RIBO-seq in Bakterien: ein Probensammlungs- und Bibliotheksvorbereitungsprotokoll für die NGS-Sequenzierung

Summary

Hier beschreiben wir die Phasen der Probenentnahme und Vorbereitung für RIBO-seq in Bakterien. Die Sequenzierung der nach diesen Richtlinien erstellten Bibliotheken liefert ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse. Das Protokoll, das wir präsentieren, ist einfach, verwendet Standard-Laborgeräte und dauert sieben Tage von der Lyse bis zur Beschaffung von Bibliotheken.

Abstract

Die Ribosomenprofilierungstechnik (RIBO-seq) ist derzeit das effektivste Werkzeug, um den Prozess der Proteinsynthese in vivo zuuntersuchen. Der Vorteil dieser Methode im Vergleich zu anderen Ansätzen ist ihre Fähigkeit, die Translation zu überwachen, indem die Position und Anzahl der Ribosomen auf einem mRNA-Transkript genau abgebildet wird.

In diesem Artikel beschreiben wir die aufeinanderfolgenden Phasen der Probenentnahme und Vorbereitung für die RIBO-seq-Methode bei Bakterien und heben die Details hervor, die für die Planung und Durchführung des Experiments relevant sind.

Da das RIBO-seq auf intakte Ribosomen und verwandte mRNAs angewiesen ist, ist der Schlüsselschritt eine schnelle Hemmung der Translation und ein adäquater Zerfall der Zellen. Daher empfehlen wir die Filtration und das Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff für die Zellernte mit einer optionalen Vorbehandlung mit Chloramphenicol, um die Translation in Bakterien zu unterbrechen. Für den Zerfall schlagen wir vor, gefrorene Zellen mit Mörtel und Stößel in Gegenwart von Aluminiumoxid zu mahlen, um die Zellwand mechanisch zu stören. In diesem Protokoll ist kein Saccharosekissen oder eine Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation zur Monosomenreinigung erforderlich. Stattdessen wird die mRNA-Trennung mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gefolgt von der ribosomalen Fußabdruckexzision (28-30 nt-Band) angewendet und liefert zufriedenstellende Ergebnisse. Dies vereinfacht die Methode weitgehend und reduziert den Zeit- und Geräteaufwand für das Verfahren. Für die Bibliotheksvorbereitung empfehlen wir die Verwendung des kommerziell erhältlichen kleinen RNA-Kits für die Illumina-Sequenzierung von New England Biolabs, das den Richtlinien des Herstellers mit einem gewissen Grad an Optimierung folgt.

Die resultierenden cDNA-Bibliotheken stellen eine angemessene Quantität und Qualität dar, die für Next Generation Sequencing (NGS) erforderlich ist. Die Sequenzierung der nach dem beschriebenen Protokoll erstellten Bibliotheken führt zu 2 bis 10 Mio. eindeutig abgebildeten Lesevorgängen pro Probe, die ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse liefern. Das Protokoll, das wir präsentieren, ist schnell und relativ einfach und kann mit Standard-Laborgeräten durchgeführt werden.

Introduction

Die Ribosomenprofilierungstechnik (RIBO-seq) wurde im Labor von Jonathan Weissman an der University of California, San Francisco¹entwickelt. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Untersuchung der Genexpression auf translationaler Ebene konzentriert sich RIBO-seq auf jede Ribosombindung an mRNA und liefert Informationen über seine Position und die relative Anzahl der Ribosomen auf einem Transkript. Es ermöglicht die Überwachung des Prozesses der Proteinsynthese in vivo und kann eine einzelne Codonauflösung und -genauigkeit liefern, die die Messung der Ribosomendichte sowohl auf der einzelnen mRNA als auch entlang des gesamten Transkriptoms in der Zelle ermöglicht. Grundlage der RIBO-seq-Technik ist die Tatsache, dass das Ribosom während der Translation das mRNA-Molekül bindet und so das vergrabene Fragment des Transkripts vor einer Ribonuklease-Verdauung schützt. Nach Zugabe der Ribonuklease wird die ungeschützte mRNA verdaut und die von Ribosomen eingeschlossenen Fragmente - typischerweise von ~28-30 nt lang - bleiben intakt. Diese Fragmente, die als ribosomale Fußabdrücke (RF) bezeichnet werden, können dann isoliert, sequenziert und auf das Transkript abgebildet werden, aus dem sie stammen, was zur Erkennung der genauen Position der Ribosomen führt. Tatsächlich wird die Ribosomenfähigkeit zum Schutz von mRNA-Fragmenten seit den 1960er Jahren verwendet, um ribosomale Bindungs- und Translationsinitiierungsstellen (TIS)^2,3,4zu untersuchen. Mit dem Fortschritt in der Tiefensequenzierungstechnologie ist RIBO-seq jedoch zu einem Goldstandard für die Translationsüberwachung^{geworden 5,} der durch das Ribosomengagement genomweite Informationen über die Proteinsynthese liefern kann⁶. Ribosomenprofilierung füllte die technologische Lücke, die zwischen der Quantifizierung des Transkriptoms und des Proteoms bestand⁶.

Um ein Ribosomen-Profiling durchzuführen, müssen wir Zelllysat des Organismus erhalten, der unter den untersuchten Bedingungen gewachsen war. Die Störung dieser Bedingungen während der Zellentnahme und -lyse kann unzuverlässige Daten liefern. Um dies zu verhindern, werden häufig Translationsinhibitoren, schnelle Ernte und Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff verwendet. Zellen können durch kryogenes Mahlen in einem mechanischen Homogenisator wie einer Mischermühle^7,8 oder^einem Perlenschläger⁹und durch Trituration durch eine Pipette¹⁰ oder mit einer Nadel¹¹lysiert werden. Der Lysepuffer kann kurz vor oder kurz nach der Pulverisierung der Zellen zugegeben werden. In unserem Protokoll verwenden wir flüssigen Stickstoff zur Vorkühlung von Mörtel und Stößel sowie Aluminiumoxid als schonenderen Ansatz zur Störung der bakteriellen Zellwand, was eine RNA-Scherung verhindert, die häufig bei Methoden wie sonifikation auftritt. Nach der Pulverisierung fügen wir dem gekühlten Inhalt des Mörtels einen eiskalten Lysepuffer hinzu. Die Auswahl eines geeigneten Lysepuffers ist wichtig, um die beste Auflösung der ribosomalen Fußabdrücke zu erhalten. Da die Ionenstärke sowohl die HF-Größe als auch die Leserahmengenauigkeit beeinflusst, wird derzeit empfohlen, Lysepuffer mit geringer Ionenstärke und Pufferkapazität zu verwenden, auch wenn es den Anschein hat, dass die Pufferzusammensetzung die ribosomale Belegung auf mRNAs^11,12nicht beeinflusst. Wichtige Bestandteile des Lysepuffers sind Magnesiumionen, deren Vorhandensein eine Dissoziation der ribosomalen Untereinheiten verhindert und spontane Konformationsveränderungen in den bakteriellen Ribosomen hemmt^11,13. Calciumionen spielen ebenfalls eine bedeutende Rolle und sind essentiell für die Aktivität der Mikrokokkennuklease (MNase), die in der bakteriellen Ribosomenprofilierungsmethode verwendet wird¹⁴. Die Zugabe von Guanosin 5′-[β,γ-imido]triphosphat (GMP-PNP), einem nicht hydrolysierbaren Analogon von GTP, zusammen mit Chloramphenicol hemmt die Translation während der Lyse^15.

Wenn das Lysat erhalten wird, wird es durch Zentrifugation geklärt und in zwei Portionen unterteilt, jeweils für eine RIBO-seq- und eine Hochdurchsatz-Gesamt-mRNA-Sequenzierung (RNA-seq), da sie gleichzeitig durchgeführt werden (Abbildung 1). RNA-seq bietet einen Bezugspunkt, der den Vergleich von Daten sowohl von RIBO-seq als auch von RNA-seq während der Datenanalyse ermöglicht. Das untersuchte Translatom wird durch Normalisierung ribosomaler Fußabdrücke zur mRNA-Häufigkeit^{definiert 16}. Daten von RNA-seq können auch helfen, Klon- oder Sequenzierungsartefakte zu identifizieren¹⁷.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der mRNA-Probenvorbereitung für RIBO-seq und RNA-seq. Für die RIBO-seq-Bibliotheksvorbereitung wird RNA mit MNase (A) verdaut, gefolgt von der Größenauswahl von RF von ~ 28-30 nt Länge (B); für RNA-seq wird RNA isoliert (C), von rRNA (D) erschöpft und die resultierende mRNA wird zufällig in Fragmente unterschiedlicher Länge (E) fragmentiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die ersten Schritte des Verfahrens der Probenvorbereitung für RIBO-seq und RNA-seq unterscheiden sich geringfügig (Abbildung 1). Für das ribosomale Profiling muss das Lysat durch eine spezifische Endonuklease verdaut werden, um die mRNA-Moleküle abzubauen, die nicht durch die Ribosomen geschützt sind. In Standardprotokollen werden die erhaltenen Monosomen durch eine Saccharosekissen-Ultrazentrifugation oder eine Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation⁸,¹⁴zurückgewonnen. In diesem Artikel zeigen wir, dass dieser Schritt nicht notwendig ist, um RF zu isolieren, die für das RIBO-seq in Bakterien erforderlich sind, ebenso für eukaryotische Zellen¹⁸, und dass die Größenauswahl der geeigneten mRNA-Fragmente aus dem Polyacrylamid-Gel ausreichend ist.

Für RNA-seq wird mRNA durch die Erschöpfung von rRNA aus der gesamten RNA erhalten - rRNA-Moleküle hybridisieren zu den biotinylierten Oligonukleotidsonden, die an die Streptavidin-beschichteten magnetischen Perlen binden. Die rRNA-Oligonukleotid-Perlenkomplexe werden dann mit einem Magneten aus der Probe^entfernt,was zu einer rRNA-erschöpften Probe¹⁹,²⁰führt. Die gereinigten mRNA-Moleküle werden dann durch alkalische Hydrolyse zufällig fragmentiert. Die erhaltenen Fragmente der mRNA sowie die ribosomalen Fußabdrücke werden in cDNA-Bibliotheken umgewandelt und für die Tiefensequenzierung vorbereitet (Abbildung 2). Dies beinhaltet die Reparatur der Enden, die nach der alkalischen Hydrolyse (für mRNA) und der enzymatischen Verdauung (für RF) erforderlich ist: Dephosphorylierung von 3'-Enden, gefolgt von Phosphorylierung von 5'-Enden. Die nächsten Schritte sind die Adapterligatur und die umgekehrte Transkription, um cDNA-Inserts zu erstellen, die von Sequenzen umrahmt werden, die für die Next Generation Sequencing (NGS) mit der Illumina-Plattform erforderlich sind. Die letzte Phase der Bibliotheksvorbereitung ist eine PCR-Reaktion, bei der die Konstrukte amplifiziert und mit probenspezifischen Barcodes markiert werden, um multiplexen und sequenzieren zu können, verschiedene Proben auf einem Kanal zu sequenzieren. Vor der Sequenzierung werden Qualität und Quantität der Bibliotheken durch die hochempfindliche DNA-On-Chip-Elektrophorese bewertet. cDNA-Bibliotheken mit entsprechenden Parametern können dann gepoolt und sequenziert werden. Die Sequenzierung kann auf verschiedenen Illumina-Plattformen wie MiSeq, NextSeq oder HighSeq durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der Bibliotheken, der erforderlichen Leselänge und der Sequenzierungstiefe. Nach der Sequenzierung wird die bioinformatische Analyse durchgeführt.

Abbildung 2. Bibliotheksvorbereitung. Die Bibliotheksvorbereitung umfasst die Reparatur der Enden, die Ligatur der Adapter, die umgekehrte Transkription und die Verstärkung mit Barcoding. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Ribosomenprofilierung ist eine universelle Methode, die sich leicht modifizieren und entsprechend der wissenschaftlichen Fragestellung anpassen lässt. Ursprünglich wurde es in Hefe¹verwendet, aber kurz darauf wurde es auf Bakterienzellen²¹ sowie eukaryotische Modellorganismen wie Maus^10,Zebrafisch^22,Fruchtfliege²³ und Arabidopsis thaliana²⁴aufgetragen. Es wurde auch für die Untersuchung verschiedener Ribosomentypen verwendet: zytoplasmatische, mitochondriale^25,26 und Chloroplast^27,28. Bei Eukaryoten wird RIBO-seq üblicherweise angepasst und verfeinert, um spezifische Aspekte der Translation zu untersuchen, einschließlich Initiation^{10,11,29,30,31,32}, Dehnung^{1,10,11,31,33}, Ribosomenabwürgen³³ und Konformationsänderung³³. Die meisten Modifikationen beinhalten die Verwendung verschiedener Translationsinhibitoren. Bei Bakterien waren analoge Studien jedoch aufgrund des Mangels an Inhibitoren mit dem erforderlichen Wirkmechanismus schwierig^{durchzuführen 34}. Der am häufigsten verwendete Translationsinhibitor in Bakterien ist Chloramphenicol (CAM), das an das Peptidyltransferase-Zentrum (PTC) bindet und eine korrekte Positionierung der Aminoacyl-tRNA in der A-Stelle verhindert. Infolgedessen verhindert CAM die Bildung einer Peptidbindung, die dazu führt, dass die länglichen Ribosomen³⁵blockiert werden. Weitere Beispiele für Translationsinhibitoren in Bakterien sind Tetracyclin (TET)³⁶, Retapamulin (RET)³⁴ und Onc112^37, die zur Untersuchung von Translationsinitiierungsstellen verwendet wurden. TET, das die tRNA-Abgabe an das Ribosom verhindert, indem es sich direkt mit der Anticodon-Stammschleife der tRNA an der A-Stelle überschneidet, wurde ursprünglich angewendet, um die Ergebnisse der CAM-Behandlung zu überprüfen, da beide Antibiotika sind, die die Translationsdehnung hemmen³⁸. Es wurde festgestellt, dass TET primäre TIS erkennt, konnte jedoch kein internes TIS³⁶aufdecken. RET bindet im PTC des bakteriellen Ribosoms und verhindert die Bildung der ersten Peptidbindung, indem es mit einer Elongator-Aminoacyl-tRNA an der A-Stelle interferiert. Die Anwendung von RET führt zu einem Ribosomen-Arrest sowohl bei primären als auch bei internen TISs³⁴. Onc112, ein prolinreiches antimikrobielles Peptid, bindet im Austrittstunnel und blockiert die Aminoacyl-tRNA-Bindung an der ribosomalen A-Stelle. Dadurch verhindert Onc112, dass Initiationskomplexe in die Dehnungsphase³⁷eintreten.

Die Hauptinformation, die das Ribosomen-Profiling liefert, ist die Ribosomendichte und ihre Position auf der mRNA. Es wurde erfolgreich angewendet, um die differentielle Genexpression auf der Ebene der Translation in verschiedenen Wachstumsbedingungen^1,6zu untersuchen, die translationale Effizienz^1,38,39 zu messen und Translationsregulationsereignisse wie ribosomale Pausierung¹⁰zu erkennen. RIBO-seq ermöglicht auch die Aufdeckung der Translation von annotierter ncRNA, Pseudogenen und unangekündigten kleinen offenen Leserahmen (ORF), die zur Identifizierung neuer und/oder sehr kurzer proteinkodierender Gene^{10,12,22,30,37}führen. In solchen Fällen kann RIBO-seq die Genomannotation verfeinern und verbessern. Mit seiner hohen Sensitivität für die Identifizierung übersetzter ORFs und seiner quantitativen Natur kann das Ribosomen-Profiling auch als Proxy für die Proteombestimmung oder zur Unterstützung von Proteomik-Studien^{dienen 31,34,39}. Durch die Kartierung von TIS zeigt das Ribosomen-Profiling N-terminal ausgedehnte und abgeschnittene Isoformen bekannter Proteine^10,32. RIBO-seq wurde auch angepasst, um die co-translationale Faltung der Proteine^14,21,24zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Messung von Dehnungsraten^1,10,39 oder Dekodierungsgeschwindigkeiten einzelner Codons⁶ und hilft bei der Entwicklung quantitativer Modelle der Übersetzung¹⁷. Die Ribosomen-Profiling-Methode ist auch in der Lage, mechanistische Einblicke in die Ribosomen-Pause bei Bakterien^7,15,17, Frameshifting⁴⁰, Stop-Codon-Readthrough²¹, Abschluss- / Recyclingdefekte^41,42 und ribosomale Konformationsänderungen³³ in Eukaryoten zu liefern. RIBO-seq wurde auch angepasst, um den Einfluss spezifischer trans-wirkender Faktoren auf die Translation wie miRNAs⁶ und RNA-bindende Proteine in Eukaryoten¹⁶,^43zuuntersuchen. Es ist jedoch wichtig anzuerkennen, dass das experimentelle Design und die erhaltene Auflösung von RIBO-seq die Menge an Informationen bestimmen, die aus den resultierenden Sequenzierungsdaten extrahiert werden können¹².

Protocol

1. Probenentnahme

1. Bereiten Sie eine Bakterienkultur vor. Wir empfehlen ein Kulturvolumen von 100 ml pro Probe.
2. Vorbereitung von Geräten und Reagenzien für die Probenentnahme: zwei Messlöffel pro Probe, sterile 0,45 μm McE-Filter (Mixed Cellulose esters Membrane), 50 ml sterile Röhrchen, flüssiger Stickstoff, 50 mg/ml Chloramphenicol in 70% (vol/vol) Ethanol (optional). Durchstechen Sie den Deckel von 50-ml-Rohren, um die Verdunstung von flüssigem Stickstoff zu ermöglichen und die Explosion geschlossener Rohre zu verhindern. Dekontaminieren Sie Scoopulas mit Laborwaschmittel und 70% Ethanol.
3. Die Filterausrüstung und eine der Schaufeln auf Wachstumstemperatur der Bakterienkultur vorwärmen.
   HINWEIS: Wir empfehlen eine Ganzglasfiltervorrichtung mit Trichter, gestreuter Basis, Geschliffenem Kolben und Federklemme mit 47 mm Ø.
4. Vor der Probenernte Chloramphenicol in die Bakterienkultur bis zur Endkonzentration von 100 μg/ml geben und 1 Minute inkubieren (optional).
5. Gießen Sie flüssigen Stickstoff in ein steriles Röhrchen von 50 ml und legen Sie die zweite Schaufel zum Abkühlen in das Röhrchen.
   Vorsicht! Flüssiger Stickstoff kann dazu führen, dass geschlossene Behälter aufgrund der Druckänderung bei der Verdampfung explodieren. Um dies zu verhindern, ist es notwendig, einige Löcher im Deckel von 50-ml-Rohren zu schaffen, um die Verdunstung von flüssigem Stickstoff zu ermöglichen.
6. Sammeln Sie Zellen durch Filtration. Stoppen Sie die Filterung, wenn das Medium die Membran passiert hat, aber lassen Sie den Filter nicht vollständig trocknen.
7. Sammeln Sie Bakterienpellets, indem Sie die Zellen mit einer vorgewarnten Schaufel schnell von der Filterscheibe abkratzen. Legen Sie sofort die gesamte Schaufel mit den geernteten Zellen in das mit flüssigem Stickstoff gefüllte 50-ml-Röhrchen. Das geerntete Pellet sollte vollständig mit flüssigem Stickstoff bedeckt sein.
8. Lassen Sie das Pellet gründlich einfrieren und entleeren Sie gefrorene Zellen mit einer zuvor abgekühlten zweiten Schaufel. Schließen Sie den durchbohrten Deckel und führen Sie das Rohr auf -80 °C. STOP-Punkt
   HINWEIS: Desinfizieren Sie Die Schaufeln nach jeder Probenernte.

2. Zelllyse

1. 0,1 M GMP-PNP in 10 mM Tris pH 8, DNase I und 1,5 ml Reaktionsröhrchen für Lysate vorbereiten und auf Eis halten. Kühlen Sie die Zentrifuge auf 4 °C.
2. Lysepuffer vorbereiten (20 mM TRIS pH 7,6, 10 mM MgAcet, 150 mM KAcet, 0,4% TRITON X-100, 6 mM β-Mercaptoethanol, 5 mM CaCl₂ und optional 1 mM Chloramphenicol). Aliquotieren Sie 500 μL des Lysepuffers pro Probe in 1,5 ml Reaktionsröhrchen und legen Sie sie auf Eis.
3. Mörtel und Stößel mit einem Laborwaschmittel und 70% Ethanol dekontaminieren und trocknen. Kühlen Sie Mörser und Stößel, indem Sie flüssigen Stickstoff in den Mörser gießen.
4. Gefrorenes Pellet in den vorgekühlten Mörtel überführen und zu einem Pulver mahlen. Mit einem Spatel etwa 1 Volumen Aluminiumoxid hinzufügen und weiter schleifen. Halten Sie Mörser, Stößel und Zellen kühl, indem Sie bei Bedarf flüssigen Stickstoff gießen, lassen Sie den Inhalt des Mörtels nicht auftauen.
5. Kurz vor der Verwendung des Lysepuffers fügen Sie GMP-PNP und DNase I in das Lysepuffer-Aliquot zur Endkonzentration von 2 mM bzw. 100 U/ml hinzu. Die Lösung mit Zellen und Aluminiumoxid in den Mörtel überführen und weiter mahlen. Lassen Sie das Lysat beim Mahlen langsam auftauen und geben Sie das Gemisch in das vorgekühlte 1,5 ml Reaktionsrohr und legen Sie es sofort auf Eis.
6. Zentrifugenlysate bei 20 000 x g für 5 Minuten bei 4 °C. Überstände in neue, vorgekühlte 1,5 mL Reaktionsröhrchen überführen und auf Eis halten.
7. Messen Sie die RNA-Konzentration in jeder Probe mit einem NanoDrop. Verwenden Sie 1:10 Verdünnungen von Proben und 1:10 Verdünnung des Lysepuffers in nukleasefreiem Wasser als Rohling.
   HINWEIS: Beachten Sie, dass Chloramphenicol bei 260 nm eine signifikante Absorption zeigt.
8. Teilen Sie jedes Lysat in zwei Portionen: eine für RIBO-seq (0,5 - 1 mg RNA) und die zweite für RNA-seq (der Rest).
9. Reinigen Sie die Proben für RNA-seq mit einem handelsüblichen RNA-Reinigungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
   HINWEIS: Wir empfehlen die Verwendung von Zymo RNA Clean & Concentrate -25 Kit (siehe Materialtabelle). Wir empfehlen auch, 4,5 Volumen Ethanol (im Vergleich zum Probenvolumen) in die Mischung aus Probe und Bindungspuffer für ribosomale Fußabdrücke und fragmentierte mRNA zu geben, um die Reinigungseffizienz von kurzen RNA-Fragmenten zu erhöhen.
10. Lagern Sie die für RNA-seq vorgesehenen Proben bei -80 °C. Das Verfahren für RNA-seq wird ab Schritt 5 fortgesetzt.

3. MNase-Aufschluss von Proben für RIBO-seq

1. Zu 1 mg RNA werden 3,8 μL 187,5 U/μL MNase in 10 mM Tris pH 8 addiert und mit Lysepuffer auf das Gesamtvolumen von 500 μL aufgeladen.
2. Bei 25 °C, 300 U/min, 45 Minuten in einem Thermomixer inkubieren.
3. Reinigen Sie die Proben mit einem handelsüblichen RNA-Reinigungskit (wie in Schritt 2.9).
4. Lagern Sie die Proben für RIBO-seq bei -80 °C (STOP-Punkt) oder fahren Sie mit der Größenauswahl fort.

4. Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Größenauswahl der Proben für RIBO-seq

1. Bereiten Sie ein 15% Polyacrylamid-FSME-Gel mit 8 M Harnstoff vor und legen Sie es in einen Tank mit FSME-Puffer. Mindestens 10 Minuten bei einer konstanten Spannung von 200 V vorlaufen.
2. Proben mit TBE-Urea Sample Buffer mischen, bei 95 °C für 1 Minute denaturieren und sofort auf Eis legen.
3. Waschen Sie den Harnstoff aus, indem Sie TSME-Puffer mit einer Spritze in Gelbrunnen injizieren. Laden Sie die Proben und lassen Sie einen Vertiefungsraum zwischen ihnen, um jede Probe zu trennen und Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Verwenden Sie 29 nt Oligonukleotid und eine Mischung aus 26 nt und 32 nt Oligonukleotiden als Marker. Führen Sie die Elektrophorese mit einer konstanten Spannung von 180 V durch.
4. Bereiten Sie einen sterilen Puffer für die Inkubation über Nacht vor (5 mM EDTA, 10 mM NaOAc pH 5).
5. Nach der Elektrophorese das Gel in einem SYBR Gold-Bad ca. 2-3 Minuten einfärben und das Gel mit nukleasefreiem Wasser abspülen.
6. Schneiden Sie Gelfragmente zwischen 26 und 32 nt mit den sterilen Nadeln oder den Rasierklingen heraus und legen Sie die Gelfragmente in separate 1,5 ml Röhrchen für jede Probe. Wechseln Sie die Nadel oder die Rasierklinge zwischen den Proben.
7. Fügen Sie 200 μL des Nachtinkubationspuffers zu jedem Reaktionsröhrchen hinzu.
8. Inkubieren Sie die Proben bei 10 °C, 1000 U/min über Nacht in einem Thermomixer.
9. Reinigen Sie die Proben am nächsten Tag wie in Schritt 2.9. Eluierten Sie die Fußabdrücke in 80 μL nukleasefreiem Wasser.
10. Lagern Sie die Proben bei -80 °C. STOP-Punkt. Das Verfahren für RIBO-seq wird ab Schritt 7 fortgesetzt.

5. Aufreinigung bakterieller mRNA durch rRNA-Depletion aus Proben für RNA-seq

1. Entfernen Sie rRNA aus Proben mit einem bakteriellen mRNA-Reinigungskit (z. B. Invitrogen MICROBExpress). Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers.
2. Reinigen Sie die Proben wie in Schritt 2.9. Eluierten Sie die mRNA in 50 μL nukleasefreiem Wasser.
3. Lagern Sie die Proben für RNA-seq bei -80 °C (STOP-Punkt) oder setzen Sie die alkalische Fragmentierung fort.

6. Alkalische Fragmentierung von Proben für RNA-seq

1. Herstellung eines alkalischen Hydrolysepuffers (Mischung 220 μL 0,1 M NaHCO₃, 30 μL 0,1 M_Na2CO₃ und 1 μL 0,5 M EDTA). 1 Volumen (50 μL) alkalischer Puffer mit 1 Volumen (50 μL) der Probe mischen und bei 95 °C 25 Minuten lang inkubieren.
2. Fügen Sie 5 μL von 3 M NaOAc pH 5,5 hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
3. Reinigen Sie die Proben wie in Schritt 2.9 und eluierten Sie die Proben in 80 μL nukleasefreiem Wasser.
4. Möglicher STOP-Punkt: RNA-seq-Proben bei -80 °C lagern. Wir empfehlen jedoch, direkt zu Schritt 7 überzugehen, um unnötiges Einfrieren und Auftauen zu vermeiden.

7. Dephosphorylierung und Phosphorylierung von Proben für RNA- und RIBO-seq

1. Jeder Probe werden 10 μL 10x Reaktionspuffer PNK und 5 μL T4 PNK zugefügtem PNK zu. 1,5 Stunden bei 37 °C inkubieren, um die 3'-Enden zu entphosphorylatieren.
2. Fügen Sie 3 μL von 1 mM ATP hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 1 Stunde, um die 5'-Enden zu phosphorylatieren.
3. Reinigen Sie die Proben wie in Schritt 2.9, eluierten Sie sie in 30 μL nukleasefreiem Wasser.
4. Lagern Sie die Proben bei -80 °C. STOP-Punkt.

8. Bibliotheksvorbereitung mit NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set für Illumina

1. Bereiten Sie 100-1000 ng Input-RNA (erhaltene mRNA-Fragmente und ribosomale Fußabdrücke) in 6 μL nukleasefreiem Wasser vor und fügen Sie 1 μL 3'-SR-Adapter hinzu. Inkubieren Sie nach dem Protokoll des Herstellers.
2. Fügen Sie 10 μL 3' Ligation Reaction Buffer (2X) und 3 μL 3' Ligation Enzyme Mix hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 2,5 Stunden, anstatt 1 Stunde bei 25 °C, wie im Protokoll des Herstellers angegeben.
3. Hybridisieren Sie den Reverse Transcription Primer nach dem Protokoll des Herstellers mit einem modifizierten Programm: 5 Minuten bei 75 °C, 30 Minuten bei 37 °C und halten Sie bei 4 °C.
4. Ligatieren Sie den 5'-SR-Adapter. Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers mit einer Änderung: Führen Sie die Inkubation bei 37 °C für 2,5 Stunden statt 1 Stunde bei 25 °C durch.
5. Führen Sie die Reverse Transkription gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.
6. Möglicher STOP-Punkt: Inkubieren Sie die Proben, die synthetisierte cDNAs enthalten, bei 70 °C für 15 Minuten, um die Reverse Transkriptase zu inaktivieren und bei -80 °C zu lagern. Wir empfehlen jedoch, direkt mit den nächsten Schritten fortzufahren, um unnötiges Einfrieren und Auftauen der Proben zu vermeiden.
7. Speichern Sie die Hälfte jeder cDNA-Bibliothek bei -80 °C als Backup.
8. Führen Sie eine PCR-Amplifikation gemäß dem Protokoll des Herstellers durch. Verwenden Sie die Hälfte der Reaktionsmischung. Lagern Sie die erhaltenen Bibliotheken bei -80 °C. STOP-Punkt.

9. Größenauswahl von cDNA-Bibliotheken mit PAGE

1. Bereiten Sie 6% Polyacrylamid-FSME-Gel vor und legen Sie es in einen Tank mit FSME-Puffer. Mindestens 10 Minuten bei einer konstanten Spannung von 200 V vorlaufen.
2. Mischen Sie die Proben mit Gel Loading Dye, Blue (6X) und laden Sie sie auf das Gel. Verwenden Sie Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest als Leiter. Führen Sie zu Beginn die Elektrophorese mit einer konstanten Spannung von 120 V durch, damit DNA in das Gel eindringen kann, und ändern Sie dann die Spannung auf 180 V.
3. Wenn die Elektrophorese beendet ist, färben Sie das Gel in einem SYBR Gold-Bad für ca. 2-3 Minuten und spülen Sie das Gel mit nukleasefreiem Wasser ab.
4. Verbrauchen Sie Gelfragmente, die die Bibliotheken enthalten. Für RNA-seq-Proben verbrauchen sie zwischen 135-180 nt und für RIBO-seq zwischen 135-170 nt. Verwenden Sie eine sterile Nadel oder Rasierklinge und legen Sie die herausgeschnittenen Gelfragmente in separate 1,5 ml Reaktionsröhrchen. Denken Sie daran, die Nadel oder Rasierklinge zwischen den Proben zu wechseln.
   HINWEIS: Die Adapter und der Barcode von NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set für Illumina haben insgesamt 119 nt, was den unteren Exzisionsschnitt bestimmt.
5. Fügen Sie 100 μL nukleasefreies Wasser zu jedem herausgeschnittenen Gelfragment hinzu.
6. Inkubieren Sie die Gelfragmente bei 10 °C, 450 U/min über Nacht in einem Thermomixer.
7. Reinigen und konzentrieren Sie die cDNA-Bibliotheken mit einem kommerziellen DNA-Clean-up-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
   HINWEIS: Wir empfehlen die Verwendung des Zymo DNA Clean & Concentrate -5 Kits (siehe Materialtabelle).
8. Lagern Sie gereinigte cDNA-Bibliotheken bei -80 °C. STOP-Punkt.

Results

Die hier vorgestellten exemplarischen Ergebnisse wurden in einer Studie zur Translationsregulation in sporulierenden WT Bacillus subtilis Zellen erzielt. Über Nachtkulturen wurden auf OD₆₀₀ entsprechend 0,1 in 100 ml reichhaltigem Medium verdünnt und bei 37 °C unter kräftigem Schütteln inkubiert, bis OD₆₀₀ 0,5-0,6 erreichte. Das reichhaltige Medium wurde dann durch minimales Medium ersetzt, um den Sporulationsprozess zu induzieren, und die Inkubation wurde für bis zu vier Stunden fortgesetz...

Discussion

Die wichtigste technische Herausforderung des Ribosomen-Profilings besteht in der Notwendigkeit, die Translation schnell zu hemmen, um eine Momentaufnahme von Ribosomen auf mRNAs in einem bestimmten physiologischen Zustand von Interesse zu erfassen. Um dies zu erreichen, werden häufig Translationsinhibitoren, schnelle Ernte und Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff verwendet. Die Anwendung von Antibiotika ist optional, da sie Artefakte verursachen können. Chloramphenicol ist ein häufig verwendetes Medikament, um längli...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X TBE (Pulver)	Invitrogen	AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, rein	Acros Organics	125472500
Adenosin 5'-Triphosphat (ATP)	New England Biolabs	P0756S
Aluminiumoxid kalziniert rein p.a.	Chempur	114560600
Calciumchlorid-Dihydrat	Sigma-Aldrich	C3881-500G
Chloramphenicol	MP Biomedicals	190321
DNA Clean & Konzentrator -5	Zymo Research	D4004
Dnase I rekombinant, Rnasefrei	Roche	4716728001
EDTA Dinatriumsalz	Fisher Scientific	E/P140/48
Ethylalkohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	BA6480111
Filtrationsgerät	VWR Collection	511-0265	Ganzglas-Filtrationsgerät, mit Trichter, frittiertem Boden, Kappe, 47 mm & Oslash; Federklemme und Schliffkolben
Gel 40 (19:1)	Rotiphorese	3030.1
Gel Loading Dye, blau, 6X	New England Biolabs	E6138G
Guanosin 5′-[β,γ-imido]triphosphat-trinatriumsalzhydrat	Sigma-Aldrich	G0635-25MG
labZAP	A& A Biotechnologie	040-500
Magnesiumacetat-Tetrahydrat	Sigma-Aldrich	M5661-250G
MCE-Membranfitter	Alfatec Technology	M47MCE45GWS	Porengröße: 0,45 μm
MICROBExpress Bakterielle mRNA-Aufreinigung	Invitrogen	AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set für Illumina	New England Biolabs	E7300S
Nukleasefreies Wasser	Ambion	AM9937
Kaliumacetat wasserfrei reines P.A.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest	New England Biolabs	E7323A
RNA Clean & Konzentrator -25	Zymo Research	R1018
Natriumacetat	Sigma-Aldrich	S2889-250G
Natriumcarbonat	Sigma-Aldrich	223530-500G
Natriumhydrogencarbonat rein p.a.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	810530115
SYBR Gold-Nukleinsäure-Gel-Färbung	Life Technologies	S11494
T4 Polynukleotidkinase	New England Biolabs	M0201L
T4 Polynukleotidkinase Reaktionspuffer	New England Biolabs	B0201S
FSME-Harnstoff-Probenpuffer (2x)	Invitrogen	LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methan, ultrarein, 99,9%	AlfaAesar	J65594
Triton X-100, 98%	Acros Organics	327371000
Urea G.R.	lach:ner	40096-AP0