Immunphänotypisierung und Zellsortierung von humanen MKs aus menschlichen Primärquellen oder differenziert in vitro von hämatopoetischen Vorläufern

Summary

Hier stellen wir eine Immunphänotypisierungsstrategie zur Charakterisierung der Megakaryozytendifferenzierung vor und zeigen, wie diese Strategie die Sortierung von Megakaryozyten in verschiedenen Stadien mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer ermöglicht. Die Methodik kann auf menschliche Primärgewebe, aber auch auf Megakaryozyten angewendet werden, die in Kultur in vitroerzeugt werden.

Abstract

Die Differenzierung von Megakaryozyten (MK) umfasst eine Reihe endobiotischer Zyklen, die zu einer hochgradig polyploiden (sogar >64N reichenden) und extrem großen Zelle (40-60 μm) führen. Im Gegensatz zu dem schnell wachsenden Wissen über Megakaryopoese auf zellbiologischer und molekularer Ebene beschränkt sich die Charakterisierung der Megakaryopoese durch Durchflusszytometrie auf die Identifizierung reifer MKs mit linienspezifischen Oberflächenmarkern, während frühere MK-Differenzierungsstadien unerforscht bleiben. Hier präsentieren wir eine Immunphänotypisierungsstrategie, die die Identifizierung aufeinanderfolgender MK-Differenzierungsstufen mit zunehmendem Ploidiestatus in menschlichen Primärquellen oder In-vitro-Kulturen mit einem Panel ermöglicht, das MK-spezifische und unspezifische Oberflächenmarker integriert. Trotz ihrer Größe und Zerbrechlichkeit können MKs mit dem oben genannten Panel immunphänotypisiert und durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung unter bestimmten Druck- und Düsendurchmesserbedingungen angereichert werden. Dieser Ansatz ermöglicht Multi-Omics-Studien mit dem Ziel, die Komplexität der Megakaryopoese und der Thrombozytenproduktion beim Menschen besser zu verstehen. Eine bessere Charakterisierung der Megakaryopoese kann für die Diagnose oder Prognose von abstammungsbedingten Pathologien und Malignitäten von grundlegender Bedeutung sein.

Introduction

Megakaryozyten (MKs) entwickeln sich aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) nach einem komplexen Prozess namens Megakaryopoese, der hauptsächlich durch das Hormon Thrombopoietin (TPO) orchestriert wird. Die klassische Sicht der Megakaryopoese beschreibt die zelluläre Reise von HSCs durch eine Abfolge von hierarchischen Stadien engagierter Vorläufer und Vorläuferzellen, die letztendlich zu einem reifen MK führen. Während der Reifung erleben MKs mehrere Runden der Endomitose, entwickeln ein kompliziertes intrazelluläres Demarkationsmembransystem (DMS), das genügend Membranoberfläche für die Thrombozytenproduktion bietet, und produzieren und verpacken effizient die Füll....

Protocol

Vollblut- und Knochenmarkproben wurden gemäß der Deklaration von Helsinki von 1964 gewonnen und verarbeitet. Vollblutproben wurden von gesunden Spendern nach Erteilung der Einwilligung nach Aufklärung (ISPA) im Rahmen einer Studie gewonnen, die von unserem institutionellen medizinischen Ethikkomitee (Hospital Universitario Central de Asturias -HUCA-) genehmigt wurde. Knochenmarkproben wurden aus Knochenmarkabwurfmaterial von Patienten gewonnen, die in der Abteilung für Hämatologie des Krankenhauses Clínico San Carlos (HCSC) behandelt wurden.

Results

Knochenmark und Ploidie
In Abbildung 4zeigenwir eine repräsentative Immunphänotypisierungsanalyse der Megakaryopoese in BM-Proben (Aspiration) von Patienten. Bei der Darstellung der Zellfraktion gegen CD71 und CD31 haben wir sechs Hauptpopulationen einbezahlt: CD31^- CD71^- (rot), CD31^- CD71⁺ (blau), CD31⁺ CD71^- (orange), CD31⁺ CD71^Mid (hellgrün), CD31⁺ CD71

Discussion

Der größte Teil der Forschung, die sich auf die Untersuchung der Megakaryopoese mittels Durchflusszytometrie konzentriert, beschränkt sich bisher auf die Identifizierung von MK-Untergruppen, die nur linienspezifische Oberflächenmarker(d. H.CD42A / CD42B, CD41 / CD61) verwenden, während frühere MK-Differenzierungsstadien schlecht untersucht wurden. Im vorliegenden Artikel zeigen wir eine Immunphänotypisierungsstrategie, um eine umfassende durchflusszytometrische Charakterisierung der menschlichen Megakaryopoese a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
130 μm Düse	BD	643943	erforderlich für MK-Sortierung
5810R Zentrifuge	Eppendorf		Zellisolierung und -wäsche
A-4-62 Swing Bucket Rotor	Eppendorf		Zellisolierung und -wäsche
Aerospray Pro Hämatologie Objektträger-Färbegerät / Zytozentrifuge	ELITech Group		Automatisiertes Zytologiegerät, bei dem Objektträger mit Mat-Gr& uuml; nwald Giemsa
CO2 Inkubator Galaxy 170 S	Eppendorf		Cell Incubation
Cytospin 4 Zytozentrifuge	Thermo Scientific		Zur Vorbereitung von Cytospins
FACSAria IIu Sortierer	BD		Laser 488 nm und 633 nm
FACSCanto II Durchflusszytometer	BD		Laser 488 nm , 633 nm und 405 nm
Olympus Mikroskop BX 41	Olympus		Mikrofotografien
Olympus Mikroskop BX 61	Olympus		Mikrofotografien
Zoe Fluorescent Cell Imager	BioRad		Mikrofotografien
Zur Gewinnung von PBMCs
Lipide Cholesterinreich aus adultem Rinderserum	Sigma-Aldrich	L4646	oder ähnlich
Lymphoprep	Stammzelle Technologies	#07801	oder ähnlich
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	oder ähnlich
Rekombinantes humanes Erythropoietin (EPO)	Forschung & Forschung D Systems	287-TC-500	oder ähnlich
Rekombinanter humaner Stammzellfaktor (SCF)	Thermo Fisher Scientific, Gibco™	PHC2115	oder ähnliches
rekombinantes humanes Thrombopoietin (TPO)	Thermo Fisher Scientific, Gibco™	PHC9514	oder TPO-Rezeptoragonisten
StemSpan SFEM	Stem Cell Technologies	#09650
Durchflusszytometrie-Analysen
Rinderserumalbumin	Merck	A7906-100G	oder ähnlich
BD CompBead Anti-Maus Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	Antikörper für menschliche Zellen stammen im Allgemeinen von Mäusen.
BD Cytofix/Cytoperm	BD	554714	oder ähnlich
BD FACS Accudrop Beads	BD	345249
CD31 AF-647	BD	561654	Maus anti-human
CD31 FITC	Immunostep	31F-100T
CD34 FITC	BD	555821	Maus anti-human
CD41 PE	BD	555467	Maus anti-human
CD41 PerCP-Cy5.5	BD	333148	Maus Anti-Human-CD42A
APC	Immunostep	42AA-100T	Wir beobachteten eine unspezifische Bindung...
CD42A PE	BD		Maus Anti-Mensch
CD42B PerCP Biolegend		303910	Maus Anti-Mensch
CD49B PE	BD		Maus Anti-Mensch
CD61 FITC	BD	555753	Maus Anti-Mensch
CD71 APC-Cy7	Biolegend	334109	Maus Anti-Mensch
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Human BD Fc Block	BD	564219	Fc Blocking - Steuerung
KIT PE-Cy7	Biolegend	313212	Maus Anti-Human
Lineage Cocktail 2 FITC	BD	643397	Maus Anti-Human
RNAse	Merck	R6513	oder ähnlich
Triton X-500	Merck	93443-500ML	oder ähnlich
Zellsiebe zum Sortieren
CellTrics Filter 100 Mikrometer	Sysmex	04-004-2328	Zellsiebe
Hinweis: Wir spezifizieren keine allgemeinen Reagenzien/Chemikalien (PBS, EDTA usw.) oder Einwegartikel (Röhrchen usw.) oder Reagenzien, die in früheren veröffentlichten und Standardprotokollen spezifiziert sind - sofern nicht anders angegeben.