Nachweis der Proteinaggregation mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie

Summary

Wir führen hier ein Verfahren zur Messung von Proteinoligomeren und Aggregation in Zelllysat und lebenden Zellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ein.

Abstract

Proteinaggregation ist ein Kennzeichen neurodegenerativer Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Huntington-Krankheit (HD) und so weiter. Zur Detektion und Analyse von löslichen oder diffusen Proteinoligomeren oder Aggregaten wurde die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) verwendet, die die Diffusionsgeschwindigkeit und Helligkeit eines einzelnen Teilchens mit einer einzigen Molekülempfindlichkeit erkennen kann. Das richtige Verfahren und Know-how für den Nachweis der Proteinaggregation wurde jedoch nicht weit verbreitet. Hier zeigen wir ein Standardverfahren der FCS-Messung für Diffusionseigenschaften von aggregationsanfälligen Proteinen in Zelllysat- und Lebendzellen: ALS-assoziiertes 25 kDa-Carboxyl-Terminalfragment des TAR-DNA/RNA-bindenden Proteins 43 kDa (TDP25) und der Superoxiddismutase 1 (SOD1). Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass ein Teil der Aggregate von grünem fluoreszierendem Protein (GFP)-getaggt TDP25 leicht in den löslichen Anteil des murinen Neuroblastoms Neuro2a-Zelllysat einbezogen wurde. Darüber hinaus zeigt GFP-markierte SOD1-Mutation, die ALS-assoziierte Mutation trägt, eine langsamere Diffusion in lebenden Zellen. Dementsprechend führen wir hier das Verfahren ein, um die Proteinaggregation über ihre Diffusionseigenschaft mit FCS zu erkennen.

Introduction

Proteinaggregationen mit neurodegenerativen Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit, und so weiter¹ sind als toxisch bekannt und würden Proteinhomöostase (Proteostase) in den Zellen und Organen stören, die dann zum Altern führen könnte². Die Clearance der Proteinaggregation wird als therapeutische Strategie erwartet; Chemikalien, die die Bildung von Proteinaggregationen verhindern und Proteinaggregate abbauen (z. B. kleine Moleküle oder Medikamente), sind jedoch noch nicht etabliert. Darüber hinaus bleibt die Art und Weise, wie die Proteinaggregation Toxizität ausübt, schwer fassbar. Daher ist es zur Förderung von Forschungsprojekten im Zusammenhang mit der Proteinaggregation wichtig, Verfahren mit hohem Durchsatz einzuführen, um die Proteinaggregation einfach zu erkennen. Der Proteinaggregationsnachweis mit Antikörpern, die die Konformation von Proteinaggregation und aggregationsspezifischem Fluoreszenzfarbstoff erkennen, wurde weit verbreitet³. Es ist jedoch schwierig, die Aggregation zu erkennen, insbesondere in lebenden Zellen mit solchen klassischen Verfahren.

Förster Resonanzenergietransfer (FRET) ist ein Verfahren zur Erkennung von Proteinaggregation und Strukturwandel. FRET ist jedoch nicht in der Lage, die Proteindynamik zu analysieren (z. B. Diffusion und Oligomerisierung von Proteinen in lebenden Zellen)³. Daher führen wir hier ein einfaches Protokoll zum Nachweis der Proteinaggregation in Lösung (z.B. Zelllysat) und lebenden Zellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ein, das die Diffusionseigenschaft und Helligkeit fluoreszierender Moleküle mit einzelmolekularer Empfindlichkeit⁴misst. FCS ist eine Photonenzählmethode mit einem Laserscan-Konfokalmikroskop (LSM). Mit Hilfe eines hochempfindlichen Photonendetektors und der Berechnung der Autokorrelationsfunktion (ACF) der Photonenankunftszeit wird der Durchlauf von Zeit und Helligkeit der Fluoreszenzmoleküle im Nachweisvolumen gemessen. Die Diffusion verlangsamt sich mit einer Erhöhung des Molekulargewichts; daher kann die intermolekulare Interaktion mit FCS geschätzt werden. Noch stärker ist, dass eine Erhöhung der Helligkeit des fluoreszierenden Moleküls auf eine Homo-Oligomerisierung der Moleküle hindeutet. Daher ist FCS ein leistungsfähiges Werkzeug, um eine solche Proteinaggregation zu erkennen.

Protocol

1. Materialien und Reagenzien

1. Verwenden Sie pyrogene freie Lösungen und Medium für die Zellkultur (Tabelle 1).
2. Bereiten Sie Lösungen für das biochemische Experiment mit Reinstwasser vor und verwenden Sie als DNase/RNase frei.
3. Wählen Sie einen geeigneten FBS für die Zellkultur mit einem Chargenprüfungsprozess aus. Da sich das ausgewählte FBS-Los regelmäßig ändert, können der Katalog und die Chargennummer für FBS hier nicht dargestellt werden.
4. Plasmid-DNA
   1. Vorbereiten von pmeGFP-N1⁵ für eGFP-Monomerexpression; pmeGFP-C1-TDP25⁶ für GFP-TDP25-Ausdruck; pmeGFP-N1-SOD1-G85R⁷ für SOD1-G85R-GFP-Ausdruck; und pCAGGS⁸ als Träger.
      HINWEIS: meGFP ist eine monomere Variante, die eine A206K-Mutation des verbesserten GFP (eGFP) trägt. TDP25 ist ein ALS-assoziiertes C-Terminal-Fragment von TDP-43. SOD1-G85R ist eine ALS-assoziierte Mutation von SOD1.
5. Zellstamm
   1. Verwenden Sie das murine Neuroblastom Neuro2a Zellen.
      HINWEIS: Neuro2a-Zellen haben eine hohe Transfektionseffizienz und hochexpressige exogene Proteine. Für die TDP25-Expression sind Zellstämme mit hoher Expressionseffizienz erforderlich, z. B. Neuro2a- oder HEK293-Zellen. In HeLa-Zellen konnte TDP25 nicht effizient exprimiert werden.

2. Zellkultur und Transfektion

1. Bereiten Sie eine 100 mm Kunststoffschale, die Neuro2a-Zellen halbkonfluent in normalem Wachstumsmedium anwächst.
   HINWEIS: Es ist notwendig, bei 37 °C für ca. 48-72 Stunden nach der vorherigen Aussaat zu inkubieren, bis die Halbkonfluenz erreicht ist.
2. Entfernen Sie das Medium.
3. 0,5 ml Trypsin-EDTA-Lösung in die Zellkulturschale geben und bei 37 °C für 1 min inkubieren.
4. Fügen Sie 9,5 ml normales Wachstumsmedium in die Schale und hängen die abgetrennten Zellen.
5. Mit Trypan blue, um die abgestorbenen Zellen zu färben, zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler oder manuell. Verdünnen Sie dann die Zellen im Kulturmedium (1,0 × 10⁵/ml).
6. Fügen Sie 2 ml Zellsuspension in eine 35 mm Kunststoffschale für die Zelllyse oder eine Glas-Basisschale für die Live-Zell-Messung.
7. Inkubieren Sie das Gericht bei 37 °C für 1 Tag.
8. Beginnen Sie die folgenden Vorbereitungen 15 Minuten vor dem Tag der Transfektion.
9. Bereiten Sie zwei 1,5 ml-Rohre vor und fügen Sie jedem Rohr 100 l Opti-MEM I hinzu.
10. Mischen Sie in der ersten Röhre 1,0 g Plasmid-DNA (Lösung A). Mischen Sie in der zweiten Röhre 2,5 l Lipofectamin 2000 (Lösung B).
    HINWEIS: Um die Transfektionseffizienz aufrechtzuerhalten, halten Sie die gesamte DNA-Menge gleich. Um den Expressionspegel für die FCS-Messung in lebenden Zellen zu reduzieren, sollte die Bruchmenge der Plasmid-DNA für die Proteinexpression abnehmen (z. B. 0,2 g pmeGFP-N1-SOD1-G85R und 0,8 g pCAGGS-Gemisch). Darüber hinaus halten Sie das gleiche Verhältnis zwischen dem Volumen von Lipofectamin 2000 und der Menge der Plasmid-DNA.
11. Mischen Sie Lösung A und B vorsichtig, indem Sie eine in eine der beiden Rohre geben, und inkubieren Sie sie dann 1 min bei Raumtemperatur (Lösung C).
12. Fügen Sie die Lösung C zum Kulturmedium hinzu; und inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 37 °C.

3. Zelllyse & Mittlerer Austausch

1. Überprüfen Sie die GFP-Expression mit einem Routinemikroskop.
2. Entfernen Sie das Medium in der Schale.
3. Fügen Sie 2 ml PBS bei 25 °C hinzu, um das Medium auszuwaschen. Entfernen Sie die PBS.
4. Legen Sie die Schale auf eine Aluminiumplatte auf dem zerkleinerten Eis.
   HINWEIS: Wir verwenden eine 1 mm dicke Aluminiumplatte, die in einem Sonntagswerkzeuggeschäft geschnitten oder kommerziell erhältlich ist, als Laborausrüstung.
5. Fügen Sie 200 L Lysepuffer bei 4 °C hinzu. Schütteln Sie die Schale leicht, so dass der Puffer gleichmäßig an der Unterseite der Schale verteilt ist.
6. Zerkleinern Sie die Schale mit einem Zellschaber und erholen Sie das Lysat mit ungelöstem Zellabfall in einem neuen 1,5 ml Rohr.
7. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 20.400 x g für 5 Minuten bei 4 °C.
8. Den Überstand in einem neuen 1,5 ml-Rohr wiederherstellen und bei 4 °C oder auf Eis aufbewahren.
   HINWEIS: Lassen Sie das Lysat nicht einfrieren.
9. Ersetzen Sie bei Live-Zellmessungen das Medium vor der Messung. Überprüfen Sie die Zellbefestigung mit einem Phasenkontrastmikroskop. Bestätigen Sie die Expression mit einem Fluoreszenzmikroskop.

4. Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) Kalibrierung

1. Starten Sie das System, und führen Sie die Betriebssoftware aus. Schalten Sie den Argon⁺ Laser ein (458/477/488/514 nm). Stabilisieren Sie das System mindestens für 30 min.
2. Einrichten des optischen Pfads: Hauptstrahlteiler: HFT488; Dichroischer Spiegel: NFT600; Fluoreszenz-Barrierefilter: Bandpassfilter 505-540 (BP505-540); Detektor: Lawinenphotodiode (APD)).
3. Stellen Sie die Lochgröße ein, indem Sie den Wert direkt eingeben (66 m; 1 luftige Einheit).
4. Fügen Sie die Rhodamine 6G (Rh6G) Lösung in einen Brunnen der Abdeckung Glaskammer auf der Bühne.
5. Fügen Sie das Tauch-Ultrareinstwasser auf das Ziel. Verwenden Sie das Tauchöl nicht.
6. Stellen Sie die Kammer auf die Mikroskopstufe. Verschieben Sie die Bühne an die entsprechende Position.
7. Konzentrieren Sie sich auf die obere Glasoberfläche, indem Sie das Streulicht von der Glasoberfläche messen. Nachdem Sie die Objektivlinse nach unten gesenkt haben, drehen Sie den Fokusknopf im Uhrzeigersinn, um ihn anzupassen.
   HINWEIS: Überprüfen Sie die Drehrichtung des Fokusknopfes, da er sich gegenüber denen aus Japan und Deutschland befindet.
8. Heben Sie den Brennpunkt 200 m über der oberen Glasoberfläche an, um das Innere der Lösung zu beobachten.
9. Klicken Sie auf die Zählrate, und überwachen Sie die Photonenanzahl.
10. Schrittweise erhöhen Sie den akusto-optischen Abstimmfilterwert (AOTF) (z.B. Anregungslaserübertragung), so dass der Zählratewert mehr als 10 kHz beträgt.
11. Klicken Sie auf die Pinhole-Anpassung und öffnen Sie den Pinhole-Anpassungs-Assistenten. Finden Sie die Lochposition mit der höchsten (Spitzen-) Anzahl von Photonen in der x- und y-Achse.
12. Drehen Sie den Korrekturring der Objektivlinse so, dass die Anzahl pro Molekül (CPM) am höchsten ist.
    HINWEIS: Da die Dicke des Abdeckglases der hier angegebenen Kammer 0,12-0,17 mm beträgt, ist der Korrekturring um sein Minimum oder nur wenige Umdrehungen von ihm entfernt, wo der CPM sein Maximum hat.
13. Verringern Sie den AOTF-Wert schrittweise, sodass der CPM-Wert zu 2-3 kHz wird.
14. Erwerben Sie die Autokorrelationsfunktion (ACF) von Rh6G für 90 s.
15. Sobald die Messung abgeschlossen ist, klicken Sie auf Anpassen, um eine Kurvenanpassungsanalyse durchzuführen.
16. Wählen Sie ein Modell für eine Komponente dreidimensionale (3D) Diffusion mit einem Triplet-Zustand.
    HINWEIS: Der Rh6G ist monodisperse und einkomponentdiffierend mit einem Triplet-Zustand.
17. Legen Sie die passende Startzeit fest, indem Sie die rote Linie verschieben. Klicken Sie auf Alle anpassen, und überprüfen Sie die Anpassungsabweichung. Stellen Sie nach der Kurvenanpassung sicher, dass die Diffusionszeit (DT) und der Strukturparameter (SP) ungefähr im Bereich von 20-30 s bzw. 4-8 liegen.
18. Denken Sie an den Wert des strukturellen Parameters. Verwenden Sie den SP-Wert für die Kurvenanpassungsanalyse aller ACFs, die am selben Tag unter den gleichen optischen Bedingungen gemessen wurden, und verwenden Sie die gleiche Art von Glasgrundschale oder Kammerabdeckungsglas, das auf der Mikroskopbühne eingestellt ist.

5. FCS-Messung im Zelllysat

1. Bereiten Sie die Zelllysate vor (siehe oben).
2. Legen Sie das Lysat auf die Abdeckung Glaskammer. Legen Sie einen Deckel, um eine Trocknung zu vermeiden und den Bühnendeckel für die leichte Beschattung.
3. Stellen Sie den Erfassungszustand, die Laserleistung, die Messzeit und Wiederholungen ein.
4. Klicken Sie auf Count Rate, und passen Sie den AOTF-Wert des Lasers so an, dass der CPM-Wert mehr als 1 kHz wird.
5. Führen Sie eine Testmessung für 1 min durch. Prüfen Sie, ob der berechnete ACF eine positive Amplitude und einen glatten Zerfall anzeigt.
6. Führen Sie die Hauptmessung für 5 min durch.
   HINWEIS: Die Gesamtmesszeit wird schrittweise erhöht, bis sich die Form des ACF nicht ändert, selbst wenn die Messzeit erhöht wird.
7. Klicken Sie auf Anpassen, um eine Kurvenanpassungsanalyse durchzuführen.
8. Wählen Sie ein Modell für die zweikomponentige 3D-Diffusion mit einem Triplet-Zustand aus. Denken Sie daran, den SP-Wert einzugeben und ändern Sie seine Einstellung in "Fixed" nicht "Free", bevor Sie auf Alle anpassen klicken.
9. Exportieren Sie die angepasste Tabelle als durch Tabulatoren getrennte Textdatei.
10. Exportieren Sie ggf. den ACF- und Count-Rate-Datensatz als textdatei durch Tabs.

6. FCS-Messung in lebenden Zellen

1. Ersetzen Sie das Medium vor der Messung durch ein frisches Medium.
2. Verwenden Sie einen Wärmestufen-Inkubator. Stellen Sie die Zellkulturschale auf die Mikroskopbühne.
3. Bestätigen Sie den Fokus und die Position mit der konfokalen Mikrope. Wählen Sie die Messzelle aus. Vergrößern Sie die Zellenposition, und passen Sie sie an. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder einer GFP-exezierenden Zelle im langsamen Scangeschwindigkeitsmodus.
4. Wählen Sie eine FCS-Messposition mit Position im Abschnitt "FCS" aus.
5. Wählen Sie mindestens einen FCS-Messpunkt mit einem Fadenkreuz aus (Abbildung 1).
6. Messen Sie den ACF für 1 min.
   HINWEIS: Da fluoreszierende Proteine aufgrund einer langsamen Bewegung im Vergleich zur Lösung in lebenden Zellen photobleached werden, sollte die Messzeit minimal sein. Es ist in der Regel schwierig, ACF in der Zelle so reibungslos wie Lösungsmessungen zu erhalten, da eine längere Messung zu Photobleichungen von fluoreszierenden Proteinen führt.
7. Klicken Sie auf Anpassen, um eine Kurvenanpassungsanalyse mit einem Modell für die zweikomponentige 3D-Diffusion mit einem Triplet-Zustand durchzuführen.
   HINWEIS: Bei Live-Zellmessungen wäre ein Modell für die zweikomponentige 3D-Diffusion mit einem Triplet-Zustand besser, da es empirisch schwierig ist, den Chi-Quadratwert mit einem Einkomponenten-3D-Diffusionsmodell zu verringern, da verschiedene mobile Komponenten in der Lebenden Zelle vorhanden sind. Aber auch bei einem Modell für die Dreikomponenten-3D-Diffusion sind die Diffusionskomponenten im Vergleich zur Verwendung des Modells für Zweikomponenten in der Regel nicht getrennt.

Results

Wir führten die FCS-Messung von GFP-TDP25 in Zelllysat und SOD1-G85R-GFP in lebenden Zellen durch. In beiden Fällen konnten eine positive Amplitude und glatte ACFs erworben werden. Wir haben gezeigt, dass ein Teil von GFP-TDP25, ausgedrückt in Neuro2a-Zellen, in der löslichen Fraktion unter der angegebenen Bedingung⁶zurückgewonnen wurde. Im löslichen Anteil des Zelllysats wurden extrem helle Fluoreszenzmoleküle im Photonenzählratenrekord mit FCS nachgewiesen(Abbildung 2A

Discussion

In Bezug auf die Systemkalibrierung vor Messungen sollten die gleichen Glaswaren verwendet werden, die zur Messung der Probe verwendet wurden (z. B. die 8-Wells-Abdeckungglaskammer für Zelllysat und die 35-mm-Glas-Basisschale für lebende Zellen). Aufgrund der Adsorption von Rh6G auf dem Glas kann seine effektive Konzentration manchmal abnehmen. In diesem Fall sollte eine hochkonzentrierte Rh6G-Lösung, wie z. B. 1 m, nur für die Lochverstellung verwendet werden. Zum Schutz des Detektors (z. B. mehr als 1000 kHz) müssen ex...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 % (w/v) Trypsin-1 mmol / l EDTA & Middot; 4Na-Lösung mit Phenolrot (Trypsin-EDTA)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
100-mm-Kunststoffschalen	CORNING	430167
35-mm-Glasbodenschale	IWAKI	3910-035	Für die Messung von lebenden Zellen
35-mm-Kunststoffschalen	Thermo Fisher Scientific	150460
Aluminiumplatte	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1,2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Carl Zeiss		Objektiver
Zellenabstreifer	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-93100
Celluloseacetat-Filtermembran (0,22 mm)	Advantech Toyo	25CS020AS
Deckglaskammer 8-Wells	IWAKI	5232-008	Für die Lösungsmessung
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	Basalmedium
Fötales Rinderserum (FBS)	Biosere		Chargenprüfung erforderlich
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		FCS-System
Maus-Neuroblastom Neuro2a-Zellen	ATCC	CCL-131	Zelllinie
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	Plasmid-DNA für den Transfektionsträger
Penicillin-Streptomycin-Lösung (&mal; 100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			Plasmid-DNA für TDP25, markiert mit monomerem eGFP
pmeGFP-N1			Plasmid-DNA für die eGFP-Monomer-Expression
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			Plasmid-DNA für ALS-verknüpfte G85R-Mutante von SOD1, markiert mit monomerem
	Sigma-Aldrich	P8304