RIBO-seq in Bakterien: ein Probensammlungs- und Bibliotheksvorbereitungsprotokoll für die NGS-Sequenzierung

Summary

Hier beschreiben wir die Phasen der Probenentnahme und Vorbereitung für RIBO-seq in Bakterien. Die Sequenzierung der nach diesen Richtlinien erstellten Bibliotheken liefert ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse. Das Protokoll, das wir präsentieren, ist einfach, verwendet Standard-Laborgeräte und dauert sieben Tage von der Lyse bis zur Beschaffung von Bibliotheken.

Abstract

Die Ribosomenprofilierungstechnik (RIBO-seq) ist derzeit das effektivste Werkzeug, um den Prozess der Proteinsynthese in vivo zuuntersuchen. Der Vorteil dieser Methode im Vergleich zu anderen Ansätzen ist ihre Fähigkeit, die Translation zu überwachen, indem die Position und Anzahl der Ribosomen auf einem mRNA-Transkript genau abgebildet wird.

In diesem Artikel beschreiben wir die aufeinanderfolgenden Phasen der Probenentnahme und Vorbereitung für die RIBO-seq-Methode bei Bakterien und heben die Details hervor, die für die Planung und Durchführung des Experiments relevant sind.

Da das RIBO-seq auf intakte Ribosomen und verwandte mRNAs angewiesen ist, ist der Schlüsselschritt eine schnelle Hemmung der Translation und ein adäquater Zerfall der Zellen. Daher empfehlen wir die Filtration und das Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff für die Zellernte mit einer optionalen Vorbehandlung mit Chloramphenicol, um die Translation in Bakterien zu unterbrechen. Für den Zerfall schlagen wir vor, gefrorene Zellen mit Mörtel und Stößel in Gegenwart von Aluminiumoxid zu mahlen, um die Zellwand mechanisch zu stören. In diesem Protokoll ist kein Saccharosekissen oder eine Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation zur Monosomenreinigung erforderlich. Stattdessen wird die mRNA-Trennung mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gefolgt von der ribosomalen Fußabdruckexzision (28-30 nt-Band) angewendet und liefert zufriedenstellende Ergebnisse. Dies vereinfacht die Methode weitgehend und reduziert den Zeit- und Geräteaufwand für das Verfahren. Für die Bibliotheksvorbereitung empfehlen wir die Verwendung des kommerziell erhältlichen kleinen RNA-Kits für die Illumina-Sequenzierung von New England Biolabs, das den Richtlinien des Herstellers mit einem gewissen Grad an Optimierung folgt.

Die resultierenden cDNA-Bibliotheken stellen eine angemessene Quantität und Qualität dar, die für Next Generation Sequencing (NGS) erforderlich ist. Die Sequenzierung der nach dem beschriebenen Protokoll erstellten Bibliotheken führt zu 2 bis 10 Mio. eindeutig abgebildeten Lesevorgängen pro Probe, die ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse liefern. Das Protokoll, das wir präsentieren, ist schnell und relativ einfach und kann mit Standard-Laborgeräten durchgeführt werden.

Introduction

Die Ribosomenprofilierungstechnik (RIBO-seq) wurde im Labor von Jonathan Weissman an der University of California, San Francisco¹entwickelt. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Untersuchung der Genexpression auf translationaler Ebene konzentriert sich RIBO-seq auf jede Ribosombindung an mRNA und liefert Informationen über seine Position und die relative Anzahl der Ribosomen auf einem Transkript. Es ermöglicht die Überwachung des Prozesses der Proteinsynthese in vivo und kann eine einzelne Codonauflösung und -genauigkeit liefern, die die Messung der Ribosomendichte sowohl auf der einzelnen mRNA als auch entlang des gesamten Transkripto....

Protocol

1. Probenentnahme

1. Bereiten Sie eine Bakterienkultur vor. Wir empfehlen ein Kulturvolumen von 100 ml pro Probe.
2. Vorbereitung von Geräten und Reagenzien für die Probenentnahme: zwei Messlöffel pro Probe, sterile 0,45 μm McE-Filter (Mixed Cellulose esters Membrane), 50 ml sterile Röhrchen, flüssiger Stickstoff, 50 mg/ml Chloramphenicol in 70% (vol/vol) Ethanol (optional). Durchstechen Sie den Deckel von 50-ml-Rohren, um die Verdunstung von flüssigem Stickstoff zu ermöglichen und die Explosion geschlossener Rohre zu verhindern. Dekontaminieren Sie Scoopulas mit Laborwaschmittel und 70% Ethanol.
3. Die Filterausrüstung und eine der Schaufeln auf ....

Results

Die hier vorgestellten exemplarischen Ergebnisse wurden in einer Studie zur Translationsregulation in sporulierenden WT Bacillus subtilis Zellen erzielt. Über Nachtkulturen wurden auf OD₆₀₀ entsprechend 0,1 in 100 ml reichhaltigem Medium verdünnt und bei 37 °C unter kräftigem Schütteln inkubiert, bis OD₆₀₀ 0,5-0,6 erreichte. Das reichhaltige Medium wurde dann durch minimales Medium ersetzt, um den Sporulationsprozess zu induzieren, und die Inkubation wurde für bis zu vier Stunden fortgesetz.......

Discussion

Die wichtigste technische Herausforderung des Ribosomen-Profilings besteht in der Notwendigkeit, die Translation schnell zu hemmen, um eine Momentaufnahme von Ribosomen auf mRNAs in einem bestimmten physiologischen Zustand von Interesse zu erfassen. Um dies zu erreichen, werden häufig Translationsinhibitoren, schnelle Ernte und Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff verwendet. Die Anwendung von Antibiotika ist optional, da sie Artefakte verursachen können. Chloramphenicol ist ein häufig verwendetes Medikament, um längli.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X TBE (Pulver)	Invitrogen	AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, rein	Acros Organics	125472500
Adenosin 5'-Triphosphat (ATP)	New England Biolabs	P0756S
Aluminiumoxid kalziniert rein p.a.	Chempur	114560600
Calciumchlorid-Dihydrat	Sigma-Aldrich	C3881-500G
Chloramphenicol	MP Biomedicals	190321
DNA Clean & Konzentrator -5	Zymo Research	D4004
Dnase I rekombinant, Rnasefrei	Roche	4716728001
EDTA Dinatriumsalz	Fisher Scientific	E/P140/48
Ethylalkohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	BA6480111
Filtrationsgerät	VWR Collection	511-0265	Ganzglas-Filtrationsgerät, mit Trichter, frittiertem Boden, Kappe, 47 mm & Oslash; Federklemme und Schliffkolben
Gel 40 (19:1)	Rotiphorese	3030.1
Gel Loading Dye, blau, 6X	New England Biolabs	E6138G
Guanosin 5′-[β,γ-imido]triphosphat-trinatriumsalzhydrat	Sigma-Aldrich	G0635-25MG
labZAP	A& A Biotechnologie	040-500
Magnesiumacetat-Tetrahydrat	Sigma-Aldrich	M5661-250G
MCE-Membranfitter	Alfatec Technology	M47MCE45GWS	Porengröße: 0,45 μm
MICROBExpress Bakterielle mRNA-Aufreinigung	Invitrogen	AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set für Illumina	New England Biolabs	E7300S
Nukleasefreies Wasser	Ambion	AM9937
Kaliumacetat wasserfrei reines P.A.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest	New England Biolabs	E7323A
RNA Clean & Konzentrator -25	Zymo Research	R1018
Natriumacetat	Sigma-Aldrich	S2889-250G
Natriumcarbonat	Sigma-Aldrich	223530-500G
Natriumhydrogencarbonat rein p.a.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	810530115
SYBR Gold-Nukleinsäure-Gel-Färbung	Life Technologies	S11494
T4 Polynukleotidkinase	New England Biolabs	M0201L
T4 Polynukleotidkinase Reaktionspuffer	New England Biolabs	B0201S
FSME-Harnstoff-Probenpuffer (2x)	Invitrogen	LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methan, ultrarein, 99,9%	AlfaAesar	J65594
Triton X-100, 98%	Acros Organics	327371000
Urea G.R.	lach:ner	40096-AP0