Screening-Assay für Arzneimittel- und Strahlentherapien mit mittlerem Durchsatz unter Verwendung von patienteneigenen Organoiden

Zusammenfassung

Wir beschreiben detaillierte Protokolle zur Verwendung von patienteneigenen Organoiden für Therapiesensitivitätsscreenings mit mittlerem Durchsatz. Zu den getesteten Therapien gehören Chemotherapie, Strahlentherapie und Chemo-Strahlentherapie. Der Adenosintriphosphatspiegel wird als funktionelle Anzeige verwendet.

Zusammenfassung

Patienten-abgeleitete Organoid-Modelle (PDO) ermöglichen die langfristige Expansion und Erhaltung von primären Epithelzellen, die in drei Dimensionen und in einem nahezu nativen Zustand gezüchtet werden. Wenn Organoide aus reseziertem oder biopsiertem Tumorgewebe gewonnen werden, rekapitulieren sie die Tumormorphologie in vivo genau und können zur Untersuchung des Therapieansprechens in vitro verwendet werden.Biobanken von Tumor-Organoiden spiegeln die große Vielfalt klinischer Tumoren und Patienten wider und sind daher vielversprechend für präklinische und klinische Anwendungen. In dieser Arbeit wird eine Methode für das Wirkstoffscreening mit Hilfe von Plattenepithelkarzinomen im Kopf- und Halsbereich und kolorektalen Adenokarzinom-Organoiden vorgestellt. Dieser Ansatz kann problemlos für jedes aus Gewebe gewonnene Organoidmodell übernommen werden, sowohl für normale als auch für kranke. Es werden Verfahren zur in vitro Exposition von Organoiden unter Chemo- und Strahlentherapie (entweder als Einzelbehandlung oder in Kombination) beschrieben. Das Überleben der Zellen nach 5-tägiger Arzneimittelexposition wird durch Messung des Adenosintriphosphats (ATP)-Spiegels bewertet. Die Arzneimittelempfindlichkeit wird anhand der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC₅₀), der Fläche unter der Kurve (AUC) und der Wachstumsrate (GR) gemessen. Diese Parameter können Aufschluss darüber geben, ob eine Organoidkultur als empfindlich oder resistent gegen eine bestimmte Behandlung gilt.

Einleitung

Organoidmodelle, die aus adulten Stammzellen hergestellt und in einer dreidimensionalen (3D) extrazellulären Matrix (EZM) und einem spezifischen Wachstumsfaktor-Cocktail (auch bekannt als HUB-Organoide) gezüchtet wurden, gewinnen als präklinische onkologische Screening-Plattformen an Bedeutung. Vom Patienten stammende Organoid-Kulturen (PDO) können sowohl aus normalen als auch aus erkrankten Gewebebiopsien innerhalb von 1-2 Wochen hergestellt und um mindestens 1-2 Monate bis zu unbegrenzten Zeiträumen erweitert werden. Die Kryokonservierung ermöglicht die langfristige Verwendung gut charakterisierter Kulturen. Im Gegensatz zu herkömmlichen zweidimensionalen Zelllinienmodellen, die klonal abgeleitet sind, rekapitulieren PDO-Modelle das ursprüngliche Tumorgewebe sowohl phänotypisch als auch genetisch genau und bewahren die Tumorheterogenität. Wirkstoffscreenings mit mittlerem Durchsatz an PDOs, mit denen eine breite Palette von Therapien getestet wird, bieten eine einzigartige Plattform für die personalisierte Medizin.

Frühere Studien haben die Verwendung von Organoidmodellen für das Therapiescreening, insbesondere für Medikamente und Strahlentherapie, in Modellen beschrieben, die aus verschiedenen Tumorarten erstellt wurden, und zeigen das prädiktive Potenzial von Organoiden zur Steuerung der klinischen Entscheidungsfindung 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . In dieser Arbeit werden die Methoden des onkologischen Therapiescreenings mit PDOs im mittleren Durchsatz beschrieben (Abbildung 1A). Dieses Protokoll ist in einem halbautomatischen 384-Well-Plattenformat angelegt und ermöglicht Therapietests für bis zu acht Organoidmodelle, 16 Verbindungen und bis zu acht 384-Well-Platten. Neben Compound Drug Screenings werden in dieser Arbeit auch Methoden zur Diagnostik der Sensitivität und Sensibilisierung von Strahlentherapien beschrieben. Darüber hinaus wird der Einsatz von Hochdurchsatz-Robotik diskutiert, um das Wirkstoffscreening bis zur Vollautomatisierung hochzuskalieren. Wichtig ist, dass Organoide aus verschiedenen Geweben unterschiedliche Medien und eine unterschiedliche Handhabung erfordern können.

Hier wird ein allgemeines Drug-Screening-Assay-Protokoll beschrieben, das je nach interessierendem Organoid möglicherweise angepasst werden muss. Ansatzpunkte und Optimierungsvorschläge fließen in die Diskussion ein, ebenso wie allgemeine Empfehlungen zum Versuchsaufbau und zur Organoid-Praxis. Beispiele werden unter Verwendung von Plattenepithelkarzinom-Organoiden (HNSCC) im Kopf- und Halsbereich gegeben, die typischerweise eine dichte Morphologie aufweisen, und Darmkrebs-Organoiden (CRC), die entweder eine zystische oder eine dichte Morphologie aufweisen können. Bitte beachten Sie, dass die Etablierung und Expansionskulturmethoden von primären Organoiden in diesem Protokoll nicht behandelt werden. Für grundlegende Organoid-Techniken sollte sich der Leser auf andere Protokolle beziehen (z. B. ¹²). Dieses visuelle Protokoll wird einen Einblick in den Prozess des Wirkstoffscreenings mit mittlerem Durchsatz unter Verwendung von Organoidmodellen geben.

Protokoll

HINWEIS: Bevor Sie dieses Protokoll verwenden, stellen Sie bitte sicher, dass die Richtlinien der Ethikkommission der Humanforschung der Institution befolgt werden. Die Entnahme von Patientengewebe und die in diesem Protokoll beschriebenen Daten erfolgte gemäß den EUREC-Richtlinien und den europäischen, nationalen und lokalen Rechtsvorschriften. Alle Organoide wurden von einwilligenden Patienten abgeleitet, und die Einwilligung kann jederzeit widerrufen werden.

1. Vor dem Screening

1. Bestätigung der Identität neu etablierter Modelle (z. B. durch Histologie und/oder DNA-Sequenzierung 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11), um die Möglichkeit einer normalen Zellüberwucherung auszuschließen, und Sicherstellung, dass das Wirkstoffscreening an Tumororganoidkulturen durchgeführt wird (siehe Beispiel in Abbildung 2D).
2. Entwerfen Sie den Versuchsplattenaufbau unter Verwendung der allgemeinen Empfehlungen, die im Diskussionsteil gegeben wurden (siehe Beispiel in der ergänzenden Abbildung S1).
3. Berechnen Sie die erforderliche Anzahl von Organoiden und bereiten Sie genügend Organoide vor, die am Tag 0 geteilt werden können ( verwenden Sie Tabelle 1 als Referenz).
   HINWEIS: Abhängig von der GR des Organoidtyps und -modells sind für jede volle 384-Well-Screening-Platte ca. 1-2 volle 6-Well-Platten erforderlich. Als Richtwert gilt, dass eine volle Vertiefung einer 6-Well-Platte ±20.000 zystische Organoide oder bis zu 50.000 dichte/traubenartige Organoide enthält.
4. Überprüfen Sie, ob der Zellspender mit einem Reporterfarbstoff kalibriert ist, und kalibrieren Sie bei Bedarf gemäß dem Protokoll des Herstellers.

2. Vorbereitung der Reagenzien

1. Bereiten Sie das Basismedium vor: advanced DMEM/F12+++ (aDF+++). Geben Sie jeweils 5 ml 1x L-Glutaminersatz (v/v), 1 M 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-Ethansulfonsäure (HEPES) und 100 μl-Penicillin/Streptomycin in eine 500-ml-Flasche mit fortgeschrittenem DMEM/F12. Bewahren Sie aDF+++ bis zu 1 Monat bei 4 °C auf.
2. Bereiten Sie das geeignete Organoid-Expansionsmedium (d. h. Wachstumsmedium) für den verwendeten Organoidtyp^{vor 9,10}.
3. Bereiten Sie das Screening-Medium vor, das sich je nach Versuchsaufbau vom Expansionsmedium unterscheiden kann. Um die Genesung nach der Abgabe der Organoide zu unterstützen, geben Sie 5 μM Rho-Kinase (ROCK)-Inhibitor (Y-27632) in das Screening-Medium.
4. Bereiten Sie eine 100 mg/ml-Lösung von Dispase II in aDF+++ vor.
   HINWEIS: Eine 100-fache Lösung der Dispase ist bei -20 °C 2 Monate lang stabil.

3. Tag 0: Vorbereitung der Organoide

HINWEIS: Die unten angegebenen Volumina beginnen mit einer vollen, gut gewachsenen 6-Well-Platte mit Organoiden, was 1200 μl Organoiden/ECM (200 μl Organoiden/ECM pro Well) entspricht.

1. Untersuchen Sie Organoide mit einem Hellfeldmikroskop auf mögliche Infektionen, Dichte und allgemeines Erscheinungsbild. Machen Sie Bilder von allen Modellen als Referenz, bevor Sie sie weitergeben.
2. Passieren Sie die Organoide und das Saatgut gemäß den folgenden Schritten. Führen Sie diese Schritte bei Raumtemperatur durch, um Temperaturschwankungen bei Organoiden zu reduzieren. Verwenden Sie bei der Handhabung von Organoidsuspensionen Spitzen mit geringer Retention oder vorbefeuchtete Pipetten und Kunststoffe, um den Verlust von Organoiden zu verhindern.
   1. Bei Verwendung größerer Volumina von EZM/Organoiden (>1200 μl ECM) ist ein EZM-Aufschluss mit Dispase wie folgt in Betracht zu ziehen, um die Entfernung von Organoiden aus der EZM zu unterstützen.
      HINWEIS: Die Dispase zersetzt die EZM, hat aber keinen Einfluss auf die Organoide.
      1. Optional: Geben Sie 1 mg/ml Dispase in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Organoide 30 Minuten lang in einem 37 °C Inkubator, bevor Sie sie wie gewohnt passieren.
         HINWEIS: Da die Dispase nicht durch mittlere Komponenten inaktiviert wird, waschen Sie sie (mit aDF+++) mit mindestens dem 20-fachen Volumen der Dispase ab.
   2. Sammeln Sie die Organoide in drei 15-ml-Röhrchen (bis zu 400 μl ECM pro Röhrchen). Mit aDF+++ auf 12 mL auffüllen und 5 Minuten bei RT bei 85 × g zentrifugieren. Bei ordnungsgemäßer Pelletierung den Überstand ansaugen. Wenn die Organoide nicht eindeutig pelletiert sind, zentrifugieren Sie bei höherer Geschwindigkeit (bis zu 450 × g; je nach Art und Größe des Organoids) für weitere 5 Minuten. Suspendieren Sie das Pellet wieder und wiederholen Sie den Waschvorgang.
      HINWEIS: Eine glasartige Schicht über dem Pellet weist auf das Vorhandensein von ECM hin. Prüfen Sie mit einem Hellfeldmikroskop, ob keine Organoide in der EZM eingeschlossen sind (eine geringe Anzahl eingeschlossener Organoide kann akzeptabel sein), und entfernen Sie die verbleibende EZM vorsichtig mit einer p1000-Pipette. Wenn (zu) viele Organoide in der EZM vorhanden sind, wiederholen Sie den Schritt der Dispase-Dissoziation oder waschen Sie das Pellet und schleudern Sie es mit einer höheren Geschwindigkeit (maximal 450 × g).
   3. Für jedes 15-ml-Röhrchen resuspendieren Sie das Organoid-Pellet in 1 mL aDF+++ und dissoziieren Sie die Organoide vorsichtig, bis sie die richtige Größe erreicht haben. Verwenden Sie die Dissoziationsmethode, die je nach Typ/Morphologie für die regelmäßige Aufteilung verwendet wird (Tabelle 1).
      1. Im Falle von zystischen und traubenartigen Organoiden diese mechanisch aufbrechen, indem man sie in kleine Fragmente (<100 μm) schert, indem man mit einem p1000 mit einer p2-Spitze oben auf und ab pipettiert oder mit einer vorbenetzten, mit Glas verstopften Pasteur-Pipette, deren Spitze in einer Flamme verengt wurde.
         HINWEIS: Bestätigen Sie die Organoid-Störung mit einem Hellfeldmikroskop, nachdem Sie alle 5 Mal auf und ab pipettiert haben, mit dem Ziel, dass die Organoide kleiner als oder innerhalb des Größenbereichs des Bildschirms liegen (Tabelle 1).
      2. Bei dichten Organoiden 1 ml 50%ige v/v-Lösung von TrypLE in aDF+++ zugeben, um das Zellpellet zu resuspendieren, und mindestens 2 Minuten bei 37 °C inkubieren. Schütteln Sie anschließend das Rohr kräftig auf und ab und prüfen Sie es unter einem Hellfeldmikroskop. Mit dem gleichen Ansatz wie oben zerkleinern Sie Organoide mechanisch mit einer Pipette und überprüfen sie während des gesamten Prozesses ständig unter dem Mikroskop. Für HNSCC-Organoide inkubieren Sie in 100%iger Lösung des TrypLE für 5 min.
         HINWEIS: Je nach Art der Kultur sollten Sie kleine Gruppen von Zellen (z. B. Darmkrebs-Organoide >20 μm) oder einzelne Zellen (z. B. HNSCC-Organoide) erhalten. Stellen Sie sicher, dass die proteolytische Inkubation 15 Minuten nicht überschreitet, da dies die Lebensfähigkeit der Organoide beeinträchtigen kann.
   4. Waschen Sie die Organoide mit 10 mL aDF+++. Die Organoide bei 85 × g 5 min drehen; Aspirieren Sie den Überstand, wenn er ordnungsgemäß pelletiert ist. Wenn die Organoide schwer zu pelletieren sind, zentrifugieren Sie alternativ 5 Minuten lang auf bis zu 450 × g .
   5. Saatgut-Organoide mit einer hohen Dichte in 50 % Expansionsmedium/50 % ECM (ermöglicht eine einfache Entnahme aus der EZM in Abschnitt 4). Streben Sie eine ungefähr doppelte Dichte im Vergleich zu einer regulären Aufteilung an, die häufig zu einer 1:1-Aufteilung führt (siehe Beispiele in Abbildung 1). Saatgut-Organoide in 10 μl Tröpfchen (insgesamt 200 μl pro Well) einer vorgewärmten 6-Well-Platte.
      HINWEIS: Bewahren Sie vorgewärmte Platten über Nacht in einem Inkubator bei 37 °C oder mindestens 1 h in einem Ofen bei 60 °C auf, um eine schnelle Verfestigung der ECM zu gewährleisten, eine Ausbreitung der ECM zu verhindern und somit eine ordnungsgemäße Bildung der Halbkugelkuppel zu gewährleisten.
   6. Drehen Sie die Platte um und stellen Sie sie für 30 Minuten in einen 37 °C heißen Inkubator, damit
   das ECM einzustellen. Nach 30-60 min das Ausdehnungsmedium (Raumtemperatur) vorsichtig in die Vertiefungen geben.

4. Tag 2 (Bereich: Tage 1 - 3): Organoid-Abgabe

HINWEIS: Je nach Organoid-GR kann dies auch an Tag 1 oder 3 auftreten. Während des gesamten Wirkstoffscreenings werden Organoide in Schwebe gehalten. Zu diesem Zweck werden sie in einer niedrigen Konzentration an EZM (5-10%) dosiert, bei der das Organoidwachstum erhalten bleibt, aber keine Verfestigung der EZM auftritt. Dies ermöglicht eine automatisierte Dosierung, eine optimale Interaktion zwischen Organoiden und Verbindungen und eine reproduzierbare Zelllyse, schränkt aber auch die Möglichkeit ein, das Medium zu wechseln.

1. Berechnen Sie die Konzentration und Menge der Organoidsuspension, die für das Wirkstoffscreening erforderlich ist.
   1. Je nach verwendetem Zellspender ist bei der Berechnung das Totvolumen zu berücksichtigen.
      HINWEIS: Bei der Abgabe von 40 μl Organoidsuspension pro Vertiefung erfordert eine 384er-Platte ein Gesamtvolumen von 15,4 ml. Im Durchschnitt hat jedes Multidrop-Zellen-Dosierrohr ein Totvolumen von ~1 ml, was bei Verwendung aller Düsen zu einem Totvolumen von 8 mL führt. Daraus ergibt sich eine Gesamtmenge von 23,4 mL für jedes Organoidmodell für eine gesamte 384-Well-Platte. Die Herstellung von 25 ml Organoidsuspension gewährleistet daher genügend Organoide für die Dispensation und für die optionale Nachuntersuchung (Einzelnukleotid-Polymorphismus, SNP) (siehe 4.4.7).
2. Vorbereitung für die Organoid-Entnahme
   1. Zur Vorbereitung des Waschpuffers fügen Sie aDF+++ einen ROCK-Inhibitor (Y-27632) bis zu einer Endkonzentration von 10 μM hinzu (±100 mL sind für jede Organoidkultur erforderlich, die gescreent wird).
   2. Untersuchen Sie die Organoide in allen Vertiefungen mit einem Hellfeldmikroskop, um die Wiederherstellung der Organoide nach der Passage zu beurteilen und mögliche Infektionen auszuschließen. Überprüfen Sie, ob die Organoide die richtige Größe haben, indem Sie ein mikroskopisches Bild aufnehmen und die Organoide mit einem digitalen Maßstabsbalken messen (Tabelle 1).
      HINWEIS: Wenn die Organoide nicht die richtige Größe haben (zu groß oder zu klein), gehen sie beim Filterprozess verloren, und es ist möglicherweise nicht genügend Material für das Wirkstoffscreening vorhanden. Ist dies der Fall, empfiehlt es sich, das Medikamentenscreening zu verschieben.
   3. Geben Sie 1 mg/ml Dispase in jede Vertiefung und inkubieren Sie in einem 37 °C heißen Inkubator für 30-60 Minuten (bis zu maximal 120 Minuten), um die EZM zu verdauen. Überprüfen Sie den Fortschritt der EZM-Dissoziation unter dem Mikroskop, um zu sehen, ob die Tropfen der EZM schwimmen. Wenn nicht, pipettieren Sie den Inhalt der Vertiefung über die Tröpfchen der ECM, die sich nach Abschluss des Aufschlusses leicht lösen sollten.
3. Bereiten Sie die Organoide für die Abgabe in eine 384-Well-Platte gemäß den folgenden Schritten vor. Führen Sie diese Schritte bei Raumtemperatur (einschließlich Zentrifugation) durch, um Temperaturschwankungen bei Organoiden zu reduzieren.
   1. Entnehmen Sie die Organoidsuspension mit einer p1000-Pipette von der Kulturplatte.
   2. Abhängig von den erforderlichen Filterschritten (je nach Organoidtyp, siehe Tabelle 1) folgen Sie dem entsprechenden Schritt.
      HINWEIS: Eine Vorbenetzung der Filter mit Waschpuffer ist unerlässlich, um zu verhindern, dass die Organoide am Filter haften bleiben.
      1. Führen Sie eine Einzelfilterung durch, wenn alle kleinen Fragmente und Einzelzellen einbezogen werden, z. B. für HNSCC-Tumororganoide, Filter für Organoide < 70 μm. Sammeln Sie die geernteten Organoide in einem 15-ml-Röhrchen und waschen Sie sie zweimal mit 12 mL Waschpuffer. Die Organoide werden über einen vorbenetzten 70 μm Filter in ein 50 mL Röhrchen filtriert, mit 3 x 4 mL aDF+++ gewaschen und in ein 15 mL Röhrchen überführt. Wenn das Volumen zu hoch ist, schleudern Sie 5 Minuten lang bei 85 × g und geben Sie das Pellet in 12 mL aDF+++ in ein 15-ml-Röhrchen; Fahren Sie mit 4.3.3 fort.
      2. Führen Sie eine Doppelfilterung zur Entfernung von Ablagerungen und großen Organoiden durch, z. B. für Darmkrebs-Tumororganoide, filtern Sie >100 μm und <20 μm Organoide heraus. Filtrieren Sie die geernteten Organoide sofort über einen vorbenetzten 100/70/40 μm-Filter (Tabelle 1) in ein 50-ml-Röhrchen und waschen Sie den Filter mit 2 x 10 mL Waschpuffer. Verwenden Sie einen vorbenetzten 20-μm-Filter pro drei Wells aus einer 6-Well-Platte mit Organoiden. Filtrieren Sie die <100 μm Organoide über die 20 μm Filter und waschen Sie den Filter mit 2 x 10 mL Waschpuffer. Holen Sie die Organoide aus dem Filter zurück, indem Sie ihn auf ein sauberes 50-ml-Röhrchen umdrehen und mit 3 x 4 mL aDF+++ waschen. Übertragen Sie die Organoid-Suspension in ein 15-ml-Röhrchen; Wenn das Volumen >15 mL beträgt (da möglicherweise eine weitere Filterwäsche erforderlich ist), schleudern Sie 5 Minuten lang bei 85 × g und geben Sie das Pellet in 12 mL aDF+++ in ein 15 mL Röhrchen.
         HINWEIS: Organoide, die im Filter eingeschlossen werden, können für eine spätere Verwendung zurückgewonnen werden (Passaging); Im nächsten Schritt kommen Organoide < 100 μm zum Einsatz. Zellen und Ablagerungen, die durch den Filter gegangen sind, werden verworfen, im Filter gefangene Organoide (>20 μm, <100 μm) werden für das Screening verwendet.
   3. Bei 450 × g für 3 min zentrifugieren und den Überstand vorsichtig absaugen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 1 ml Siebmedium, füllen Sie es mit weiteren 1-9 mL Medium auf (abhängig von der Pelletgröße; streben Sie ~75-150 Organoide/10 μl an) und resuspendieren Sie es, indem Sie mit einer vorbenetzten serologischen Pipette auf und ab pipettieren.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, dem Screening-Medium 5 μM ROCK-Inhibitor zuzusetzen.
   4. Mischen Sie die Organoidsuspension gründlich, indem Sie mit einer vorbenetzten serologischen Pipette 5x auf und ab pipettieren und zählen Sie die Anzahl der Organoide in 10 μl der Suspension, indem Sie einen Schlauch in eine Petrischale pipettieren und unter dem Mikroskop zählen. Bei kleineren Organoiden (<70 μm) fügen Sie 10 μl der Organoidsuspension zu einem 10-Kammer-Objektträger mit einem Hämozytometergitter hinzu und zählen Sie die Anzahl der Organoide. Berechnen Sie die Anzahl der Organoide/ml gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   5. Bereiten Sie die erforderliche Menge an Dosiermedium vor, indem Sie 5 % (v/v) ECM zu dem eiskalten Siebmedium hinzufügen (z. B. für 25 mL Dosiermedium 1,25 mL ECM zu 23,75 mL eiskaltem Siebmedium). Geben Sie ECM nur in eiskaltes Medium, um ein Erstarren des ECM zu verhindern. Wenn Sie mehrere Organoidmodelle screenen, bereiten Sie das Dispensiermedium in loser Schüttung vor, um die Konsistenz des Prozentsatzes der ECM über alle Modelle hinweg sicherzustellen.
   6. Geben Sie die erforderliche Anzahl von Organoiden (siehe Tabelle 1 für Richtlinien und Diskussion für Hinweise) in ein neues 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie 3 Minuten lang bei 450 × g . Saugen Sie vorsichtig an, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie das Pellet gründlich in 100 μl Siebmedium mit einer p200-Pipette. Stellen Sie sicher, dass das Pellet homogen und vollständig resuspendiert ist, ohne Organoidklumpen. Füllen Sie anschließend die Suspension mit der erforderlichen Menge an eiskaltem Dosiermedium auf und halten Sie die Organoid-Suspension von nun an auf Eis.
4. Dispensieren Sie die Organoide mit einem Zellspender (z. B. Multidrop) in 384-Well-Platten.
   1. Richten Sie den Zellspender so ein, dass er 40 μl Zellsuspension pro Vertiefung abgibt.
      1. Hauptmenü | Plattentyp auswählen | OK | 384 Standard | OKAY
      2. Kassettentyp: Standard-Röhrenkassette (rechte Seite) | Wählen Sie das Volumen mit den Pfeilen nach oben und unten (40 μL).
      3. Wählen Sie je nach Plattenlayout Vollständige Platte oder Spalten aus.
   2. Waschen Sie den Schlauch mit 70 % Ethanol (EtOH), gefolgt von steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Verwenden Sie >15 mL pro Waschgang. Lassen Sie etwas Luft zwischen den einzelnen Flüssigkeiten, um den Beginn und das Ende jeder Wäsche zu visualisieren. Prüfen Sie, ob alle Dosierköpfe "gerade" dosieren, und waschen Sie erneut, wenn dies nicht der Fall ist.
   3. Wählen Sie im Menü "Einstellungen " die Option "Vordispensieren" und stellen Sie die Dosis auf 60 μl ein, um die Organoidsuspension nach der Grundierung und vor der Abgabe vorzudosieren.
   4. Grundieren Sie den Dispenser mit der Organoid-Suspension, während Sie die Suspension auf Eis halten. Resuspendieren Sie durch kontinuierliches Pipettieren mit einer p1000-Pipette. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in der Lösung entstehen. Sobald die Platte grundiert ist und die Platte in Position ist, geben Sie die Organoide durch Drücken von Start ab.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist einfacher mit zwei Personen durchzuführen: eine Person hängt den Spender wieder auf und die andere bedient ihn.
   5. Falls erforderlich, geben Sie für jedes Organoidmodell, das im Sieb enthalten ist, mindestens 5 weitere Vertiefungen in einer zusätzlichen Siebplatte ab.
      HINWEIS: Dies ermöglicht einen T=0-Messwert im Laufe des Tages (siehe Abschnitt 7 und Diskussion). Diese Abgabe kann auf Wunsch auch manuell erfolgen.
   6. Setzen Sie den Deckel sofort wieder auf die Platte, um eine Kontamination der Vertiefungen zu vermeiden. Bestätigen Sie unter dem Mikroskop, dass alle Vertiefungen korrekt gefüllt wurden und ob die Organoide gleichmäßig über die Platte verteilt sind.
   7. Falls erforderlich, holen Sie nach Abschluss der Beschichtung die Organoid-Suspension aus dem Schlauch zurück (klicken Sie auf Leeren) und schleudern Sie die restlichen Organoide herunter. In ein 1,5-ml-Röhrchen überführen und für die spätere SNP-Analyse einfrieren.
      HINWEIS: Wenn während der Abgabe Luft in den Schlauch eingedrungen ist und einige Vertiefungen nicht richtig gefüllt wurden, füllen Sie die Vertiefungen manuell, indem Sie 40 μl pro Vertiefung hinzufügen.
   8. Wenn mehrere Organoid-Modelle ausgegeben werden, spülen Sie den Schlauch mit PBS, EtOH und PBS und wiederholen Sie die Schritte 4.4.4 bis 4.4.8 für jedes Modell.
   9. Übertragen Sie die Platten in einen 37 °C heißen Inkubator in eine 5 % CO₂ -Atmosphäre, bis sie für die Arzneimittelabgabe bereit sind. Um Unterschiede im Luftaustausch zwischen verschiedenen Platten zu vermeiden, vermeiden Sie das Stapeln der Platten im Inkubator.
   10. Reinigen Sie den Schlauch so schnell wie möglich mit PBS und dann mit EtOH. Achten Sie darauf, den Schlauch vollständig zu trocknen, indem Sie Luft durch das System laufen lassen.

5. Tag 2 (Bereich: Tage 1 - 3): Abgabe von Medikamenten mit einem Medikamentenspender (z. B . D300e)

ANMERKUNG:. Je nach Forschungsfrage kann der Wirkstoffdruck auch einen Tag nach der Aussaat erfolgen.

1. Richten Sie den Medikamentenspender ein
   1. Starten Sie die Spendersoftware und wählen Sie das gewünschte Plattenformat für den Bildschirm aus, indem Sie Platte 1 markieren und das Bleistiftwerkzeug auswählen, um den Platteneditor aufzurufen.
   2. Wählen Sie den Plattentyp aus und stellen Sie das zusätzliche Volumen jeder Vertiefung ein (Volumen der Flüssigkeit (Organoidsuspension), das sich bereits in der Platte befindet). Für das 384-Well-Format verwenden Sie 40 μl/Well.
   3. Verwenden Sie in der linken Leiste das + -Symbol, um jede Arzneimittellösung hinzuzufügen, die auf dem Bildschirm verwendet wird.
   4. Bearbeiten Sie jede Flüssigkeit, indem Sie das Bleistiftwerkzeug auswählen. Bearbeiten Sie den Namen des Arzneimittels, die Wirkstoffklasse (z. B. DMSO-basiert oder wässrig (z. B. Wasser, PBS)) und die Stammkonzentration des Arzneimittels.
      HINWEIS: Überschreiten Sie nicht die Stammkonzentration von 10 mM pro Arzneimittel. Im Idealfall sollte die maximale Konzentration des Lösungsmittels 0,8 % für DMSO und 3 % für PBS/0,3 % Detergens (z. B. Tween) betragen (siehe Normalisierung unten und Diskussion).
   5. Nachdem alle Medikamente im Programm hinzugefügt wurden, wählen Sie die Vertiefungen für die Zugabe der Medikamente aus, indem Sie eine Vertiefung auf dem Plattenlayout markieren und über die Platte ziehen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die ausgewählten Vertiefungen, und fügen Sie die Konzentration hinzu.
      1. Stellen Sie den Wert ein, um die gewünschte Konzentration jedes Arzneimittels (μM) zu definieren.
      2. Definieren Sie für die Titration die gewünschte höchste und niedrigste Konzentration jedes Arzneimittels (μM), die Verteilung (logarithmisch oder linear), die Replikationen pro Stufe (z. B. 3) und das Titrationsmuster.
      3. Definieren Sie für die gezielte Titration die höchste und niedrigste Konzentration jedes Arzneimittels, die Verteilung (logarithmisch oder linear), die Zielkonzentration (μM), die Zielregion (Niveaus), den Zielbereich (log), die Replikate pro Stufe (z. B. 3) und das Titrationsmuster.
   6. Normalisieren Sie alle Wirkstoffvertiefungen auf das entsprechende Lösungsmittel (z. B. DMSO oder wässrig + Tween-20). Bei Arzneimitteln, die in wässrigen Lösungen gelöst sind, ist Tween-20 (Endkonzentration 0,3 % im Arzneimittelbestand) zuzugeben, um eine angemessene Oberflächenspannung der Arzneimittellösung für die Abgabe mit dem D300e sicherzustellen (siehe 5.2.6). Wählen Sie alle Vertiefungen aus, einschließlich der Vertiefungen ohne Arzneimittel (Negativkontrollen), klicken Sie mit der rechten Maustaste, wählen Sie Normalisierung und dann Normalisieren. Wählen Sie das entsprechende Lösungsmittel aus, und wählen Sie Auf höchstes Volumen normalisieren , um auf die höchste Konzentration des ausgewählten Arzneimittels zu normalisieren.
      HINWEIS: In der unteren linken Ecke jedes Wells werden jetzt schwarze Dreiecke angezeigt, um die Normalisierung zu bestätigen. Streben Sie mindestens 6 (idealerweise >9) negative Kontrollvertiefungen für jedes verwendete Arzneimittellösungsmittel an.
   7. Wählen Sie mindestens 3 Wells (idealerweise >6), um je nach Kultur bekannte zytotoxische Reagenzien wie Staurosporin als Positivkontrollen (1-5 μM) zu verwenden. Wenn die zytotoxische Konzentration der Positivkontrolle unbekannt ist, entscheiden Sie sich für eine hohe Konzentration, um alle Organoide in den Positivkontrollvertiefungen abzutöten.
      HINWEIS: Alternativ kann Navitoclax (20 μM) verwendet werden, um den Tod von Organoiden während des Wirkstoffscreenings sicherzustellen.
   8. Sobald das Plattenlayout abgeschlossen ist, wählen Sie Ausführen (wenn die Maschine eingeschaltet ist) in der oberen linken Ecke. Speichern Sie das Protokoll, um fortzufahren.
      HINWEIS: Das Programm hat nun das erforderliche Volumen jedes Medikaments für die Abgabe berechnet. Da dies auch Pipettierfehler einschließt, ist dies genau die Menge an Medikament, die für das gesamte Protokoll benötigt wird. Optional: Wenn Sie Simulieren auswählen, wird das gesamte Protokoll simuliert (ohne Hinzufügen von Medikamenten), um zu beobachten, wie das Protokoll ausgeführt wird. Sowohl im Ausführungs - als auch im Simulationsmodus wird ein Bericht generiert, der den Zeitpunkt, die Reihenfolge und die Volumina der Medikamente dokumentiert, die jeder Vertiefung hinzugefügt wurden. Dies kann nützlich sein, um sicherzustellen, dass das Protokoll korrekt ist, und um das genaue Volumen und die Anzahl der Kassetten zu bestimmen, die benötigt werden, bevor mit dem Experiment fortgefahren wird.
2. Vorbereiten und Drucken von Medikamenten
   1. Fügen Sie 0,3 % (v/v) Tween-20 zu wässrigen Arzneimitteln (z. B. Wasser oder PBS) hinzu, um eine angemessene Oberflächenspannung der Arzneimittellösung für die Abgabe mit dem D300e sicherzustellen. Stellen Sie sicher, dass die Tween-20-Konzentration 3 % PBS/0,3 % Tween-20 (v/v) nicht überschreitet, und halten Sie die Endkonzentration von Tween-20 unter 0,01 %.
      HINWEIS: Fügen Sie Tween-20 nur unmittelbar vor der Zugabe zur Kassette des Arzneimitteldruckers zu Arzneimittelvorräten hinzu, da die hohe Konzentration von Tween-20 im Vorrat möglicherweise (proteinbasierte) Arzneimittel (z. B . Antikörper-basierte Arzneimittel) inaktiviert. Dieser Schritt ist nicht erforderlich für Arzneimittel, die in DMSO gelöst sind. Stellen Sie jedoch sicher, dass der endgültige Prozentsatz an DMSO in jeder Vertiefung 0,8-1 % nicht überschreitet.
   2. Halten Sie sowohl D8+ Low-Volume- als auch D4+ High-Volume-Kassetten bereit. Aktivieren Sie Kassetten mit hohem Volumen im Programm verwenden , wenn große Mengen an Normalisierungsflüssigkeit verwendet werden.
   3. Führen Sie das Protokoll aus, um mit der Abgabe der Medikamente zu beginnen.
      HINWEIS: Das Programm führt das Protokoll schrittweise aus und gibt an, wann und wie viel von jeder Verbindung hinzugefügt werden muss. Verwenden Sie Filterspitzen für den Umgang mit hohen Konzentrationen von Medikamenten. Achten Sie darauf, chemische Abfälle und gebrauchte Spitzen gemäß den Richtlinien zur biologischen Sicherheit zu entsorgen.
   4. Verwenden Sie nach Abschluss des Protokolls selbstklebende luft- und flüssigkeitsdurchlässige Dichtungen (z. B. Plattendichtungen aus medizinischem Polyurethan; Tabelle der Materialien) um die Platten abzudecken und die Platten wieder auf 37 °C, 5 % CO₂ zu bringen.
      HINWEIS: Die Verwendung dieser Dichtungen verhindert die Verdunstung durch "Kanteneffekt" (siehe Diskussion). Wenn Sie die Dichtungen nicht verwenden, stellen Sie sicher, dass die Außenkanten der Platte nicht im Arzneimittelsieb verwendet werden. Stapeln Sie die Platten nicht übereinander und stellen Sie sicher, dass die Platten im hinteren Teil des Inkubators aufbewahrt werden, oder verwenden Sie einen Inkubator, der nicht (häufig) geöffnet wird, um Temperaturschwankungen zu vermeiden.
   5. Wenn die Strahlentherapie mit gedruckten Arzneimitteln kombiniert wird, fahren Sie mit Abschnitt 6 fort. Wenn nicht, lassen Sie die Platten 5 Tage im Inkubator.
      HINWEIS: Abhängig vom Organoidtyp und der Art des Arzneimittels können einige Experimente länger als 5 Tage dauern. Bei Experimenten, die >7 Tage dauern, wechseln Sie das Medium und die Verbindungen nach der Hälfte des Versuchsverfahrens vorsichtig (z. B. indem Sie 50 % des Mediums durch frisches Screening-Medium ersetzen), um einen umfangreichen Zelltod in den negativen Kontrollvertiefungen zu vermeiden.

6. Tag 2 (Bereich: Tage 2 - 4): Behandlung von Organoiden mit Photonenstrahlstrahlung

HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben die Bestrahlung von Organoiden. Um die strahlensensibilisierende Wirkung von Wirkstoffen zu beurteilen, wird die Bestrahlung 24 Stunden nach der Chemotherapie der Organoide durchgeführt. Das gleiche Protokoll wird für die Bewertung der Auswirkungen der Bestrahlung allein verwendet, wobei Organoide ausgesät und 24 Stunden nach der Aussaat bestrahlt werden. Dies kann je nach Hypothese und Organoidkulturen eine gewisse Optimierung erfordern. Die folgenden Schritte beschreiben den Prozess zur Bestrahlung von Organoiden mit speziell erzeugten 6-MV-Photonenstrahlen (Table of Materials). Diese Maschine ist für klinische Anwendungen optimiert und spiegelt somit die reale klinische Praxis wider. Unterschiedliche Maschinen können eine unterschiedliche Einrichtung erfordern und auch eine Optimierung der Dosierung erfordern, da sich die effiziente Dosierung von der gewählten unterscheiden kann.

1. Nehmen Sie die Platten aus dem 37 °C-Inkubator und setzen Sie die Deckel wieder auf jede Platte auf den Dichtungen. Entfernen Sie nicht die Dichtungen. Nehmen Sie die 0-Gy-Platte bei diesem Vorgang mit, um sicherzustellen, dass die Steuerplatte identischen Bedingungen ausgesetzt wurde.
2. Transportieren Sie die Organoide zum Bestrahlungsgerät. Stellen Sie das Bestrahlungsgerät auf, indem Sie eine Plastikbox mit lauwarmem Leitungswasser füllen und in der Tellerhalterung befestigen, um ein Aufschwimmen der Platte zu verhindern.
3. Tauchen Sie die Platte so in Wasser, dass das Wasser auf einer Höhe mit der Oberseite der Platte ist. Fixieren Sie die Platte mit einem Gerät, das die Platte nicht schweben lässt (wie im Video gezeigt). Verlassen Sie den Raum und bestrahlen Sie die Platten in zunehmender Dosierung (z. B. 1, 2, 4, 6, 8 und 10 Gy). Bestrahlen Sie jeweils nur eine Platte, da ein Stapel von Platten keine gleichmäßige Verteilung der Strahlung ermöglicht.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die geeigneten Bestrahlungsdosen gewählt werden, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu erreichen.
4. Trocknen Sie die Platten nach der Bestrahlung mit Taschentüchern gründlich ab und setzen Sie den harten Deckel wieder auf. Transportieren Sie die Platten zurück in den Kulturraum. Nehmen Sie den harten Deckel ab und wischen Sie das Äußere jeder Platte mit leicht besprühten EtOH-Tüchern ab. Entfernen Sie nicht die atmungsaktiven Dichtungen.
5. Legen Sie die Platten in den hinteren Teil des Inkubators, um Temperaturschwankungen durch das Öffnen der Tür zu vermeiden. Stapeln Sie die Platten nicht.

7. Tag 2. Optional: CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay (CTG) Messplatte T=0 (erforderlich für GR-Analyse)

1. Wenn Sie GR-Metriken berechnen möchten (siehe 11.3.5 und Diskussion), messen Sie die CTG-Werte in der T=0-Platte, indem Sie die Schritte 9.1-10.4 befolgen.

8. Einen Tag vor dem Auslesen des Drogenscreenings: Vorbereitung

1. Berechnen Sie das Gesamtvolumen des erforderlichen CTG. Für eine 384-Well-Platte verwenden Sie 40 μl CTG pro Well (fügen Sie CTG 1:1 gemäß der Empfehlung des Herstellers hinzu). Berücksichtigen Sie das Totvolumen für die Mehrtropfendosierung (1 mL pro Röhrchen). CTG über Nacht bei 4 °C lichtgeschützt auftauen.
2. Testen Sie, ob der Spender kalibriert werden muss.

9. Tag 7 (Bereich: Tage 7 - 14): Auslesung des Wirkstoffscreenings: CTG-Assay

1. Lassen Sie das CTG Raumtemperatur erreichen. Überprüfen Sie vor dem Auslesen alle Vertiefungen der 384-Well-Platte visuell und notieren Sie, ob Infektionen aufgetreten sind.
2. Bilden Sie die relevanten Vertiefungen unter einem Hellfeldmikroskop ab. Dazu gehören Positivkontrollen (Staurosporin), Negativkontrollen (Normalisierungsvertiefungen) und die höchste Konzentration jedes Arzneimittels.
3. Waschen und grundieren Sie die Multidrop-Maschine gemäß den in Abschnitt 4.4 beschriebenen Schritten. Geben Sie je nach Plattenaufbau 40 μl CTG in jede Vertiefung. Mit dem Plattenschüttler des Multidrop-Dispensers (Shake) 5 min schütteln und bei Raumtemperatur und Lichtschutz 25 min inkubieren.
   HINWEIS: Die CTG-Reaktion ist eine enzymatische Reaktion und wird daher von der Temperatur und der Inkubationszeit beeinflusst. Das Signal ist angeblich 30-60 min lang stabil; Die Verwendung der gleichen Inkubationszeit für alle Platten, insbesondere bei der Berechnung von GR-Metriken, erhöht jedoch die Genauigkeit.

10. CTG-Biolumineszenz-Messungen

1. Schalten Sie den Biolumineszenzplatten-Reader mit einer Kapazität von 384 Well und den Computer ein. Hier kam ein Spark Plate Reader zum Einsatz.
2. Öffnen Sie die Spark-Methodeneditor-Software (siehe Materialtabelle). Wählen Sie das Plattenformat: COS384fb-Corning 384 flach schwarz | kein Deckel | keine Feuchtigkeitskassette; Wählen Sie die Vertiefungen aus, die gemessen werden sollen.
3. Wählen Sie im Menü unten links Erkennung | Lumineszenz und ziehen Sie unter die Platte. Typ: Dämpfung, zweites Menü: keine. Stellen Sie die Integrationszeit [ms] ein: 500.
4. Platzieren Sie die Platte, wählen Sie sie aus und führen Sie die Methode aus, indem Sie auf Start klicken. Speichern Sie die exportierte Tabelle.

11. Datenanalyse

1. Berechnen Sie den Z-Faktor (Z'), um die Bildschirmqualität zu bewerten.
   1. Berechnen Sie den Durchschnitt (Av) und die Standardabweichungen (SDs) sowohl der negativen (Strg^neg, z. B. DMSO) als auch der positiven (Strg^pos, z. B. Staurosporin) Kontrollen.
   2. Berechnen Sie den Z-Faktor = 1 - (3 × SD[Ctnl^neg] + 3 × SD[Ctrl^pos]/mean[Ctrl^neg] -mean[Ctrl^pos]).
      ANMERKUNG: Z' drückt die Variation innerhalb und den ratiometrischen Raum zwischen der Positiv- und der Negativkontrolle aus und ist daher ein Maß für den Dynamikbereich des Assays¹³. Ergebnisse von Wirkstoffscreenings mit einem Z' von weniger als 0,3 ausschließen; Es wird empfohlen, Daten mit einem Z'-> 0,5 zu verwenden. Der durchschnittliche Z' variiert im Allgemeinen zwischen 0,5 und 0,7 (abhängig von den verwendeten Organoidmodellen). Damit das Z' aussagekräftig ist, sollten alle Organoide in den positiven Kontrollvertiefungen abgestorben sein.
2. Berechnen Sie die relative Organoid-Lebensfähigkeit für jede Vertiefung, indem Sie Strg^neg auf 100 % und Strg^pos auf 0 % Lebensfähigkeit setzen.
   1. Verwenden Sie diese Formel, um die Lebensfähigkeit von Organoiden zu berechnen.
      Lebensfähigkeit von Organoiden = 100 % × (experimenteller Well-Wert - Av Ctrl^pos) / (Av Ctrl^neg - Av Ctrl^pos)
      1. Berechnen Sie für bestrahlte Organoide den Prozentwert.
         Prozentuale Lebensfähigkeit von Organoiden = 100 % × (experimenteller Well-Wert von x GY) / (Av Ctrl^neg Well-Wert von 0 GY)
   2. Visualisieren Sie die Daten in einem Datenanalyse-Softwareprogramm, indem Sie die Viabilitätsdaten in eine XY-Tabelle kopieren und die entsprechende Anzahl von Replikationswerten pro Konzentration auswählen.
   3. Transformieren Sie bei logarithmischen Arzneimittelkonzentrationen die Arzneimittelkonzentrationen, und kopieren Sie diese Werte in die erste Spalte der Tabelle.
   4. Um das Diagramm zu formatieren, wählen Sie den Diagrammtyp (XY) aus, wählen Sie den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus, und legen Sie den Ursprung auf die untere linke Seite fest.
3. Bestimmen Sie den relativen IC₅₀, die Fläche unter der Kurve (AUC) und die GR-Metriken.
   1. Wählen Sie für die nichtlineare Regression auf der Registerkarte Analysieren die Option Kurve mit nichtlinearer Regression anpassen aus. Wählen Sie die Option log (inhibitor) vs. normalized response - variable slope , um eine Kill-Kurve zu erstellen.
   2. Klicken Sie auf die Registerkarte Ergebnisse , um den relativen IC₅₀ für jedes Medikament anzuzeigen.
      HINWEIS: Dies ist die Konzentration des Arzneimittels, die auf halbem Weg zwischen dem unteren und oberen Rand der Kurve reagiert. Die untere und obere Seite sind Plateaus in den Einheiten der y-Achse.
   3. Wählen Sie für den Bereich unter der Kurve (AUC) auf der Registerkarte Analysieren die Option Bereich unter Kurve aus, verwenden Sie die vordefinierten Einstellungen, und wählen Sie OK aus.
   4. Klicken Sie auf die Registerkarte Ergebnisse , um die AUC (Gesamtfläche) für jedes Medikament anzuzeigen.
      HINWEIS: Die AUC ist eine integrierte Messung einer messbaren Wirkung, die als kumulative Messung einer Arzneimittelwirkung verwendet wird. Bei einigen Molekülen, wie z. B. Antikörpern, ist die Dosis-Wirkungs-Kurve nicht sigmoidal geformt, und die IC_50-Werte sind schwer zu interpretieren. In einer solchen Situation können AUC-Werte als Metrik zum Vergleich von Unterschieden zwischen Organoidlinien mehr Informationen liefern.
   5. Wenn CTG-Messungen an Tag 2 durchgeführt werden (optionale Schritte 4.4.5 und Abschnitt 7), berechnen Sie alternativ die GR-Metriken. Analysieren Sie die GR-Metriken mit einem Online-GR-Rechner¹⁴ unter Berücksichtigung der Unterschiede in der Proliferationsrate zwischen Organoidmodellen während eines Wirkstoffscreenings, um reproduzierbarere und empfindlichere Messungen zu gewährleisten.

Ergebnisse

Ziel dieses Experiments war es, die Sensitivität von HNSCC-Organoiden gegenüber Chemo- und Strahlentherapie als Einzelwirkstoffe zu untersuchen. Wir testeten auch die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, indem wir das Experiment mehrmals im Abstand von einer Woche durchführten, was zu mehreren biologischen Replikaten führte (Experimente 1-3) (Abbildung 2). Gemäß dem Protokoll wurden an Tag 0 HNSCC-PDOs aus 6 Vertiefungen einer 6-Well-Platte entnommen und enzymatisch und mechanisch auf Einzelze...

Diskussion

In diesem Artikel und Video wird beschrieben, wie Sie mit PDOs ein Wirkstoffscreening mit mittlerem Durchsatz durchführen. Dieses Protokoll kann mit Optimierung übernommen werden, um Organoide zu screenen, die aus anderen Gewebetypen als den hier beschriebenen stammen. Die Bestimmung des idealen Passagezeitrahmens vor dem Screening ist wichtig, da dieser für einzelne Organoidkulturen unterschiedlich ist und vom Gewebetyp abhängt. Die Dichte und Größe der Organoide, die pro Vertiefung aus...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Erforderliche Ausrüstung
384-Well-Biolumineszenz-Plattenleser; z. B. Tecan Spark 10M Plattenleser	Tecan
Hellfeldmikroskop mit großem Sichtfeldobjektiv (2,5x)
Digitaler Dispenser, z. B. Tecan D300e	Tecan		Drug Dispensing
6 MV Photonenstrahlbestrahlung	Elekta Modell Synergy, Elekta Schweden
Liquid Handler mit großer Düse (" Standardrohr") kassetten;
z.B. Multidrop Combi Reagenzienspender	Thermo Scientific
Kunststoffbehälter mit Plattenhaltereinsatz für	die Strahlentherapie Hausgemachte
Software
Standard-Gewebekultivierungsgeräte (LAF-Schrank, Inkubator, Zentrifuge, Wasserbad usw.)
Erforderliche Materialien
15- und 50-ml-Kunststoffröhrchen
5-, 10- und 25-ml-Sterilpipetten
6-Well-Zellkulturplatten
Schwarze 384-Well-Platte mit ultra-niedrigem Anhaftungsgrad und klarem Boden, z. B. Corning 384 flach schwarz	Corning	4588
Breathe-Easy  Dichtungsmembran	Merck		vorgestanzte Polyurethan-Membran in medizinischer Qualität mit Acrylkleber
Glasobjektträger			10-Kammer-Objektträger mit Hämozytometergitter
Multidrop Kombi-Reagenzienspender Standard-Röhrchendosierkassette	Thermo Scientific
Plugged Pasteur Pipette, deren Spitze in einer Flamme
Reversible 20/40/70/100 µ m Filter: PluriStrainer	Pluriselect	z.B. 43-50020-03
Sterile P1000, P200, P20 und P2 Pipettenspitzen und Low-Retention Filterspitzen ( z.B. Saphirspitzen)	Greiner	750266
T8 Plus und D4 Plus Casetten	HP/Tecan
Benötigte Reagenzien
100 x Glutamax			L-Glutamin Ersatz
1 M HEPES
30 % (v/v) Tween-20 verdünnt in PBS
70 % EtOH
Advanced-DMEM/F12	Thermo Scientific	12634-010
CellTiter-Glo 3D-Zellviabilitätsassay	Promega	G9681
Verbindungen zum Testscreen, einschließlich Staurosporin oder andere Positivkontrollen
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DMSO
ECM für CRC: Wachstumsfaktor-reduziertes Matrigel, phenolfreies	Corning	356231
ECM für HNSCC PDOs: BME, Cultrex RGF Basalmembranextrakt, Typ R1	R& D Systems	3433-005-R1
Expansionswachstumsmedium (spezifisch für jeden Organoidtyp)
Organoide Wachstumsfaktoren (spezifisch für jeden Organoidtyp)
PBS
Pen/Strep (100 U/ml)
ROCK-Inhibitor: Y-27632	Abmol	M1817
TrypLE
Erforderliche Softwarepakete:
GraphPad Prism
Microsoft Excel