass sie bei einer Reihe von neuropsychiatrischen Erkrankungen fehlreguliert sind. Humane iPS-Zellen wurden differenziert, um Mikroglia unter Verwendung einer angepassten Version eines von der Fossati-Gruppe entwickelten Protokolls zu erzeugen, und die von iPSCs abgeleiteten Mikroglia wurden mit Markeranalyse und Echtzeit-PCR validiert. Humane Mikroglia, die mit diesem Protokoll erzeugt wurden, waren positiv für die Marker CD11C, IBA1, P2RY12 und TMEM119 und exprimierten die mikrogliaverwandten Gene AIF1, CX3CR1, ITGAM, ITGAX, P2RY12 und TMEM119. Humane iPSC-abgeleitete kortikale Neuronen, die 30 Tage lang differenziert worden waren, wurden mit Mikroglia plattiert und bis zum 60. Tag, an dem Experimente durchgeführt wurden, in Co-Kultur gehalten. Die Dichte der dendritischen Dornen in kortikalen Neuronen in Co-Kultur mit Mikroglia wurde unter Ausgangsbedingungen und in Gegenwart von proinflammatorischen Zytokinen quantifiziert. Um zu untersuchen, wie Mikroglia die neuronale Funktion modulieren, wurden Calcium-Imaging-Experimente der kortikalen Neuronen mit dem Calcium-Indikator Fluo-4 AM durchgeführt. Die Lebendcalciumaktivität kortikaler Neuronen wurde mit einem konfokalen Mikroskop gemessen, und die Fluoreszenzintensität wurde mit ImageJ quantifiziert. Dieser Bericht beschreibt, wie die Co-Kultivierung von humanen iPSC-abgeleiteten Mikroglia und kortikalen Neuronen neue Ansätze bietet, um die Auswirkungen von Mikroglia auf kortikale Neuronen zu untersuchen.

Einleitung

Im menschlichen Gehirn sind Mikroglia die primären Zellen des angeborenen Immunsystems¹. Die Entwicklung des Gehirns wird von Mikroglia auf zwei Wegen reguliert: Freisetzung diffusibler Faktoren und Phagozytose¹. Von Mikroglia abgeleitete diffusible Faktoren unterstützen die Myelinisierung, Neurogenese, synaptische Bildung, Reifung, Zelltod und Zellüberleben¹. Mikroglia phagozytieren auch verschiedene Elemente in Gehirnsynapsen, Axonen und sowohl in lebenden als auch in toten Zellen 2,3,4,5,6,7,8. Rezeptoren auf Mikroglia erkennen Tags wie Calreticulin, ATP und Sialinsäure und regulieren die zelluläre Phagozytose ^9,10. Im Hippocampus halten Mikroglia durch ihre phagozytäre Rolle die Homöostase der Neurogenese aufrecht¹¹.

Es wurde gezeigt, dass die synaptische Phagozytose im dorsolateralen Nucleus geniculatus (dLGN) des Nagetiergehirns durch Mikroglia^{reguliert wird 1}. Bei Nagetieren wurde gezeigt, dass es zwei Perioden während der Entwicklung gibt, in denen eine intensive synaptische Phagozytose der Mikroglia beobachtet wird. Die erste Periode tritt während der anfänglichen Synapsenbildung auf, und die zweite Periode tritt ein, wenn Verbindungen fein abgestimmt und beschnitten werden¹². Weitere Faktoren, die am synaptischen Pruning beteiligt sind, sind Entzündungsproteine und der Haupthistokompatibilitätskomplex der Klasse I (MHC1, H2-K^b und D^b)^13,14. Es wurde vermutet, dass C1q (Komplementkomponente 1q) auf den Mikroglia mit MHC1 kolokalisiert, was eine synaptische Beschneidung auslöst¹⁵. Darüber hinaus zeigen Mausstudien, dass Interleukin-33 (IL-33), das von Astrozyten sezerniert wird, die Synapsenhomöostase im Thalamus und im Rückenmark durch seine Wirkung auf Mikroglia reguliert, obwohl dies beim Menschen noch untersucht werden muss¹³. Mikroglia sezernieren eine Vielzahl von Zytokinen, die zur Erhaltung der neuronalen Gesundheit beitragen, wie z. B. Tumornekrosefaktor α (TNFα), IL-1β, IL-6, IL-10 und Interferon-γ (IFN-γ), und diese Zytokine können die Bildung von dendritischer Wirbelsäule und Synapsen modulieren 16,17,18. Es gibt erhebliche Lücken in unserem Wissen über Neuron-Mikroglia-Interaktionen während der Entwicklung des menschlichen Gehirns. Der größte Teil unseres Wissens stammt aus Studien mit Nagetiermodellen, während es einen Mangel an Informationen über die zeitlichen und mechanistischen Aspekte der synaptischen Beschneidung im menschlichen Kortex gibt. Mikroglia unterstützen das neuronale Überleben im Neokortex, und andere Zelltypen tragen ebenfalls dazu bei¹. Es ist nicht klar, wie Mikroglia zu diesem Erhalt beitragen und wie das Zusammenspiel zwischen Mikroglia und den anderen Zelltypen aussieht. Mikroglia setzen mehrere Zytokine frei, die die neuronale und synaptische Entwicklung beeinflussen, aber die mechanistische Grundlage ihrer Wirkung dieser Zytokine in Neuronen ist weitgehend unbekannt ^19,20. Um ein vollständigeres Verständnis der Funktion von Mikroglia im menschlichen Gehirn zu erlangen, ist es wichtig, ihre Wechselwirkungen mit verschiedenen Zelltypen im menschlichen Gehirn zu untersuchen. Dieser Bericht beschreibt eine Methode zur Co-Kultivierung von menschlichen iPSC-abgeleiteten Neuronen und Mikroglia, die von derselben Person erzeugt wurden. Die Etablierung dieser Methodik wird klar definierte Untersuchungen ermöglichen, um die Natur der Mikroglia-Neuronal-Interaktionen zu untersuchen und robuste in vitro zelluläre Modelle zu entwickeln, um neuroimmune Dysfunktionen im Kontext verschiedener neurologischer Entwicklungsstörungen und neuropsychiatrischer Störungen zu untersuchen.

Die Rolle der Mikroglia bei Schizophrenie
Synaptisches Pruning ist ein wichtiger neurologischer Entwicklungsprozess, der im jugendlichen Gehirn stattfindet^21,22. Mehrere Beweise deuten darauf hin, dass die synaptische Beschneidung während dieser kritischen Phase bei Schizophrenie (SCZ) abnormal ist23,24,25,26. SCZ ist eine chronische, schwächende psychiatrische Störung, die durch Halluzinationen, Wahnvorstellungen, gestörte Denkprozesse und kognitive Defizite gekennzeichnet ist^23,24. Mikroglia, die im Gehirn ansässigen Makrophagen, spielen eine zentrale Rolle bei der synaptischen Beschneidung^25,26. Postmortale und Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Studien zeigen Hinweise auf eine dysfunktionale Mikrogliaaktivität bei SCZ 25,26,27,28,29,30,31,32. Postmortale SCZ-Gehirne zeigen gut replizierte, aber subtile Unterschiede im Gehirn - pyramidale Neuronen in der kortikalen Schicht III zeigen eine verringerte dendritische Dornendichte und weniger Synapsen 33,34,35. Synaptisches Pruning ist ein Prozess, bei dem überflüssige exzitatorische synaptische Verbindungen durch Mikroglia während der Adoleszenz beseitigt werden, wenn SCZ-Patienten in der Regel ihren ersten psychotischen Bruch haben^22,36. Postmortale Studien zeigen einen Zusammenhang zwischen SCZ und Mikroglia-Aktivierung, mit erhöhter Dichte von Mikroglia in SCZ-Gehirnen sowie erhöhter Expression proinflammatorischer Gene²⁷. Darüber hinaus zeigen PET-Studien an menschlichen Gehirnen, die Radioliganden zur Mikrogliaaktivierung verwenden, erhöhte Konzentrationen aktivierter Mikroglia im Kortex 25,26,27,28. Jüngste genomweite Assoziationsstudien (GWAS) zeigen, dass die stärkste genetische Assoziation für SCZ im Locus des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) liegt, und diese Assoziation resultiert aus Allelen der Komplementkomponente 4 (C4)-Gene, die an der Vermittlung der postnatalen synaptischen Beschneidung bei Nagetieren beteiligt sind³⁷. Diese Assoziation hat die Hypothese zusätzlich unterstützt, dass eine aberrante Beschneidung durch Mikroglia zu der verminderten dendritischen Dornendichte führen kann, die in postmortalen SCZ-Gehirnen beobachtet wird. Untersuchungen zur Beteiligung von Mikroglia am synaptischen Pruning in SCZ beschränken sich bisher auf indirekte Studien mit PET-Bildgebung oder Rückschlüsse aus Untersuchungen von postmortalen Gehirnen.

Erzeugung menschlicher Mikroglia im Labor
Kultivierte primäre Maus-Mikroglia wurden häufig bei der Untersuchung von Mikroglia verwendet, obwohl es mehrere Hinweise darauf gibt, dass Nagetier-Mikroglia möglicherweise nicht repräsentativ für die menschliche Mikroglia-Anatomie und Genexpression sind (Tabelle 1)³⁸. Mehrere Studien haben auch Mikroglia direkt von Blutmonozyten durch Transdifferenzierung unterschieden 39,40,41,42. Aus Blutmonozyten abgeleitete Mikroglia-ähnliche Zellen weisen große Unterschiede zu menschlichen Mikroglia in Bezug auf proinflammatorische Reaktionen im Gen- und Proteinexpressionsprofil auf, und sie scheinen in ihrer Biologie eher Makrophagen-ähnlich zu sein⁴³. Jüngste methodische Fortschritte ermöglichen nun die Erzeugung von Mikroglia aus humanen iPSCs, was die Möglichkeit bietet, lebende Mikroglia zu untersuchen, die der Biologie der Mikroglia im menschlichen Gehirn genauer ähneln (Tabelle 2). Es wurde gezeigt, dass diese iPSC-abgeleiteten Mikrogliazellen den Phänotyp, die Genexpressionsprofile und die funktionellen Eigenschaften der primären menschlichen Mikroglia rekapitulieren 44,45,46,47,48. Diese Arbeit stellt eine Methode zur Co-Kultivierung von humanen iPSC-abgeleiteten Neuronen und Mikroglia vor, die aus demselben Individuum erzeugt wurden, um personalisierte in vitro-Modelle von Neuron-Mikroglia-Interaktionen zu entwickeln. Für dieses in vitro Co-Kulturmodell wurde ein mikrogliales Differenzierungsprotokoll aus der Fossati-Gruppe adaptiert (Tabelle 3) und mit einer adaptierten Version eines kortikalen neuronalen Generationsprotokolls aus der Livesey-Gruppe kombiniert (Tabelle 4)^49,50.

Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten humanen iPSCs wurden aus Fibroblasten reprogrammiert, die durch Einverständniserklärung gesunder Kontrollpersonen und mit Genehmigung des Institutional Review Board (IRB) gewonnen worden waren. Die Reprogrammierung und Charakterisierung der in dieser Studie verwendeten iPSCs (ML15, ML27, ML40, ML56, ML141, ML 250, ML292) wurde in einer früheren Studie^{beschrieben 51}.

1. Wartung von iPSCs

1. Bereiten Sie eine 1:50-Verdünnung der LDEV-freien Basalmembranmatrix mit reduziertem Wachstumsfaktor in DMEM/F12 ohne Phenolrot vor und beschichten Sie eine 6-Well-Platte mit 1 mL der verdünnten Lösung für mindestens 2 h bei 37 °C, bevor Sie die Zellbestände auftauen.
2. Kryokonservierte iPSC-Bestände in einem 37 °C warmen Wasserbad für 2 min auftauen. Geben Sie die Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 5 mL DMEM/F12. Schleudern Sie die Zellen 5 min lang bei 300 x g ein.
3. Entfernen Sie die Beschichtungslösung von der vorbeschichteten LDEV-freien Basalmembran-Matrixplatte mit reduziertem Wachstumsfaktor und fügen Sie 1 ml Stammzellmedium (SCM) mit 10 μM Rock-Inhibitor (Y-27632) hinzu.
4. Das Zellpellet wird in SCM mit 10 μM Y-27632 resuspendiert und auf die vorbeschichtete Platte gegeben, um ein Endvolumen von 2 mL SCM plus Y-27632 zu erhalten. Bewahren Sie iPSC-Zellkulturen in diesem Medium für 24 Stunden in einem 37 °C Inkubator auf.
5. Ersetzen Sie das Medium 24 h nach dem Auftauen durch 2 mL frisches SCM ohne Y-27632.
6. Nachdem die iPS-Zellen eine Konfluenz von 80-90 % erreicht haben, werden sie auf 75-ml-Kolben geleitet, die mit einer LDEV-freien Basalmembranmatrix mit reduziertem Wachstumsfaktor beschichtet sind.
   1. Passage der Zellen, indem die Zellen zuerst mit HBSS gespült und nach 30 s Ruhezeit entfernt werden. 1 ml nicht-enzymatisches Zelldissoziationsreagenz zugeben und 4 Minuten bei 37 °C inkubieren. Bereiten Sie die Platte mit SCM vor, das 10 μM Y-27632 enthält.
   2. Aspirieren Sie das nicht-enzymatische Zelldissoziationsreagenz und geben Sie 1 ml SCM + 10 μM Y-27632 in jede Vertiefung. Kratzen Sie die Vertiefung vorsichtig mit einem Zellheber ab und entnehmen Sie Zellen mit einer 1000-μl-Pipette.
   3. Die Zellen werden auf einen LDEV-freien Basalmembran-Matrix-beschichteten 75-mm-Kolben mit reduziertem Wachstumsfaktor in einem Gesamtvolumen von 8 mL SCM + Y-27632 abgelegt.

2. Differenzierung der Mikroglia

HINWEIS: Ein schematisches Diagramm, das das Protokoll zur Differenzierung von Mikroglia darstellt, ist in Abbildung 1A dargestellt. Die Medien wurden vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmt.

1. Tag 0: Führen Sie einen vollständigen Medienwechsel mit SCM-Medium durch, das mit 80 ng/mL BMP-4 ergänzt wurde. Führen Sie an den Tagen 1-3 täglich einen Mediumwechsel mit demselben Medium durch, ohne dass zwischen den Mediumwechseln gewaschen werden muss.
2. Tag 4: Bereiten Sie das Medium für Tag 4-5 vor: Hämatopoetisches Medium (HM), ergänzt mit 25 ng/ml FGF, 100 ng/ml SCF und 80 ng/ml VEGF. Entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es durch ein Medium für Tag 4-5, das 5 μM Y-27632 enthält.
   HINWEIS: An diesem Punkt beginnen die Zellen zu schweben - etwa die Hälfte der Zellen schwimmt und die andere Hälfte ist adhärementär.
3. Tag 6: Bereiten Sie Tag 6-13 Medium vor: HM ergänzt mit 50 ng/mL SCF, 50 ng/mL IL-3, 5 ng/mL TPO, 50 ng/mL m-CSF und 50 ng/mL Flt3-L. Sammeln Sie den Überstand, geben Sie ihn in ein konisches 15-ml-Röhrchen und schleudern Sie ihn 8 Minuten lang bei 300 x g herunter. Das Pellet wird in einem Kolben mit 8 ml Medium für den Tag 6-13, ergänzt mit 5 μM Y-27632, resuspendiert.
4. Tag 10: Geben Sie 8 ml Medium für Tag 6-13 auf das vorhandene Medium.
5. Tag 14: Vorbereitung Tag 14+ medium: HM ergänzt mit 50 ng/mL m-CSF, 50 ng/mL Flt3-L, 50 ng/mL GM-CSF. Den Überstand auffangen, in ein konisches 50-ml-Röhrchen geben und 8 Minuten lang bei 300 x g herunterschleudern. Resuspendieren Sie das Pellet in 8 mL Tag-14+-Medium, das 5 μM Y-27632 enthält, und setzen Sie die Kultivierung in diesem Medium fort.
6. Tag 18: Fügen Sie 8 ml Day14+ Medium hinzu.
7. Tag 22: Fügen Sie 8 ml frisches Day14+ Medium hinzu, ohne das vorhandene Medium zu entfernen.
8. Tag 25: Verschieben Sie die Zellen zu Schritt 2.9 oder halten Sie sie bis zum 50. Tag der Differenzierung in Tag14+ Medium weiter.
9. Nach Tag 25 wird der Überstand in einem konischen 50-ml-Röhrchen aufgefangen und 8 Minuten lang bei 300 x g heruntergeschleudert.
   1. Bereiten Sie das adhärente Medium vor: RPMI, ergänzt mit 1 % 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid in 0,85 % NaCl-Lösung, 25 ng/mL GM-SCF und 100 ng/ml IL-34.
   2. Resuspendieren Sie das Pellet in dem anhaftenden Medium, das 5 μM Y-27632 enthält.
   3. Plattenzellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro^cm2 auf 24-Well-Platten für verschiedene Experimente: LDEV-freie Basalmembran-Matrix-beschichtete Platten mit reduziertem Wachstumsfaktor für Mikroglia-Monokulturen, 10 μg/mL Poly-L-Ornithin und 10 μg/mL lamininbeschichtete Glas-Speicherfolien für bildgebende Experimente.
   4. Verdünnen Sie Poly-L-Ornithin und Laminin in DPBS und fügen Sie 250 μl/Well für eine 24-Well-Speicherfolie hinzu.
      HINWEIS: Zellen in Kultur sind jetzt in der Natur adhärent (Abbildung 1C).
10. Halten Sie die Zellen mindestens 14 Tage lang in Kultur, mit zweiwöchentlichem Mediumwechsel. Nach dem 14. Tag nach der Adhärenz haben die Zellen die Reife erreicht und können für Experimente verwendet werden.

3. Differenzierung der kortikalen Neuronen

HINWEIS: Ein schematisches Diagramm, das das Protokoll zur Differenzierung kortikaler Neuronen darstellt, ist in Abbildung 1G dargestellt.

1. Tag 0:
   1. Sobald iPSCs auf LDEV-freien Basalmembranmatrix-beschichteten Platten mit reduziertem Wachstumsfaktor konfluent sind, wechseln Sie von SCM zu einer 50/50-Mischung aus N2/B27-Medium, das mit 10 μM SB431542, 1 μM Dorsomorphin und 100 nM LDN193189 ergänzt wird.
      HINWEIS: Das N2-Medium besteht aus Basalmedium, das mit 1 % N-2-Supplement, 1 % 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid in 0,85 % NaCl-Lösung, 1 % Pen/Streptokokken ergänzt wird. Das B27-Medium besteht aus DMEM/F12, ergänzt mit 2% B-27-Supplement, 1% 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid in 0,85% NaCl-Lösung, 1% Pen/Streptokokken.
   2. Wechseln Sie das Medium mit den oben genannten Nahrungsergänzungsmitteln, die 7 Tage lang täglich hinzugefügt werden.
2. Tag 7:
   1. Anschwemmplatten in LDEV-freier Basalmembranmatrix mit reduziertem Wachstumsfaktor für mindestens 2 h.
   2. Durchgangszellen 1:1 auf vorbeschichtete Platten. Spülen Sie die Zellen mit 1 ml/Well HBSS und entfernen Sie sie, nachdem Sie sie 30 s lang ruhen gelassen haben. 1 ml/Well Zellablösungsmedium (z. B. Accutase) zugeben und 4-5 Minuten bei 37 °C inkubieren. Bereiten Sie während der Inkubation konische 15-ml-Röhrchen mit 5 mL DMEM vor.
   3. Pipettieren Sie vorsichtig ein enzymatisches Dissoziationsmittel, um Zellen mit einer P1000-Pipette von der Platte zu entfernen. Sammeln Sie das enzymatische Dissoziationsmittel und die Zellmischung in dem konischen 15-ml-Röhrchen mit 5 mL DMEM.
   4. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 5 min lang bei 300 x g. Das Pellet wird in 1 ml N2/B27-Medium mit 10 μM Y-27632 resuspendiert. Setzen Sie die tägliche Fütterung mit N2/B27 Medium ohne Zusätze fort.
3. Tag 12: Passagezellen 1:1 mit den in 3.2.2 beschriebenen Methoden. Setzen Sie die tägliche Fütterung mit N2/B27 Medium fort.
4. Tag 15/16: Passagezellen 1:2 mit den in 3.2.2 beschriebenen Methoden. Setzen Sie die tägliche Fütterung mit N2/B27 Medium fort.
5. Tag 18/19: Passagezellen 1:3 mit den in 3.2.2 beschriebenen Methoden. Setzen Sie die tägliche Fütterung mit N2/B27 Medium bis zum 25. Tag fort.
6. Tag 25: Füttern Sie Zellen mit N2/B27-Medium, ergänzt mit 10 μM DAPT.
7. Tag 28: Füttern Sie die Zellen mit frischem, unbehandeltem N2/B27-Medium.
8. Tag 30: Passagezellen mit den in 3.2 beschriebenen Methoden auf die Mikroglia-Kulturplatten und in BrainPhys Medium mit 1% B-27-Supplement ergänzt.

4. Mikroglia/Neuronen-Cokulturen

1. Plate Day 30 kortikale Neuronen auf Mikrogliakulturen mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro^cm2. Ergänzen Sie das Medium mit Laminin 1 μg/ml, um die Zelladhärenz zu verbessern.
2. Halten Sie die Kulturen in einer Mischung aus 50 % adhärentem Medium und 50 % Brainohys-Medium, ergänzt mit 1 % B-27-Supplement. Führen Sie alle zwei Wochen einen halben mittleren Wechsel durch, bis Sie experimentieren.
3. Führen Sie Experimente durch, nachdem die Neuronen Tag 60 erreicht haben.

5. Behandlung mit Interferon-γ

1. Bereiten Sie frisches Medium zu, das mit 100 ng/ml IFN-γ ergänzt wird. Das Medium dazugeben und 24 Stunden inkubieren lassen. Entfernen Sie das Medium und fahren Sie mit dem Experimentieren fort.

6. Immunzytochemie

1. Die Zellen werden in der Kulturschale mit 100 μl 4 % Paraformaldehyd 20 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert.
2. Spülen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 Minuten in 1 ml PBS.
3. Fügen Sie 1 mL PBST (PBS + 0,1% Triton X) für 10 Minuten hinzu.
4. Fügen Sie Blockierungspuffer hinzu: 1 ml PBS plus 5% Ziegenserum für 1 h.
5. Fügen Sie einen Primärantikörper zu, verdünnt in 100 μl PBS + 1 % Ziegenserum - über Nacht bei 4 °C. Optimieren Sie alle Primärantikörper entsprechend.
6. Spülen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 Minuten in 1 ml PBS.
7. Fügen Sie einen Sekundärantikörper hinzu, verdünnt in 100 μl PBS plus 1 % Ziegenserum - für 1 h bei Raumtemperatur.

7. Analyse der Wirbelsäule

1. Erfassen Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop bei 60-facher Vergrößerung.
2. Verwenden Sie die ImageJ-Funktion NeuronJ⁵² , um Bilder zu analysieren.
3. Erhalten Sie Messungen für die Neuritenlänge, die Länge der Wirbelsäule und die Anzahl der Wirbelsäulen über NeuronJ.

8. Kalzium-Bildgebung

1. Bereiten Sie das Frischmedium mit 3 μM Fluo-4AM-Farbstoff vor. Inkubieren Sie Co-Kulturen in diesem Medium für 30 min bei 37 °C. Spülen Sie dann die Zellen mit PBS, fügen Sie den Zellen eine Bildgebungslösung für lebende Zellen hinzu und fahren Sie mit der Bildgebung fort.
2. Mit einem konfokalen Mikroskop, das für die Bildgebung lebender Zellen ausgestattet ist, erhalten Sie Zeitrafferbilder mit 40-facher Geschwindigkeit für 2 Minuten. Die Aktivität kann zu Studienbeginn bei Exposition gegenüber 15 mM Glutamat oder bei Depolarisation mit 5 mM Kaliumchlorid aufgezeichnet werden.
3. Messen Sie mit ImageJ die Fluoreszenzintensität über die Zeit für einzelne Zellkörper. Wählen Sie mit dem Auswahlwerkzeug eine einzelne Region of Interest (ROI) aus, die jeden Zellkörper umgibt. Öffnen Sie den ROI-Manager und drücken Sie zur Auswahl auf Hinzufügen . Fügen Sie dem ROI-Manager weiterhin neue Auswahlmöglichkeiten hinzu.
4. Verwenden Sie das Werkzeug "Maße festlegen ", um die mittlere Grauzone zu messen. Wenn die gewünschte Anzahl von Zellkörpern zum ROI-Manager hinzugefügt wurde, markieren Sie sie alle und verwenden Sie dann das Multi-Measure-Tool . Dadurch wird der mittlere graue Bereich für jeden über den Zeitverlauf der Videodatei ausgelesen. Die exportierten Daten geben die mittlere Fluoreszenzintensität für den interessierenden Bereich für jedes Bild an.
5. Bestimmen Sie das Fluoreszenzintensitätsverhältnis F/F₀, wobei F die Fluoreszenzintensität zu einem bestimmten Zeitpunkt und F₀ die anfängliche Fluoreszenzintensität ist. F/F₀ kann über die Zeit grafisch dargestellt werden, um die spontane Aktivität in Neuronen zu untersuchen, oder bei maximaler Fluoreszenzintensität im Rahmen der Stimulation.

Ergebnisse

Protokoll-Validierung
Die iPSC-abgeleiteten Mikroglia wurden aus sieben iPSC-Linien über drei verschiedene Differenzierungsrunden generiert. Es wurden Kontroll-iPSC-Linien ML27, ML56, ML292 und ML364 und Schizophrenie-iPSC-Linien ML40, ML141 und ML250 verwendet. Die Charakterisierung dieser iPS-Linien wurde bereits beschrieben⁵¹. Diese iPSC-abgeleiteten Mikroglia wurden mittels ICC und qPCR validiert. Mikroglia, die aus dem adaptierten Protokoll erzeugt wurden, wiesen eine typi...

Diskussion

Die Entwicklung von Differenzierungsmethoden entlang unterschiedlicher Trajektorien für pluripotente Stammzellen hat viele Wege für die Untersuchung der Gehirnfunktion und der Krankheitsprozesse eröffnet 53,54,55. Erste Studien konzentrierten sich auf die Entwicklung spezifischer neuronaler Zelltypen, von denen angenommen wurde, dass sie bei bestimmten Erkrankungen des Gehirns wichtig sind

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
B-27 Supplement	Gibco	17504044
b-FGF	Peprotech	100-18B
BMP-4	Peprotech	120-05ET
Brainphys	StemCell Technologies	5790
CD11C Antikörper	Biolegend	337207	Verdünnung 1:200
Costar Zellkulturplatten mit flachem Boden	Corning	07-200-83
Ctip2-Antikörper	Abcam	ab18465
CUTL1 monoklonaler Antikörper	Abnova	H00001523-M01
DMEM/F-12, kein Phenolrot	Gibco	21041025
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich	P5499
DPBS, kein Calcium, kein Magnesium	Gibco	14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6421
EasYFlask Zellkulturflaschen	Nunc	156499
Fisherbrand Zellheber	Fisher Scientific	08-100-240
Flt3-Ligand	Peprotech	300-19
Fluo4-AM	Life Technologies	F-14201
Geltrex LDEV Free RGF BME 1 ML	ThermoFisher Scientific	A1413201
Glutamax	ThermoFisher Scientific	35050061
GM-CSF	Peprotech	300-03
Ziege Anti Huhn - IgG H& L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150169	Verdünnung 1:1000
Ziege Anti Maus - IgG H& L (Alexa Fluor 568)	Invitrogen	A-11004	Verdünnung 1:1000
Ziege Anti Rat- IgG H& L (Alexa Fluor 405)	Abcam	ab175670	Verdünnung 1:1000
Ziege Anti-Meerschweinchen IgG H& L (Alexa Fluor 405)	Abcam	ab175678	Verdünnung 1:1000
Ziegenserum	Sigma-Aldrich	G9023
HBSS	Invitrogen	14170120
IBA1 Antikörper	Abcam	ab5076	Verdünnung 1:500
IL-34	Peprotech	200-34
INF-y	Peprotech	300-02
KiCqStart SYBR Green Primer	Sigma-Aldrich	KSPQ12012
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
LDN193189	Sigma-Aldrich	SML0599
Cell Imaging Solution	Invitrogen	A14291DJ
MAP2 Antikörper	Synaptic Systems	188 004
M-CSF	Peprotech	300-25
N-2-Ergänzung	Gibco	17502001
Neurobasalmedium	Life Technologies	21103049
NutriStem hPSC XF Medium	Biological Industries	01-0005
P2RY12 Antikörper	Biolegend	848002
Paraformaldehyd 16%	Fisher Scientific	50-980-488
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Poly-L-Orthinin	Sigma-Aldrich	P3655
SATB2 Antikörper	Abcam	ab51502
SB431542	Sigma-Aldrich	S4317
SCF	Stemcell Technologies	78062
SensoPlate 24-Well-Glasbodenplatte	Greiner-Bio	662892
StemPro-34 SFM (1X)	Gibco	10639011
TMEM119 Antikörper	Abcam	ab185333	Verdünnung 1:1000
TPO	Peprotech	300-18
Triton-X	Sigma-Aldrich	9002-93-1
VEGF	Peprotech	100-20
Versene	ThermoFisher Scientific	15040066
Y-27632 Dihydrochlorid (ROCK-Inhibitor)	Tocris	1254