Das hier beschriebene Protokoll skizziert eine schnelle und effektive Methode zur Messung neutralisierender Antikörper gegen das SARS-CoV-2-Spike-Protein, indem die Fähigkeit rekonvaleszenter Serumproben bewertet wird, die Infektion durch ein verbessertes grün fluoreszierendes proteinmarkiertes vesikuläres Stomatitisvirus zu hemmen, das mit Spike-Glykoprotein pseudotypisiert ist.
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Methodenartikel
Nachweis von SARS-CoV-2 neutralisierenden Antikörpern mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzbildgebung von Pseudovirus-Infektionen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Da sich die COVID-19-Pandemie, die durch das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht wird, weiter entwickelt, ist es offensichtlich geworden, dass das Vorhandensein neutralisierender Antikörper gegen das Virus Schutz vor einer zukünftigen Infektion bieten kann. Da die Entwicklung und Translation wirksamer COVID-19-Impfstoffe mit beispielloser Geschwindigkeit voranschreitet, wird die Entwicklung schneller und wirksamer Methoden zur Messung neutralisierender Antikörper gegen SARS-CoV-2 immer wichtiger, um den langfristigen Schutz vor Infektionen sowohl für zuvor infizierte als auch für immunisierte Personen zu bestimmen. Dieser Artikel beschreibt ein Hochdurchsatzprotokoll unter Verwendung des vesikulären Stomatitisvirus (VSV), das mit dem SARS-CoV-2-Spike-Protein pseudotypisiert ist, um das Vorhandensein neutralisierender Antikörper im Rekonvaleszentenserum von Patienten zu messen, die sich kürzlich von COVID-19 erholt haben. Die Verwendung eines replizierenden pseudotypisierten Virus eliminiert die Notwendigkeit einer Containment-Level-3-Einrichtung, die für die SARS-CoV-2-Handhabung erforderlich ist, wodurch dieses Protokoll für praktisch jedes Containment-Level-2-Labor zugänglich ist. Durch die Verwendung eines 96-Well-Formats können viele Proben gleichzeitig mit einer kurzen Durchlaufzeit von 24 h ausgeführt werden.
Einleitung
Im Dezember 2019 wurde ein neuartiges Coronavirus identifiziert, das wir jetzt als SARS-CoV-2, den Erreger der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19)1,kennen. SARS-CoV-2 ist ein Betacoronavirus aus der Familie der Coronaviridae. Diese umhüllten Viren bestehen aus einem großen RNA-Genom mit positivem Sinn und sind für Atemwegs- und Darminfektionen bei Mensch und Tier verantwortlich2. Bis Mai 2021 gab es weltweit mehr als 157 Millionen gemeldete Fälle von COVID-19 und mehr als 3,2 Millionen Todesfälle3. Die Entwicklung eines wirksamen Impfstoffs ist zum Hauptziel von Forschern auf der ganzen....
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Protokoll
1. Plattierung von Zellen (Tag 1) zur Herstellung und Quantifizierung des SARS-CoV-2-Pseudovirus
- Vorbereitung für die Gewebekultur
- Warme 1x Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS); Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin (optional); und 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bis 37 °C in einem Wasserbad für ca. 15 min.
- Desinfizieren Sie eine Gewebekulturhaube mit 70% Ethanol und legen Sie bei Bedarf Gewebekulturschalen, Pasteurpipetten und serologische Pipetten in die Gewebekulturhaube. Entfernen Sie PBS, DMEM und Trypsin aus dem Wasserbad und desinfizi....
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Ergebnisse
Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und effektive Methode zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen das SARS-CoV-2 S-Protein durch Hemmung der VSV-S-eGFP-Pseudovirusinfektion (quantifizierbar durch Verlust von eGFP-Herden nachgewiesen). Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Es wird empfohlen, bei jeder Durchführung des Assays einen kommerziell erhältlichen Antikörper als Positivkontrolle zu verwenden, um die Konsistenz des Assays sicherzuste.......
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Diskussion
Die hier beschriebene Methode kann je nach Bedarf an unterschiedliche Laborumgebungen und Ressourcen angepasst werden. Wichtig ist, dass die Haupteinschränkung dieses Protokolls die Notwendigkeit eines Containment-Level-2-Raums und einer Gewebekulturhaube ist. Die Anwendung eines replizierenden RNA-Virus, das mit dem SARS-CoV-2-Spike pseudotypisiert ist, wie VSV-S-eGFP, ist eine beeindruckende Alternative zum SARS-CoV-2-Virus, das einen Arbeitsbereich der Eindämmungsstufe 3 erfordert, aber für einige Gruppen eine Einschr.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen im Zusammenhang mit dieser Publikation.
Danksagungen
Wir möchten dem Whelan-Labor für die großzügige Bereitstellung des in diesem Protokoll verwendeten VSV-S-eGFP-Virus danken (beschrieben in Case et al. 2020). Wir danken auch Dr. Bill Cameron und Dr. Juthaporn Cowan (und seinem Team) für die Sammlung der Blutproben des Patienten (REB-Protokoll-ID 20200371-01H). Die Autoren geben bekannt, dass sie die folgende finanzielle Unterstützung für die Forschung, Autorschaft und/oder Veröffentlichung dieses Artikels erhalten haben: Diese Arbeit wurde durch die großzügige Unterstützung der Ottawa Hospital Foundation und ein Stipendium der Canadian Institutes of Health Research (#448323) und einen Fast Grant der Thistledo....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,25 % Trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automatisierter Fluoreszenz-Imager | |
| Carboxymethylcellulose | Sigma | C5678 | |
| Modifiziertes Eagle-Medium von Dulbecco (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Modifizierter Eagle von Dulbecco's Medium (Pulver) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG-Isotypkontrolle (Maus) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike-neutralisierender Antikörper, Maus Mab | SinoBiologisch | 40592-MM57 | |
| Vero E6 Zellen | ATCC | CRL-1586 |
Referenzen
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
- Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
- COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource....
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Nachdrucke und Genehmigungen
