Hier beschreiben wir eine Methode zur Visualisierung der Synaptogenese von Körnerneuronen im Kleinhirn der Maus über den zeitlichen Verlauf der postnatalen Gehirnentwicklung, wenn diese Zellen ihre synaptischen Strukturen verfeinern und Synapsen bilden, um sich in den gesamten Gehirnkreislauf zu integrieren.
Methodenartikel
Verwendung der postnatalen In-vivo-Elektroporation zur Untersuchung der Morphologie von Kleinhirngranula-Neuronen und der Synapsenentwicklung
In diesem Artikel
Erratum-Hinweis
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Neuronen verändern sich während der Entwicklung des Gehirns dynamisch in ihrer Struktur und Funktion, um geeignete Verbindungen zu anderen Zellen zu bilden. Das Kleinhirn von Nagetieren ist ein ideales System, um die Entwicklung und Morphogenese eines einzelnen Zelltyps, des Kleinhirngranula-Neurons (CGN), im Laufe der Zeit zu verfolgen. Hier wurde die In-vivo-Elektroporation von Körnerneuronen-Vorläuferzellen im sich entwickelnden Kleinhirn der Maus eingesetzt, um Zellen für nachfolgende morphologische Analysen spärlich zu markieren. Die Wirksamkeit dieser Technik zeigt sich in ihrer Fähigkeit, wichtige Entwicklungsstadien der CGN-Reifung aufzuzeigen, mit besonderem Schwerpunkt auf der Bildung von dendritischen Klauen, bei denen es sich um spezialisierte Strukturen handelt, in denen diese Zellen den Großteil ihrer synaptischen Inputs erhalten. Diese Technik liefert nicht nur Momentaufnahmen von CGN-Synapsenstrukturen während der gesamten Kleinhirnentwicklung, sondern kann auch angepasst werden, um Körnerneuronen zellautonom genetisch zu manipulieren, um die Rolle eines Gens von Interesse und seine Auswirkungen auf die CGN-Morphologie, die Klauenentwicklung und die Synaptogenese zu untersuchen.
Einleitung
Die Entwicklung des Gehirns ist ein langwieriger Prozess, der sich von der Embryogenese bis ins postnatale Leben erstreckt. Während dieser Zeit integriert das Gehirn eine Kombination aus intrinsischen und extrinsischen Reizen, die die Verdrahtung von Synapsen zwischen Dendriten und Axonen formen, um letztendlich das Verhalten zu steuern. Das Kleinhirn von Nagetieren ist ein ideales Modellsystem, um zu untersuchen, wie sich Synapsen entwickeln, da die Entwicklung eines einzelnen Neuronentyps, des Kleinhirn-Körner-Neurons (CGN), beim Übergang von einer Vorläuferzelle zu einem reifen Neuron verfolgt werden kann. Dies ist zum Teil auf die Tatsache zurückzuführen, dass sic....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
HINWEIS: Alle Verfahren wurden gemäß Protokollen durchgeführt, die vom Duke University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt wurden.
1. DNA-Vorbereitung für die In-vivo-Elektroporation oder IVE (1 Tag vor der Operation)
- Sammeln Sie die folgenden Materialien: gereinigte DNA (0,5-25 μg pro Tier), 3 M Natriumacetat, Ethanol, Fast Green-Farbstoff, hochreines destilliertes Wasser, Phosphatpufferlösung (PBS) (siehe Materialtabelle).
ANMERKUNG: Für DNA wurde ein Konstrukt, das grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter einem humanen Ubiquitin-Promotor exprimiert, aus Addgene (FUGW, https://www.a....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Abbildung 4: Analyse der Morphologie von Körnerneuronen während der Kleinhirnentwicklung. (A) Maximale Projektionsbilder von elektroporierten CGNs von 3-DPI bis 14-DPI (postnatales Alter P10 bis P21), Kernen (blau) und GFP (grün); Pfeilspitzen zeigen einzelne Dendriten an, und der Maßstabsbalken beträgt 10 μm. (B) Durchschnittliche Anzahl der Dendriten. (
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Kleinhirngranula-Neuronen sind die am häufigsten vorkommenden Neuronen im Säugetiergehirn und machen fast 60-70% der gesamten Neuronenpopulation im Nagetiergehirnaus 1,14. Das Kleinhirn wurde ausgiebig genutzt, um Mechanismen der zellulären Proliferation, Migration, Dendritenbildung und Synapsenentwicklung aufzuklären 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Die Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.) und das Summer Neuroscience Program (D.G.) der Duke University unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Betadine | Purdue Produktion | 67618-150-17 | |
| Zementiert 10 & Mikro; L-Nadel | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 Gauge, 1,27 cm (0,5 Zoll), 4-Punkt-Stil |
| Huhn Anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Unser Labor verwendet diesen Antikörper in einer Konzentration von 1:1000 |
| Applikator | |||
| Donkey Anti-Huhn Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Unser Labor verwendet diesen Antikörper in einer Konzentration von 1:500 |
| Ethanol (200 | Koptec | V1016 | |
| Elektroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatur | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma F7252-5G | ||
| FUGW Plasmid | Addgene | 14883 | |
| Objektträger | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerin | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Heizkissen | Softheat | ||
| Hoescht 33342 Fluoreszenzfarbstoff | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isofluran | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro Cover Glas | VWR | 48382-138 | |
| Nagellack | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal Ziege Serum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. Einbettmasse | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Präpariergerät | Olympus | MVX10 | |
| P200 Pipettenreichweite | Spitze Fisherbrand | 02-707-138 | Verwendet für Nadelabstandshalter |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7,4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Einfacher Neuriten-Tracer | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Anleitung | |
| Saccharose | Sigma | S0389 | |
| Chirurgische Instrumente | RWD Life Science | Kleine Schere und Pinzette | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | nichtionisches Reinigungsmittel |
| Pinzetten | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, platiniert Pinzettenelektroden |
| Ultrareines destilliertes Wasser | Invitrogen | 10977-015 | |
| Vectashield Eindeckmittel | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond Tissuekleber | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Stehend konfokal | Zeiss | 780 |
Referenzen
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. (1997).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal migration during development of the cerebellum. Frontiers in....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden
Genehmigung beantragenErratum
Formal Correction: Erratum: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development
Posted by JoVE Editors on 4/06/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 µL of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 µL of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. Please click here to view a larger version of this figure.