Gewinnung von Makrophagen aus humanen Monozyten zur Beurteilung der Infektionsrate von Leishmania braziliensis und der Immunantwort des angeborenen Wirts

Icaro Bonyek-Silva; Sara Nunes; Rana Bastos; Reinan Lima; Leilane Barbosa; Gabriela Grimaldi; Vinicius Rocha; Milena B. P. Soares; Patrícia S T Veras; Juliana de Menezes; Cláudia Brodskyn; Natalia Tavares

doi:10.3791/62555

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Methodenartikel

Gewinnung von Makrophagen aus humanen Monozyten zur Beurteilung der Infektionsrate von Leishmania braziliensis und der Immunantwort des angeborenen Wirts

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DOI:

10.3791/62555

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7. August 2021

Icaro Bonyek-Silva¹^,² , Sara Nunes¹^,² , Rana Bastos¹ , Reinan Lima¹^,² , Leilane Barbosa¹^,² , Gabriela Grimaldi¹ , Vinicius Rocha⁴ , Milena B. P. Soares¹^,⁴ , Patrícia S T Veras¹^,³ , Juliana de Menezes¹^,² , Cláudia Brodskyn¹^,²^,³ , Natalia Tavares¹^,²

¹Oswaldo Cruz Foundation, Gonçalo Moniz Institute, ²Federal University of Bahia, ³National Institute of Science and Technology (INCT), Research Institute in Immunology, ⁴Senai Institute for Innovation in Advanced Health Systems, National Service for Industrial Learning, Integrated Manufacturing and Technology Campus, SENAI - CIMATEC Salvador

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Gewinnung menschlicher Makrophagen aus Monozyten zur Infektion mit Leishmania braziliensis. Es ermöglicht Forschern auch, die Infektionsrate und Lebensfähigkeit von Parasiten, die ROS-Produktion durch Fluoreszenzmikroskopie und die Produktion von Entzündungsmediatoren in Kulturüberständen zu bewerten, um die Reaktion von Makrophagen auf eine Infektion zu untersuchen.

Zusammenfassung

Makrophagen sind multifunktionale Zellen, die für die Funktion des Immunsystems unerlässlich sind, und die primäre Wirtszelle bei einer Infektion mit Leishmania braziliensis (Lb). Diese Zellen sind auf die Erkennung von Mikroorganismen und die Phagozytose spezialisiert, aktivieren aber auch andere Immunzellen und präsentieren Antigene, sowie fördern Entzündungen und Gewebereparaturen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Gewinnung mononukleärer Zellen aus peripherem Blut (PBMC) gesunder Spender, um Monozyten zu trennen, die sich dann zu Makrophagen differenzieren. Diese Zellen können dann in vitro in verschiedenen Lb-Konzentrationen infiziert werden, um die Fähigkeit zur Kontrolle der Infektion sowie die Immunantwort der Wirtszellen zu bewerten, die mit verschiedenen Methoden gemessen werden kann. PBMCs wurden zunächst durch Zentrifugieren mit einem Ficoll-Hypaque-Gradienten isoliert und dann plattiert, damit Monozyten an Kulturplatten haften konnten. Nicht adhärente Zellen wurden durch Waschen entfernt. Als nächstes wurden adhärente Zellen 7 Tage lang mit dem Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) kultiviert, um die Makrophagendifferenzierung zu induzieren. Wir empfehlen, 2 x 10⁶ Zellen pro Well auf 24-Well-Platten zu plattieren, um 2 x 10⁵ Makrophagen zu erhalten. Vollständig differenzierte Makrophagen können dann für 4 oder 24 Stunden mit Lb infiziert werden. Dieses Protokoll führt zu einem signifikanten Prozentsatz infizierter Zellen, der durch optische oder Fluoreszenzmikroskopie beurteilt werden kann. Zusätzlich zum Infektionsindex kann die Parasitenlast gemessen werden, indem die Anzahl der Parasiten in jeder Zelle gezählt wird. Weitere molekulare und funktionelle Assays können auch in Kulturüberständen oder innerhalb der Makrophagen selbst durchgeführt werden, was es ermöglicht, dieses Protokoll in einer Vielzahl von Kontexten anzuwenden und auch an andere intrazelluläre Parasitenarten anzupassen.

Einleitung

Der intrazelluläre Protozoenparasit der Gattung Leishmania ist der Erreger eines vernachlässigten Krankheitskomplexes, der als Leishmaniose bekannt^{ist 1}. Diese Tropenkrankheiten haben ein breites Spektrum an klinischen Manifestationen, die von Hautläsionen bis hin zu Komplikationen reichen können, die sich aus der viszeralen Form der Krankheit ergeben und unbehandelt tödlich sein können. Die kutane Leishmaniose (CL) ist die häufigste Form der Leishmaniose und zeichnet sich durch eine einzelne oder wenige ulzerierte Hautläsionen mit verschlimmerter chronischer Entzündung^{aus 2}. Di....