Methodenartikel

Analyse der SAMHD1-Restriktion durch Durchflusszytometrie in humanen myeloischen U937-Zellen

DOI:

10.3791/62502

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13. Juni 2021

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1Retrovirus-Host Interactions Laboratory, The Francis Crick Institute, 2Retroviral Replication Laboratory, The Francis Crick Institute, 3Sidney Sussex College, Department of Medicine, University of Cambridge

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier wird eine etablierte Methode beschrieben, um das Ausmaß der HIV-1-Restriktion durch das zelluläre hemmende Protein SAMHD1 zu bestimmen. Humane myeloische U937-Zellen werden mit einem SAMHD1-Expressionsvektor transduziert, der YFP co-exprimiert, differenziert und dann mit HIV-RFP herausgefordert wird. Der Grad der Einschränkung wird durch Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt.

Zusammenfassung

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Steriles α-Motiv/Histidin-Aspartat-Domänen-enthaltendes Protein 1 (SAMHD1) hemmt die Replikation von HIV-1 in ruhenden myeloischen Zellen. U937-Zellen werden aufgrund einer geringen SAMHD1-RNA-Expression häufig als praktisches Zellsystem zur Analyse der SAMHD1-Aktivität verwendet, was zu einer nicht nachweisbaren endogenen Proteinexpression führt. Basierend auf ähnlichen Assays, die im Stoye-Labor zur Charakterisierung anderer retroviraler Restriktionsfaktoren entwickelt wurden, entwickelte das Bishop-Labor einen zweifarbigen Restriktionsassay zur Analyse von SAMHD1 in U937-Zellen. Murine Leukämie Virus-ähnliche Partikel, die SAMHD1 exprimieren, werden zusammen mit YFP, das von einem IRES exprimiert wird, verwendet, um U937-Zellen zu transduzieren. Die Zellen werden dann mit Phorbolmyristatacetat behandelt, um eine Differenzierung zu einem ruhenden Phänotyp zu induzieren. Nach der Differenzierung werden Zellen mit HIV-1-Virus-ähnlichen Partikeln infiziert, die einen fluoreszierenden Reporter exprimieren. Nach 48 h werden die Zellen geerntet und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Der Anteil der HIV-infizierten Zellen in der SAMHD1-exprimierenden Population wird mit dem in internen Kontrollzellen verglichen, denen SAMHD1 fehlt. Dieser Vergleich zeigt ein Restriktionsverhältnis. Die SAMHD1-Expression führt zu einer fünffachen Reduktion der HIV-Infektion, was einem Restriktionsverhältnis von 0,2 entspricht. Unsere jüngste Substitution von RFP durch das ursprüngliche GFP als Reportergen für HIV-Infektionen hat die Durchflusszytometrie-Analyse erleichtert.

Dieser Assay wurde erfolgreich verwendet, um die Wirkung von Aminosäuresubstitutionen auf die SAMHD1-Restriktion zu charakterisieren, indem mit Viren transformiert wurde, die für veränderte SAMHD1-Proteine kodieren, die aus der ortsgerichteten Mutagenese des Expressionsvektors abgeleitet wurden. Zum Beispiel zeigen die katalytischen Stellensubstitutionen HD206-7AA einen Restriktionsphänotyp von 1, was auf einen Verlust der Restriktionsaktivität hinweist. Ebenso kann die Anfälligkeit verschiedener Testerviren bestimmt werden. Der Assay kann weiter angepasst werden, um die Wirkung von Differenzierungsstatus, metabolischem Status und SAMHD1-Modifikatoren zu berücksichtigen, um die Beziehung zwischen SAMHD1, Zellstoffwechselzustand und viraler Restriktion besser zu verstehen.

Einleitung

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Steriles α-Motiv/Histidin-Aspartat-Domänen-enthaltendes Protein 1 (SAMHD1) behindert die Replikation des Humanen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) in ruhenden Zellen der myeloischen Linie. SAMHD1 blockiert die Replikation durch seine enzymatische Aktivität als dNTP-Triphosphohydrolase, was zu verminderten intrazellulären dNTPs führt. Infolgedessen kann HIV-1 den Prozess der reversen Transkription nicht effizient durchführen. In den wenigen Jahren seit dieser ersten Beobachtung wurden große Fortschritte erzielt, insbesondere in Bezug auf den Beitrag bestimmter Domänen und Aminosäuren zur antiviralen Aktivität von SAMHD1. Diese Erkenntnisse wurden mit biochemischen Assays sowie Zellsystemen gewonnen, die die physiologisch relevante ruhende myeloische Umgebung nachahmen. U937-Zellen1 werden häufig als praktisches myeloisches Zellsystem zur Analyse der SAMHD1-Aktivität verwendet. Dies ist auf einen Mangel an endogener SAMHD1-Expression zurückzuführen, von dem angenommen wird, dass er auf niedrige RNA-Spiegel im Vergleich zu SAMHD1-exprimierenden Zellen zurückzuführen ist (ein Bereich der laufenden Forschung). Hier beschreibt das Protokoll die transiente Transduktion von U937-Zellen mit virusähnlichen Partikeln, die SAMHD1 co-exprimieren, und einem Yellow Fluorescent Protein (YFP)-Reporter, um den Mechanismus der SAMHD1-Restriktion von HIV-1 zu untersuchen. Solche transienten zweifarbigen Durchflusszytometrie-Assays zur Untersuchung retroviraler Restriktionen wurden zuerst im Stoye-Labor2 entwickelt und seitdem angepasst, um andere Restriktionsfaktoren zu untersuchen, einschließlich der Tripartite Motif (TRIM) Proteine3. Inspiriert von diesen Assays entwickelte das Bishop-Labor einen zweifarbigen Assay zur Analyse der SAMHD1-Restriktion in U937-Zellen.

Der Workflow für das Experiment ist in Abbildung 1 dargestellt. Murine Leukämie Virus (MLV)-ähnliche Partikel, die eine bi-cistronische Nachricht enthalten, die SAMHD1 neben YFP kodiert, das von einem IRES exprimiert wird, werden verwendet, um U937-Zellen zu transduzieren. Die Zellen werden dann mit Phorbolmyristatacetat (PMA) behandelt, um eine Differenzierung zu einem ruhenden Phänotyp zu induzieren. Als nächstes werden Zellen mit HIV-1-Virus-ähnlichen Partikeln infiziert, die rotes fluoreszierendes Protein (RFP) exprimieren. Nach 48 h werden die Zellen geerntet und mittels Zweifarben-Durchflusszytometrie analysiert. Dieser Assay wird auch mit YFP und grün fluoreszierendem Protein (GFP) verwendet, wodurch weniger Standardfilterkombinationen für die Durchflusszytometrie-Analyse erforderlich sind. Die Verwendung von HIV-RFP ermöglicht eine einfachere Kompensation und somit ist der Assay für weniger erfahrene Durchflusszytometrie-Benutzer leichter zugänglich und mit den meisten Zytometern erreichbar.

Während der Analyse wird der Anteil der HIV-infizierten Zellen zwischen SAMHD1-exprimierenden Zellen und solchen, denen SAMHD1 fehlt, innerhalb derselben Zellquelle verglichen. Dies ermöglicht eine interne Kontrolle im Bohrloch-/Durchflusszytometrieröhrchen, was ein Schlüsselmerkmal ist. Der Vergleich der Infektionsraten in transduzierten und nicht transduzierten Zellen zeigt ein Restriktionsverhältnis. Ein Verhältnis von 1,0 zeigt an, dass der transduzierte Faktor keinen Einfluss auf die Infektiosität hat. Die Wildtyp-SAMHD1-Expression führt in diesem Test zu einer fünffachen Reduktion der HIV-Infektion, was einem Restriktionsverhältnis von 0,2 entspricht. Obwohl dieser Effekt im Vergleich zu klassischeren Restriktionsfaktoren wie TRIM5 bescheiden ist, ist der Effekt dennoch reproduzierbar und ermöglicht die Klassifizierung modifizierter SAMHD1-Expressionoren in solche, die sich in äquivalenter Weise auf das Wildtyp-Protein beschränken, solche, die nicht einschränken, und solche mit einem intermediären Phänotyp.

Dieser Assay wurde erfolgreich verwendet, um die Restriktionsphänotypen der SAMHD1-Domäne und der Aminosäuremutanten zu charakterisieren, indem er mit Viren transduzierte, die mutierte SAMHD1-Sequenzen kodieren. Zum Beispiel können die katalytischen Site-Substitutionen HD206-7AA in diesem Assay nicht eingeschränkt werden. Ebenso kann die Anfälligkeit verschiedener Testerviren bestimmt werden. Zum Beispiel sind HIV-1-Reverse-Transkriptase-Mutanten anfälliger für SAMHD1-vermittelte Restriktion (z. B. 151V4). Dieses Protokoll beschreibt die Details der Produktion von virusähnlichen Partikeln (VLP), die Transduktion von U937 mit SAMHD1-Expressionsvektoren, die Infektion mit HIV mit einem fluoreszierenden Reporter und die anschließende Analyse mittels Durchflusszytometrie. In diesem Artikel wird erläutert, welche Daten zu erwarten sind und wie suboptimale Ergebnisse vermieden werden können. Schließlich werden alternative Anwendungen für den Assay skizziert, zusätzlich zur Untersuchung verschiedener SAMHD1-Varianten, um das Zusammenspiel zwischen SAMHD1, dNTP-Spiegeln und Virusinfektion gründlicher zu verstehen. Angesichts der Rolle von SAMHD1 im Zentrum des Zellstoffwechsels mit zusätzlichen Verbindungen zu Krebs ist dies weiterhin ein Bereich von intensivem Interesse.

Protokoll

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Dieses Protokoll enthält keine Studien mit Tieren oder menschlichen Teilnehmern, die von einem der Autoren durchgeführt wurden. Alle Schritte dieses Protokolls wurden nach den Richtlinien und Verhaltenskodizes der Organe durchgeführt, in denen sie durchgeführt wurden.

1. Transfektion von 293T-Zellen für die VLP-Produktion (sowohl SAMHD1-Expressionsvektoren als auch Tester-HIV-Partikel)

HINWEIS: Die wichtigsten Beiträge zur erfolgreichen Produktion von Viruspartikeln sind die Gesundheit der produzierenden 293T-Zellen, der Zusammenfluss bei der Transfektion und der Zeitpunkt der Ernte. Laboratorien haben in der Regel ihre bevorzugten Transfektionsreagenzien und Protokolle für die retrovirale Partikelproduktion. Das folgende Protokoll liefert infektiöse Partikel von guter Qualität, aber gleichwertige Protokolle wären auch für diese Anwendung geeignet. Um eine gute Qualität der 293T-Zellen zu erhalten, mindestens dreimal pro Woche durchgehen, um eine konstante Wachstumsrate aufrechtzuerhalten. Die Zellen sollten in der logarithmischen Wachstumsphase für eine effiziente Transfektion ausgesät werden.

  1. Tag 1: Säen Sie die erforderliche Anzahl von 10 cm Schalen mit einem 1/4 Split von einer nahezu konfluenten Schale von 293T-Zellen, um am nächsten Tag etwa 60% Konfluenz zu erhalten (ca. 5 x 105 Zellen / ml). Möglicherweise müssen mehrere Dichten ausgesät werden, um eine geeignete Dichte für die Transfektion am nächsten Tag zu erreichen, wenn mit einem neuen Zellbestand gearbeitet wird.
  2. Tag 2 (morgens): Überprüfen Sie die Konfluenz von etwa 60% durch Mikroskopie und ersetzen Sie die Medien auf den Zellen vorsichtig durch 10 ml frisches Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
  3. Tag 2 (nachmittags, mindestens 4 h nach Medienwechsel): Transfect für die VLP-Produktion.
    1. Die DNA-Verdünnungsmischung enthält jeweils 3 μg Gag-Pol-Expressorplasmid, Long-terminal repeat (LTR)-getriebenes Reporterplasmid und Vesicular Stomatitis Virus G protein ( VSV-G ) Expressorplasmid (insgesamt 9 μg, siehe HINWEIS) in 600 μL serumfreiem DMEM. Wirbel und kurz zentrifugieren (15 s, >500 x g).
    2. 20 μL Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle), Wirbel (nicht zentrifugieren) zugeben und bei 20 °C für 15-20 min inkubieren. Fügen Sie die Transfektionsmischung tropfenweise auf die Platte hinzu, schwenken Sie sie vorsichtig, um zu mischen, und kehren Sie zum Inkubator zurück.
      HINWEIS: Für MLV-VLP, das SAMHD1 exprimiert, verwenden Sie KB4 5,6 (Gag-Pol-Expressor-Plasmid), pLGatewaySAMHD1IeYFP1 (LTR-gesteuertes Reporterplasmid) und pczVSV-G7. Verwenden Sie für HIV-RFP VLP p8.91 8,9 (Gag-Pol-Expressorplasmid), SCRPSY10 (LTR-gesteuertes Reporterplasmid) und pczVSV-G. Alternativen werden im Materialverzeichnis erläutert. Plasmidverhältnisse müssen möglicherweise für verschiedene Plasmid-/Transfektionssysteme optimiert werden.
  4. Tag 3 (später Vormittag): Entfernen Sie die Medien vorsichtig durch Pipettieren aus den Zellen, waschen Sie sie mit 5 ml frischem DMEM und ersetzen Sie sie durch 5 ml frisches DMEM.
  5. Tag 4 (morgens): Ernten Sie das Virus, indem Sie den Überstand aus den Zellen sammeln und durch 5 ml frisches DMEM ersetzen. Den VLP-haltigen Überstand durch einen 0,45-nm-Filter leiten, aliquot machen und zur Lagerung auf -70 °C überführen. Stellen Sie sicher, dass die Aliquots eine Größe haben, die für geplante Experimente geeignet ist (250 μL als Vorschlag), da wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen zu einem Verlust des Virustiters führen.
  6. Tag 5 (morgens): Ernten Sie das Virus wie in 1.5, aber werfen Sie die Platten nach dem Sammeln des Überstands weg.

2. Titern des neuen VLP vor der Verwendung

  1. Tag 1: Saat 293T bei 2 x 105 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte - 4 Vertiefungen pro zu titrierendem Virus, einschließlich eines Virus bekannter Infektiosität für jedes Rückgrat. Optimieren Sie die Aussaatdichte für einen bestimmten Zellbestand.
  2. Tag 2: Beobachten Sie die Platte, um den Zusammenfluss zu überprüfen (idealerweise ~70%). Tauen Sie den virushaltigen Überstand aus den Schritten 1.5 und 1.6 auf. Geben Sie 0, 10, 25 oder 100 μL in jede Vertiefung.
  3. Tag 4 (Morgen): Entnahme der Zellen zur Analyse durch Durchflusszytometrie.
    1. Entfernen Sie das Medium durch vorsichtiges Pipettieren oder Absaugen. Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 250 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entfernen Sie die Zellen von der Platte, indem Sie mit 250 μL PBS auf und ab pipettieren, und übertragen Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen. 250 μL 4% Paraformaldehyd zugeben (Endkonzentration auf 2%).
      ACHTUNG: Paraformaldehyd ist giftig. Es sollte nicht mit Desinfektionsmitteln auf Chlorbasis gemischt werden.
    2. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μL PBS oder einem alternativen Durchflusszytometriepuffer. Analysieren Sie nach Bedarf auf RFP oder YFP durch Durchflusszytometrie. Normalisieren Sie die Infektiosität eines bestimmten Virusbestands anhand der Werte für einen Bestand bekannter Infektiosität.
      HINWEIS: VLP kann auch durch p24-Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) normalisiert werden; Dies ist jedoch nicht unbedingt ein guter Indikator für die VLP-Infektiosität, insbesondere wenn VLP-Bestände in verschiedenen Transfektionen hergestellt werden. Veröffentlichte mediane Gewebekultur-Infektionsdosis oder Multiplizität der Infektion (TCID50/MOI)Methoden 11 können ebenfalls eine relative Quantifizierung liefern, obwohl diese für MLV nicht gut etabliert sind. Die relative Fluoreszenz bietet eine kostengünstige Alternative zu kommerziellen reversen Transkriptase-ELISA-Methoden.

3. Transduktion von U937 mit VLP exprimierend SAMHD1 und YFP

HINWEIS: Die Schritte 3-6 stellen das Restriktionsexperiment dar. Die Tage sind gezählt, um die Planung zu erleichtern.

  1. Tag 1 (nachmittags): Auftauen von VLP für die Transduktion einschließlich MLV-Wild-Typ SAMHD1-YFP (Positivkontrolle), MLV-SAMHD1(HD206-7AA)-YFP (Negativkontrolle) und Variante MLV-SAMHD1-YFP (experimentelle Proben). Verdünnen Sie das normalisierte VLP auf ein Endvolumen von 500 μL mit Roswell Park Memorial Institute 1640 Medien (RPMI) in einem Mikrofugenröhrchen, fügen Sie 0,5 μL Polybren (10 mg / ml) hinzu und mischen Sie durch Streichen.
    1. Wenn VLP vorher nicht titriert werden kann, verwenden Sie zunächst 100 μL. Verwenden Sie ein maximales Verhältnis von 1:1 von VLP zu RPMI, um die VLP-induzierte Toxizität zu begrenzen. Streben Sie eine Transduktion von ca. 30% an.
  2. Aliquot 5 x 105 U937 Zellen in ein steriles Mikrofugenröhrchen für jede Transduktionsbedingung. Pellet durch Zentrifugieren bei 500 x g für 5 min und Entfernen des Überstands (fügen Sie zwei zusätzliche Röhrchen als nicht transduzierte Kontrollen für die Durchflusszytometrie hinzu). Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μL verdünntem VLP (oder RPMI für nicht transduzierte Kontrollen) und geben Sie es in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte.
  3. Spinokule in einer Tischzentrifuge bei 800 x g für 90 min bei 20 °C. 1 ml 37 °C RPMI in die Vertiefung geben und 3 Tage in einem 37 °C Inkubator erholen lassen.

4. Differenzierung von transduziertem U937

  1. Tag 4 (morgens): Resuspendieren Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren und übertragen Sie 350 μL in jede der 4 Vertiefungen einer 12-Well-Platte. 700 μL 37 °C RPMI mit 150 nM PMA in jede Vertiefung geben, was eine Endkonzentration von 100 nM ergibt und 3 Tage lang differenzieren lässt.
    HINWEIS: PMA wird als Pulver gekauft und sollte in DMSO auf 1 mM resuspendiert und im Dunkeln gelagert werden. Ein Arbeitsmaterial von 100 μM sollte durch Verdünnen von 1/10 aus dem 1 mM Bestand mit DMSO hergestellt werden.

5. Infektion von differenziertem, SAMHD1-exprimierendem U937 mit HIV-RFP

  1. Tag 7: Beobachten Sie die Zellen durch Mikroskopie. Stellen Sie sicher, dass die Zellen anhaften. Saugen Sie die Medien aus allen Vertiefungen ab, fügen Sie 1 ml RPMI zu 1 von jedem Satz von 4 hinzu, um eine nicht transduzierte, nicht infizierte Steuerung sowie einfarbige Kontrollen zu ermöglichen. Fügen Sie 0,5 ml RPMI mit etwa 10 μL HIV-1-RFP (ca. 10 ng p24 als Richtwert) zu allen anderen Vertiefungen hinzu. Streben Sie eine Infektion von etwa 50% an.
  2. Tag 8 (morgens): Fügen Sie 0,5 ml RPMI zu jedem der infizierten Vertiefungen hinzu.

6. Durchflusszytometrische Analyse

HINWEIS: Es empfiehlt sich, einen lebenden toten Fleck in Durchflusszytometrie-Pipelines aufzunehmen. Wenn die U937-Zellen jedoch von guter Qualität sind, kann dieser Schritt ohne negative Folgen für die nachgeschaltete Analyse entfallen. Das sanfte Pipettieren von trypsinisierten Zellen sollte leicht zu einer Einzelzellsuspension führen.

  1. Tag 10 (morgens): Absaugen Sie die Medien aus den Brunnen und waschen Sie einmal mit PBS. Fügen Sie 300 μL Zelldissoziationsenzym (oder Trypsin) für 5-10 min hinzu. Fügen Sie weitere 300 μL PBS hinzu, resuspendieren Sie gründlich, stellen Sie sicher, dass sich alle Zellen von der Platte gelöst haben, und übertragen Sie sie in Durchflusszytometrieröhrchen.
  2. Fügen Sie 300 μL 4% Paraformaldehyd hinzu (wobei die Endkonzentration auf 2% erhöht wird). Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μL PBS oder einem alternativen Durchflusszytometriepuffer. Analyse mittels Durchflusszytometrie.
    HINWEIS: Die folgenden Schritte gelten für einen Fortessa-Analysator, aber eine gleichwertige Analyse kann mit jedem Analysator erreicht werden, der RFP- und YFP-Fluoreszenz lesen kann. Konsultieren Sie den lokalen Durchflusszytometrie-Support oder einen anderen erfahrenen Forscher, bevor Sie eine Durchflusszytometrie-Analyse einrichten. Wenn viele Proben gleichzeitig gesiebt werden müssen, kann ein Hochdurchsatz-Probenehmer geeignet sein. In diesem Fall wird eine größere Zellzahl und ein größeres Volumen empfohlen.

7. Durchflusszytometrie-Analyse

  1. Schalten Sie das Zytometer 10 Minuten vor Bedarf ein und schalten Sie den Computer ein. Überprüfen Sie, ob der Abfall leer und der Manteltank voll ist.
  2. Melden Sie sich am Computer an und öffnen Sie die Analysesoftware.
  3. Bewegen Sie den Arm zur Seite, nehmen Sie den Wasserschlauch ab, stellen Sie die Durchflussrate auf Hoch und drücken Sie Prime. Warten Sie, bis das Licht erlischt, und wiederholen Sie den Vorgang noch drei weitere Male.
  4. Stellen Sie das Wasser wieder auf und laufen Sie 3 Minuten lang hoch und wechseln Sie dann zu Niedrig und drücken Sie Standby , bis Sie mit der Erfassung fortfahren.
  5. In der Zwischenzeit richten Sie das Experiment innerhalb der Software ein:
    1. Wählen Sie Experiment / Neues Experiment (Name gemäß lokaler Anleitung). Löschen Sie im Inspektor die nicht benötigten Fluorochrome, und lassen Sie Blue Laser 530/30 und Yellow Laser 610/20 oder die empfohlenen Laser- und Filterkombinationen für YFP und RFP für die Maschine übrig.
    2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Experiment und wählen Sie Zytometereinstellungen/Anwendungseinstellungen/Arbeitsblatt erstellen. Erstellen Sie auf dem Arbeitsblatt einen Vorwärtsstreubereich (FSC-A)/Seitenstreubereich (FSC-A) Punktblot und YFP-Histogramm, RFP-Histogramm und GFP/YFP-Punktblot, indem Sie auf das entsprechende Symbol klicken und die Achsen durch Klicken auf die Achsenbeschriftung ändern.
    3. Klicken Sie erneut mit der rechten Maustaste auf Experiment und fügen Sie Neues Exemplar hinzu. Benennen Sie sie ggf. um. Öffnen Sie die Probe, indem Sie auf das Pluszeichen klicken, um ein neues Röhrchen anzuzeigen.
  6. Öffnen Sie das Erfassungs-Dashboard in der Ansicht, laden Sie das nicht infizierte, nicht übertragene Steuerelement und drücken Sie Erfassen. Passen Sie die FSC- und SSC-Spannungen im Dashboard an, um Zellen im unteren linken Quadranten zu positionieren (keine Zellen auf den Achsen). Tor um diese Bevölkerung P1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf andere Diagramme und wählen Sie P1 anzeigen, um Ablagerungen aus der nachfolgenden Analyse zu entfernen.
  7. Laden Sie das einfarbige Steuerelement für YFP (nur Wildtyp-SAMHD1) und erwerben Sie. Stellen Sie die YFP-Spannung im Armaturenbrett so ein, dass sich die meisten fluoreszierenden Zellen im Bereich des Detektors befinden (nicht am Rand der Achse). Wiederholen Sie diesen Vorgang für die einfarbige RFP-Steuerung.
  8. Führen Sie eine automatische Kompensation mit den nicht transduzierten, nicht infizierten und einfarbigen Steuerelementen durch.
    1. Wählen Sie im Menü Experiment > Kompensationseinrichtung > Kompensationssteuerelemente erstellen aus, um zu einem normalen Arbeitsblatt zu wechseln. Wählen Sie das ungefärbte normale Arbeitsblatt aus, drücken Sie auf Ausführen und erfassen für das nicht gefärbte Steuerelement.
    2. Zeichnen Sie ein Tor um die intakten Zellen (P1) und zeichnen Sie sie auf. Entfernen Sie den Schlauch und versetzen Sie das Gerät in den Standby-Modus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf P1, klicken Sie auf Auf alle Kompensationskontrollen anwenden.
    3. Wechseln Sie zum normalen RFP-Arbeitsblatt, und drücken Sie Ausführen. Notieren Sie die einfarbige RFP-Steuerung und versetzen Sie das Gerät in den Standby-Modus. Die Software sollte automatisch die positive Population auswählen.
    4. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die YFP-Einzelfarbsteuerung. Wählen Sie Experiment > Kompensationseinrichtung > Kompensation berechnen > verknüpfen und speichern.
  9. Wechseln Sie zum globalen Arbeitsblatt. Erwerben Sie die mit dem Wildtyp SAMHD1 transduzierten Zellen, die mit HIV-RFP infiziert sind, und überprüfen Sie, ob vier verschiedene Populationen in den Ecken der Quadranten zu sehen sind, die vertikal bzw. horizontal für YFP bzw. RFP ausgerichtet sind. Entfernen Sie den Schlauch, und drücken Sie Standby.
  10. Laden Sie die nicht transduzierte, nicht infizierte Probe neu, drücken Sie Run and Record 30.000 events ( Ausführen und 30.000 Ereignisse aufzeichnen ) mit P1 als Stopp-Gate. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Proben (einschließlich anderer Steuerelemente). Benennen Sie die Beispiele während der Ausführung oder Post-hoc um. Nach dem Export können Dateien nicht mehr umbenannt werden.
  11. Exportieren Sie die Daten als .fcs-Dateien und reinigen Sie die Fluidik gemäß den lokalen Anweisungen.

8. Datenanalyse

HINWEIS: Die folgenden Schritte entsprechen der Analyse in FlowJo v10; Gleichwertige Schritte können jedoch problemlos in anderer Analysesoftware durchgeführt werden.

  1. Öffnen Sie die Software und ziehen Sie alle .fcs-Dateien in das Dashboard. Wählen Sie die Kompensationssteuerelemente aus und ziehen Sie sie in den Unterordner Kompensation. Öffnen Sie die Datei für die nicht transduzierte, nicht infizierte Röhre durch Doppelklick, wodurch der FSC-A/SSC-A-Plot angezeigt wird.
  2. Wählen Sie das Polygonwerkzeug und das Tor für die intakte Zellpopulation aus, ohne Schmutz in der unteren linken Ecke. Nennen Sie diese Zellen. Ziehen Sie dieses Tor auf die gesamte Population von Röhrchen in der Leiste Alle Proben . Scrollen Sie mit den horizontalen Pfeiltasten durch jede einzelne Probe, um sicherzustellen, dass die Ansteuerung für jedes Röhrchen geeignet ist.
  3. Doppelklicken Sie auf die Zellpopulation für die nicht transduzierte, nicht infizierte Probe und passen Sie die Achsen auf FSC-Höhe (H) vs FSC-Fläche (A) an. Wählen Sie die einzelne große Population mit einem rechteckigen Tor aus, um Dubletten auszuschließen. Die Software schlägt automatisch vor, diese einzelnen Zellen zu benennen.
  4. Ziehen Sie dieses Tor auf alle Zellpopulationen , und überprüfen Sie erneut, ob das Gating für alle Proben geeignet ist. Wählen Sie die Einzelzellenpopulation für die nicht infizierte, nicht transduzierte Probe aus, ändern Sie die Achsen in kompensierter blauer Laser (y , YFP) im Vergleich zu kompensiertem gelbem Laser (x, RFP). Drücken Sie T auf der Achse und wählen Sie Biexponentielle Skala für x und y.
  5. Wählen Sie das Quadrant Gating Tool aus und klicken Sie auf das obere rechte Ende der negativen Zellpopulation. Wenden Sie dieses vorläufige Gating auf alle Einzelzellpopulationen an, indem Sie es in die Leiste Alle Proben ziehen. Wenn die Quadrantengatter die Grundgesamtheiten nicht zufriedenstellend trennen, kann es erforderlich sein, einzelne Quadranten mit dem Polygonwerkzeug zu gattern, wie in Abbildung 2 dargestellt.
  6. Scrollen Sie zum Wildtyp-Beispiel SAMHD1 (nur YFP) und überprüfen Sie, ob das Gating zwischen dem nicht transduzierten (YFP negativ) und dem YFP-Positiv korrekt ist. Es kann hilfreich sein, zur Konturansicht zu wechseln, um negative von schwachen YFP-Zellen zu unterscheiden. Wenn die obersten YFP +ve-Zellen weit verteilt sind, passen Sie das obere vertikale Gate nach rechts an.
  7. Scrollen Sie durch alle Proben und überprüfen Sie das Gating in Bezug auf YFP-Positivität. Verwenden Sie die beste Unterteilung zwischen YFP-Negativ und -Positiv, die für alle Proben gültig ist.
    HINWEIS: Die Kompensation wurde basierend auf dem Wildtyp-YFP-Expressionslevel SAMHD1 berechnet. Wenn die Infektionsraten zwischen verschiedenen SAMHD1-YFP-transduzierten Zellen sehr unterschiedlich sind, muss die Kompensation möglicherweise angepasst werden. Es ist daher bevorzugt, dass YFP VLP vor der Verwendung normalisiert werden.
  8. Scrollen Sie zum nicht transduzierten, HIV-RFP-infizierten Röhrchen und überprüfen Sie, ob das Gating zwischen nicht infiziertem RFP-negativ und infiziertem RFP-positiv korrekt ist. Passen Sie die entsprechenden Anpassungen an, indem Sie bei Bedarf die Konturansicht verwenden, und scrollen Sie durch die verbleibenden Proben, um zu überprüfen, ob die Ansteuerung für alle Proben gültig ist.
  9. Jede Probe erfordert doppelt negativ (Q4: unten links, nicht transduziert, nicht infiziert), YFP-positiv (Q1: oben links, SAMHD1-exprimierend, nicht infiziert), RFP-positiv (Q3: unten rechts, nicht transduziert, HIV-infiziert) und doppelt positiv (Q2: oben rechts, SAMHD1 exprimiert HIV-infiziert). Öffnen Sie den Tabelleneditor, indem Sie auf das Symbol klicken und ziehen Sie die vier Quadrantentore in das Dashboard. Wählen Sie Excel-Export und klicken Sie auf Tabelle erstellen. Speichern Sie die generierte Tabelle gemäß den Namenskonventionen für lokale Dateien.
  10. Um Darstellungen von Plots und Gating-Strategien zu exportieren, klicken Sie auf das Symbol Layout-Editor . Wählen Sie jede Population aus und ziehen Sie sie mit den erforderlichen Achsen, Beschriftungen und Abständen in den Editor.
  11. Um ein Layout mit den gleichen Diagrammen zu erstellen, die für alle Proben angezeigt werden, wählen Sie eine Spalte aus und drücken Sie auf Batch. Drücken Sie auf Auf Breite skalieren und dann auf Seitenumbrüche vermeiden. Speichern Sie im gewünschten Dateiformat.
  12. Berechnen Sie in der exportierten Tabelle das Restriktionsverhältnis, indem Sie Spalten mit prozentualen RFP von YFP-ves (RFP+ve / (double negatives + RFP+ve)) und prozentualen RFP von YFP+ves (double positives / (double positives + YFP+ve)) und dann eine letzte Spalte von (%RFP of YFP+ve / %RFP of YFP-ve) generieren, siehe Abbildung 1. Mittelwert der Replikationsdaten für jedes SAMHD1-Konstrukt und berechnen Sie, ob sich die Restriktionswerte für getestete SAMHD1-Varianten signifikant von Wildtyp- und/oder 206-7AA-Varianten unterscheiden, wobei eine geeignete Datenanalysesoftware verwendet wird.

Ergebnisse

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Die Ergebnisse der obigen Analyse sollten ein Restriktionsverhältnis von 0,25 oder niedriger für die Wildtyp-SAMHD1-Positivkontrolle und 1,0 für die Negativkontrolle ergeben. Wenn diese beiden Qualitätskontrollen gültig sind, berücksichtigen Sie die statistische Signifikanz der Ergebnisse. SAMHD1-Varianten, die keinen signifikanten Unterschied zum Wildtyp aufweisen, weisen daher Substitutionen auf, die die SAMHD1-Restriktion in diesem Zusammenhang nicht beeinflussen. Diejenigen, die sich signifikant vom Wildtyp unterscheiden, zeigen eine beeinträchtigte Einschränkung. Wenn sich diese nicht signifikant von der Negativkontrolle unterscheiden, fehlt ihnen in diesem Zusammenhang die Möglichkeit, sie einzuschränken (Abbildung 4 linkes Bild).

Wenn der Wildtyp-SAMHD1-Einschränkungswert größer als 0,3 ist, können die Ergebnisse für Testerviren indikativ sein, aber Sie können sich nicht auf sie verlassen. Eine unwirksame Einschränkung durch Wildtyp-Protein kann sich aus der Verwendung von U937-Zellen ergeben, die zu früh nach der Genesung von der Rekonstitution (innerhalb von 2 Wochen) oder wenn sie zu alt sind (>2-3 Monate). Diese Parameter müssen möglicherweise für einen gegebenen Zellbestand empirisch bestimmt werden. Je niedriger die Passage, desto zuverlässiger differenzieren sich die Zellen und bieten daher die geeignete Umgebung für die SAMHD1-Restriktion. Ein unangemessenes Infektionsniveau mit SAMHD1-YFP oder HIV-RFP kann auch zu Schwierigkeiten bei der Kompensation und der nachgelagerten Bestimmung des Restriktionsverhältnisses führen. Ein Beispiel ist in den rechten Feldern von Abbildung 4 dargestellt.

Wenn die Negativkontrolle von 1,0 abweicht (außerhalb des Bereichs von 0,9-1,2), kann dies auf ein Problem mit der Analyse hinweisen, entweder der Anteil der infizierten Zellen, die Gating-Strategie oder die Gesundheit der Zellen beeinflussen den Assay. Siehe HINWEISE oben.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls. VLP, virusähnliche Partikel, PMA, Phorbolmyristatacetat. Nummerierte Stufen entsprechen Stufen im Protokoll. Abbildung hergestellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 2: Schematische Darstellung retroviraler Plasmide . (A) Verpackungsvektoren (B) Transfervektoren (C) VSV-G Hüllkurvenexpressor. Wichtige Kodierungs- und Regulierungselemente werden gezeigt. Weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle. CMV IE: Cytomegalovirus immediate-early promoter, BGH: bovines Wachstumshormon, pA: polyA, RRE: Rev Response Element, CMV-LTR: zusammengesetzter CMV-HIV-1 LTR-Promotor, Psi: HIV-1 Verpackungssignal, cPPT / CTS: zentraler Polypurintrakt / zentrale Terminierungssequenz, SV40: Affen-Vakuolierungsvirus 40. Abbildung hergestellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 3: Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie-Analyse. (A) Kompensationskontrollen: Das linke Feld zeigt FSC-A/SSC-A-Gating auf intakten Zellen für die nicht transduzierte, nicht infizierte Kontrolle. Das mittlere und rechte Feld zeigt Screenshots von einfarbigen Kompensationssteuerelementen für YFP (Mitte) und RFP (rechts) mit nicht kompensierten Daten in Schwarz und kompensiert in Blau. (B) Entsprechende Kompensationsmatrix und Diagramme für Kompensationskontrollen oben. (C) Gating-Strategie. Trümmer werden durch Analyse aller Zellen durch FSC-A/SSC-A (linkes Bild) eliminiert. Dubletten werden ausgeschlossen, indem sie auf FSC-Höhe versus Fläche (zentrale Platte) geguckt werden. Das rechte Bild zeigt ein Beispiel für eine HIV-1-Restriktion durch Wildtyp-SAMHD1. Die Achsen zeigen kompensierte blaue und gelbe Laserfluoreszenz, die YFP (SAMHD1) bzw. RFP (HIV)-positiven Zellen entsprechen. Quadrantengatter werden durch Vergleich von negativen und einfarbigen Kontrollen für RFP und YFP gezeichnet. Die Zahlen geben den Prozentsatz der Elternpopulation an. Die Kompensationswerte für YFP mit GFP werden viel höher sein, aber es ist möglich, mit geeigneten Filtersätzen zu unterscheiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 4: Erwartete Ergebnisse: ideale versus suboptimale Daten. (A) Repräsentative YFP/RFP-Diagramme für optimale (links) und suboptimale (rechts) Daten. Die Zahlen geben den Prozentsatz der Elternpopulation an. Im rechten Feld ist die HIV-Infektion zu niedrig, was zu Schwierigkeiten bei der Kompensation und dem Gating führt. Die Restriktionsquote ist mit 0,5 höher als erwartet. (B) Diagramme des Restriktionsverhältnisses für Varianten von SAMHD1 in Bezug auf Wildtyp (WT, rot) oder die Negativkontrolle (HD206-7AA, schwarz), die mit Hilfe von Statistiksoftware erzeugt wurden. Jeder Punkt stellt einen Replikationswert dar. Mittelwert und Standardabweichung werden angezeigt. Gepaarte t-Tests zwischen jeder Gruppe waren in allen Fällen, in denen gezeigt wurde, signifikant. Links: Ideale Daten - WT zeigt die erwartete Einschränkung von ca. 0,2, negativ zeigt 1,0. Die Variante R372D (grau) unterscheidet sich signifikant von WT, aber nicht signifikant von der Negativkontrolle und hat somit die Fähigkeit zur Einschränkung verloren. Rechts: Suboptimale Daten. Hier verhält sich das Negativ wie erwartet, aber in allen sechs Replikaten zeigt die WT aufgrund der niedrigen Infektionsrate nur ein Restriktionsverhältnis von 0,5. Die geringe Varianz innerhalb der Gruppen bedeutet, dass R143H einen intermediären Phänotyp aufweist, der sich statistisch von WT und dem negativen unterscheidet, während G209S nicht einschränkt; Dies sollte jedoch bei frischen Zellen wiederholt werden, da die Positivkontrolle nicht die erwartete Restriktionsquote ergeben hat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Diskussion

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Wie in den obigen Anmerkungen erläutert, konzentrieren sich die kritischen Aspekte des Protokolls auf die Beibehaltung des korrekten Zellphänotyps für die VLP-Produktion und auf die Schaffung einer geeigneten Umgebung für die Beobachtung der SAMHD1-Restriktion. Erstens beruht die genaue Analyse der Restriktion durch Zweifarben-Durchflusszytometrie darauf, angemessene Anteile von transduzierten und infizierten Zellen zu erreichen, so dass in jedem Bereich des Diagramms genügend Zellen für die Analyse vorhanden sind. Daher sollte der Forscher ein MOI von weniger als 1 anstreben (siehe Protokoll). Zu hohe oder zu niedrige Transduktions- und Infektionsraten führen zu Analyseproblemen aufgrund fehlender oder doppelt infizierter Zellen. Ebenso ist eine ähnliche Transduktionsrate für zu vergleichende SAMHD1-Vektoren der Schlüssel, damit die gleiche Kompensationsmatrix und Gating auf das gesamte Experiment angewendet werden kann, was das Vertrauen in die nachfolgende Analyse erhöht.

Zweitens ist das Alter der verwendeten U937-Zellen ein Schlüsselfaktor für ihre erfolgreiche Differenzierung. Eine erfolgreiche Differenzierung kann durch Beobachtung der Adhärenz, einer reduzierten Ansäuerung der Medien im Zeitverlauf nach Differenzierung und einer adäquaten Restriktion durch die Wildtyp-Positivkontrolle im Assay überwacht werden. Die Differenzierung von bis zu 5 Tagen war erfolgreich.

Einer der Hauptvorteile dieses Assays ist seine Flexibilität. Eine Vielzahl von modifizierten Versionen von SAMHD1 (Domänen, Aminosäuren, Speziessequenzen) kann durch einfache ortsgerichtete Mutagenese des Vektors oder Klonierung getestet werden. Ebenso können Varianten des Testervirus erforscht werden. Der Test wurde zuvor verwendet, um zu zeigen, dass HIV-1-Reverse-Transkriptase-Mutanten mit reduzierter Fähigkeit, dNTP zu binden, empfindlicher auf SAMHD1-Restriktion reagieren. Das gleiche Prinzip kann verwendet werden, um die Einschränkung anderer Viren durch SAMHD1 zu testen. Darüber hinaus können unterschiedliche Differenzierungsbedingungen oder künstliche Manipulation intrazellulärer dNTP-Konzentrationen verwendet werden, um die Interaktion zwischen intrazellulären Bedingungen und SAMHD1-Aktivität weiter zu untersuchen, ein Bereich aktiver Forschung im Bishop-Labor. Die Wechselwirkung von SAMHD1 mit verschiedenen nukleosidischen Reverse-Transkriptase-Inhibitoren wurde ebenfalls beschrieben, und die Wirkung von SAMHD1 wurde unter Verwendung dieses Assays für die Verwendung in Primärzellenmodifiziert 12,13,14,15.

Die Anpassung des Protokolls für die Verwendung in Primärzellen überwindet die Einschränkungen, die sich aus der Untersuchung metabolischer Phänotypen in transformierten Zellen ergeben. Das bestehende Format ermöglicht jedoch ein komfortables und technisch weniger anspruchsvolles Protokoll für Hochdurchsatzanalysen, insbesondere bei Verwendung eines Durchflusszytometers mit einem Hochdurchsatz-Sampler. Bei der Anpassung des Protokolls sollte die Anfälligkeit der intern nicht transduzierten Zellen für Bystander-Effekte (z. B. Immunsignalisierung) berücksichtigt werden.

Wie bei vielen Aspekten der Zellbiologie ist es wichtig, dass solche Assays als Teil eines ganzheitlichen Ansatzes zum Verständnis eines bestimmten Phänomens verwendet werden. Die parallele Verwendung biochemischer Assays für die SAMHD1-Aktivität16, die Quantifizierung intrazellulärer dNTP-Pools und die Beobachtung von SAMHD1-mutierten Phänotypen beim Menschen, ex vivo und in Tiermodellen (die von Labors auf der ganzen Welt durchgeführt werden, einige werden in dieser Ausgabe beschrieben) sind der Schlüssel zum sich entwickelnden Verständnis dieses komplexen Proteins.

Offenlegungen

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Zum Zwecke des Open Access haben die Autoren eine CC BY Public Copyright Lizenz auf jede Author Accepted Manuscript Version angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergibt. Die geäußerten Ansichten sind die des Autors oder der Autoren und nicht unbedingt die des NIHR oder des Ministeriums für Gesundheit und Soziales.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde vom Francis Crick Institute unterstützt, das seine Kernfinanzierung von Cancer Research UK (FC001042 und FC001162), dem UK Medical Research Council (FC001042 und FC001162) und dem Wellcome Trust (FC001042 und FC001162) erhält, und durch einen Wellcome Trust Investigator Award an JPS (108012 / Z / 15 / Z). Die Arbeit an der University of Cambridge wurde vom NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) und dem UK Medical Research Council (MR/S009752/1) kofinanziert. Der letztgenannte vom Vereinigten Königreich finanzierte Preis ist Teil des von der Europäischen Union unterstützten EDCTP 2-Programms.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
293T ZellenATCCCRL-3216
0,45 & Mikro; m SpritzenfilterSartoriusFCT122
10-cm-SchalenCorning430167Viruspräparate können durch Transfektion in Platten/Kolben mit höherer Kapazität skaliert werden - siehe Anleitung zur Transfektion Reagenzien
12-Well-PlattenGreiner665180
24-Well-PlattenGreiner662160
BD LSRFortessa ZellanalysatorBD Bioscience649225Alternative Analysatoren können verwendet werden, solange sie RFP- und YFP-Fluoreszenz lesen können
DMEMSigmaD6429ATCC empfiehlt, dass Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) so modifiziert ist, dass es 4 mM L-Glutamin, 4500 mg/L Glukose, 1 mM Natriumpyruvat und 1500 mg/L Natriumbicarbonat enthält.
DMSOFisherBP-231-100
fötales RinderserumGibco10500064
FlowjoBD Bioscience-alternativeAnalysesoftware kann verwendet werden
Lichtmikroskop-Jedes Hellfeld-Lichtmikroskop
p8.91-HIV GagPol Expressor (PMID: 8602510)
Paraformaldehyd (4 % in PBS)Alfa AesarJ61889
PBSSigmaD8537
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)ThermoFisher15140122
Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA)SigmaP8139
PolybrenSigmaTR-1003
pKB4--Maus-Leukämievirus GagPol-Expressor (PMID: 23035841)
pLGatewaySAMHD1eYFP-MLV-Paketierungsplasmid, das für eine humane Wildtyp-Sequenz kodiert. Details und Klonierungsverfahren Arnold et al. 2015 (Ref 1).
pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY
FP		--Wie oben, kodiert Aminosäuresubstitutionen an wichtigen Resten aktiver Zentren
PrismGraphpad-https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/Andere Datendarstellungssoftware sind ebenfalls geeignet
pVSV-G-VSV-G Expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternativ: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/)
RPMIThermoFisher21875034
Röhrchen mit SchraubverschlussStarLabE1415-2231
SCRPSY-HIV-Verpackung Plasmidkodierung RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/
Streifen 10 mLCorning10084450
Stripetten 5 mLCorning10420201
TrypLE expressGibco12604021Trypsin sind ebenfalls geeignet
TurbofectThermoFisherR0531alternative Transfektionsreagenzien funktionieren auch gut
U937-ZellenATCCCRL-1593.2
-

Referenzen

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HIV Infektionretrovirale Restriktionviraler RestriktionstestYFP ReporterRFP ReporterZelldifferenzierunggezielte Mutagenese

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