Quantifizierung zellulärer Dichten und antigener Eigenschaften mittels Magnetschwebebahn

Summary

Diese Arbeit beschreibt eine auf Magnetschwebenutzung basierende Methode, die spezifisch das Vorhandensein von Antigenen, entweder löslich oder membrangebunden, nachweisen kann, indem Änderungen der Levitationshöhe von Auffangperlen mit festen Dichten quantifiziert werden.

Abstract

Die beschriebene Methode wurde basierend auf den Prinzipien der Magnetschwebebahn entwickelt, die Zellen und Partikel anhand ihrer Dichte und magnetischen Eigenschaften trennt. Dichte ist eine Zelltyp-identifizierende Eigenschaft, die in direktem Zusammenhang mit seiner Stoffwechselrate, Differenzierung und seinem Aktivierungsstatus steht. Die Magnetschwebebahn ermöglicht einen einstufigen Ansatz zur erfolgreichen Trennung, Abbildung und Charakterisierung zirkulierender Blutzellen sowie zur Erkennung von Anämie, Sichelzellenanämie und zirkulierenden Tumorzellen basierend auf Dichte und magnetischen Eigenschaften. Dieser Ansatz ist auch für den Nachweis löslicher Antigene in einer Lösung geeignet, indem Sätze von Perlen niedriger und hoher Dichte verwendet werden, die mit Einfang- bzw. Nachweisantikörpern beschichtet sind. Wenn das Antigen in Lösung vorhanden ist, überbrückt es die beiden Sätze von Perlen und erzeugt einen neuen Perlen-Perlen-Komplex, der zwischen den Reihen der antikörperbeschichteten Perlen schwebt. Eine erhöhte Konzentration des Zielantigens in Lösung erzeugt im Vergleich zu niedrigeren Antigenkonzentrationen eine größere Anzahl von Perlen-Perlen-Komplexen, wodurch quantitative Messungen des Zielantigens ermöglicht werden. Die Magnetschwebebahn ist für andere Methoden aufgrund ihrer verkürzten Probenvorbereitungszeit und der fehlenden Abhängigkeit von klassischen Auslesemethoden vorteilhaft. Das erzeugte Bild kann einfach mit einem Standardmikroskop oder einem mobilen Gerät wie einem Smartphone oder einem Tablet erfasst und analysiert werden.

Introduction

Die Magnetschwebebahn ist eine Technik, die entwickelt wurde, um die Zelltypen^1,2,3,Proteine^4,5 und Opioide⁶ ausschließlich auf der Grundlage ihrer spezifischen Dichte und paramagnetischen Eigenschaften zu trennen, zu analysieren und zu identifizieren. Die Zelldichte ist eine einzigartige, intrinsische Eigenschaft jedes Zelltyps, die in direktem Zusammenhang mit seiner Stoffwechselrate und seinem Differenzierungsstatus steht^7,8

Protocol

Das in dieser Studie verwendete experimentelle Protokoll wurde vom Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB) genehmigt.

1. Geräteeinrichtung

HINWEIS: Für die Abbildung schwebender Zellen müssen zwei seltenere Neodym-Magnete, die auf der z-Achse magnetisiert sind, mit demselben Pol zueinander platziert werden, um ein Magnetfeld zu erzeugen. Der Abstand zwischen den Magneten kann in Abhängigkeit von der Intensität des Magnetfeldes und der Dichte der Ziele angepasst werden. In diesem Fall sind die Magnete durch einen 1mm Raum getrennt, der für das Einsetzen eines 50 mm langen 1x1 mm quadrat....

Results

Die Magnetschwebebahn fokussiert Objekte unterschiedlicher Dichte bei unterschiedlichen Levitationshöhen, abhängig von der Dichte des Objekts, seiner magnetischen Signatur, der Konzentration der paramagnetischen Lösung und der Stärke des Magnetfeldes, das von zwei starken Seltenerdmagneten erzeugt wird. Da die beiden Magnete übereinander angeordnet sind, können schwebende Proben unter Beibehaltung der Köhler-Beleuchtung nur mit einem zur Seite gedrehten Mikroskop betrachtet werden (Abbildung 1

Discussion

Die Gradientenzentrifugation ist derzeit die Standardtechnik zur Isolierung subzellulärer Komponenten aufgrund ihrer einzigartigen Dichten. Dieser Ansatz erfordert jedoch den Einsatz spezialisierter Gradientenmedien sowie Zentrifugenanlagen. Der hier vorgestellte Magnetschwebeansatz ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der morphologischen und funktionellen Eigenschaften zirkulierender Zellen mit minimaler, wenn überhaupt, Manipulation der Zellen, was einen nahezu in vivo-Zugang zu zirkulierenden Zellen ermö.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-Morpholino)ethansulfonsäurehydrat	Sigma Aldrich	M-2933	MES); Bestandteil des Aktivierungspuffers
50x2,5x1 mm Magnete, vernickelt (Ni-Cu-Ni) beschichtet, Sorte N52, magnetisiert durch 5 mm (0,197") Dicke	K& J Magnetics	Custom	Magnete für die Magnetschwebevorrichtung
Kapillarrohr-Dichtmittel (Critoseal)	Leica Microsystems	267620	Wird verwendet, um die Enden der Kapillarrohre zu verschließen
Zentrifugenröhrenfilter (Corning Costar Spin-X)	Sigma Aldrich	CLS8163	Wird zum Waschen von Kügelchen
verwendet Compact Lab Jack	Thorlabs	LJ750	Wird zum Einstellen der Magnetschwebevorrichtung
DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium	Gibco	14190-144	Lösung für Beadsuspensionen
Ethanolamin	Sigma Aldrich	E9508-100ML	Wird während eines Waschschritts für Kügelchen verwendet
Fluoreszierender Plasmamembran-Fleck (CellMask Green)	Invitrogen	C37608	Wird verwendet, um Rh+-Zellen
zu färben Gadoteridol InjektionsproHance		NDC 0270-1111-03	Gadolinium (Gd3+); magnetische Lösung zur Suspendierung von Zellen
HBSS++	Gibco	14025-092	Lösung zur Probenvorbereitung
Humaner C5b,6-Komplex	Komplementtechnologie, Inc	A122	Wird zur Erzeugung von Erythrozyten-Evs
Humanes C7-Protein	Complement Technology, Inc	A124	Wird zur Erzeugung von Erythrozyten-Evs
Humanes C8-Protein	Complement Technology, Inc	A125	Wird zur Erzeugung von Erythrozyten verwendet Evs
Human C9 Protein	Complement Technology, Inc	A126	Wird zur Erzeugung von Erythrozyten verwendet Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	Wird verwendet, um Magnetschwebegerät an Laborbuchsen zu befestigen
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidhydrochlorid	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC); wird in der Antikörper-Kopplungsreaktion
verwendet Normale Kaninchen-IgG-Kontrolle	Forschung & Forschung D Systems	AB-105-C	Wird zum Beschichten von Kügelchen als Kontrollbedingung verwendet
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10X Lösung, pH 7,4)	Boston Bioproducts	BM-220	Bestandteil des Kupplungspuffers, der für Waschschritte verwendet wird
Polysorbat 20 (Tween 20)	Sigma Aldrich	P7949-500ML	Bestandteil des Aktivierungspuffers
Polystyrol-Carboxylpolymer	Bangs Laboratories	PC06004	Kügelchen mit höchster Dichte (1,05 g/ml), die für die Antikörperkopplung verwendet
werden Kaninchen RhD Polyklonaler Antikörper	Invitrogen	PA5-112694	Wird verwendet, um Kügelchen zum Schutz des Rh-Faktors in roten Blutkörperchen zu beschichten
Forschungsmikroskop	Olympus	Provis AX-70	Mikroskopisch zur Montage von Magnetschwebegeräten und zur Betrachtung schwebender Zellen
Gummi-Dämpfungsfüße	Thorlabs	RDF1	Zur Unterstützung des Steckbretttisches
Square Boro Tubing	VitroTubes	8100-050	Kapillarröhrchen zum Laden der Probe in die Magnetschwebebahn
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	Zur Unterstützung der Antikörper-Kopplungsreaktion
Translational Stage	Thorlabs	PT1	Zur Fokussierung und zum Scannen des Kapillarrohrs