Methodenartikel

Nachweis der Proteinaggregation mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie

DOI:

10.3791/62576

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25. April 2021

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1Laboratory for Molecular Cell Dynamics, Faculty of Advanced Life Science, Hokkaido University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir führen hier ein Verfahren zur Messung von Proteinoligomeren und Aggregation in Zelllysat und lebenden Zellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ein.

Zusammenfassung

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Proteinaggregation ist ein Kennzeichen neurodegenerativer Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Huntington-Krankheit (HD) und so weiter. Zur Detektion und Analyse von löslichen oder diffusen Proteinoligomeren oder Aggregaten wurde die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) verwendet, die die Diffusionsgeschwindigkeit und Helligkeit eines einzelnen Teilchens mit einer einzigen Molekülempfindlichkeit erkennen kann. Das richtige Verfahren und Know-how für den Nachweis der Proteinaggregation wurde jedoch nicht weit verbreitet. Hier zeigen wir ein Standardverfahren der FCS-Messung für Diffusionseigenschaften von aggregationsanfälligen Proteinen in Zelllysat- und Lebendzellen: ALS-assoziiertes 25 kDa-Carboxyl-Terminalfragment des TAR-DNA/RNA-bindenden Proteins 43 kDa (TDP25) und der Superoxiddismutase 1 (SOD1). Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass ein Teil der Aggregate von grünem fluoreszierendem Protein (GFP)-getaggt TDP25 leicht in den löslichen Anteil des murinen Neuroblastoms Neuro2a-Zelllysat einbezogen wurde. Darüber hinaus zeigt GFP-markierte SOD1-Mutation, die ALS-assoziierte Mutation trägt, eine langsamere Diffusion in lebenden Zellen. Dementsprechend führen wir hier das Verfahren ein, um die Proteinaggregation über ihre Diffusionseigenschaft mit FCS zu erkennen.

Einleitung

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Proteinaggregationen mit neurodegenerativen Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit, und so weiter1 sind als toxisch bekannt und würden Proteinhomöostase (Proteostase) in den Zellen und Organen stören, die dann zum Altern führen könnte2. Die Clearance der Proteinaggregation wird als therapeutische Strategie erwartet; Chemikalien, die die Bildung von Proteinaggregationen verhindern und Proteinaggregate abbauen (z. B. kleine Moleküle oder Medikamente), sind jedoch noch nicht etabliert. Darüber hinaus bleibt die Art und Weise, wie die Proteinaggregati....

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Protokoll

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1. Materialien und Reagenzien

  1. Verwenden Sie pyrogene freie Lösungen und Medium für die Zellkultur (Tabelle 1).
  2. Bereiten Sie Lösungen für das biochemische Experiment mit Reinstwasser vor und verwenden Sie als DNase/RNase frei.
  3. Wählen Sie einen geeigneten FBS für die Zellkultur mit einem Chargenprüfungsprozess aus. Da sich das ausgewählte FBS-Los regelmäßig ändert, können der Katalog und die Chargennummer für FBS hier nicht dargestellt werden.
  4. Plasmid-DNA
    1. Vorbereiten von pmeGFP-N15 für eGFP-Monomerexpression; pmeGFP-C1-TDP256 für GFP-TDP25-Ausdruck; pmeGFP-N1....

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Ergebnisse

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Wir führten die FCS-Messung von GFP-TDP25 in Zelllysat und SOD1-G85R-GFP in lebenden Zellen durch. In beiden Fällen konnten eine positive Amplitude und glatte ACFs erworben werden. Wir haben gezeigt, dass ein Teil von GFP-TDP25, ausgedrückt in Neuro2a-Zellen, in der löslichen Fraktion unter der angegebenen Bedingung6zurückgewonnen wurde. Im löslichen Anteil des Zelllysats wurden extrem helle Fluoreszenzmoleküle im Photonenzählratenrekord mit FCS nachgewiesen(Abbildung 2A

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Diskussion

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In Bezug auf die Systemkalibrierung vor Messungen sollten die gleichen Glaswaren verwendet werden, die zur Messung der Probe verwendet wurden (z. B. die 8-Wells-Abdeckungglaskammer für Zelllysat und die 35-mm-Glas-Basisschale für lebende Zellen). Aufgrund der Adsorption von Rh6G auf dem Glas kann seine effektive Konzentration manchmal abnehmen. In diesem Fall sollte eine hochkonzentrierte Rh6G-Lösung, wie z. B. 1 m, nur für die Lochverstellung verwendet werden. Zum Schutz des Detektors (z. B. mehr als 1000 kHz) müssen ex.......

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Offenlegungen

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Diese Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

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A.K. wurde von einer Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), durch ein Stipendium der Nakatani Foundation for Countermeasures against novel coronavirus infections, durch ein Stipendium des Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station) und ein Stipendium der Hoansha Foundation unterstützt. M. K. wurde teilweise durch ein JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems" (#20H04686) und ein JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Information Physics of living matters" (#20H05522) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % (w/v) Trypsin-1 mmol / l EDTA & Middot; 4Na-Lösung mit Phenolrot (Trypsin-EDTA)Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.201-16945
100-mm-KunststoffschalenCORNING430167
35-mm-GlasbodenschaleIWAKI3910-035Für die Messung von lebenden Zellen
35-mm-KunststoffschalenThermo Fisher Scientific150460
AluminiumplatteBio-BikAB-TC1
C-Apochromat 40x/1,2NA Korr. UV-VIS-IR M27Carl ZeissObjektiver
ZellenabstreiferSumitomo Bakelite Co., Ltd.MS-93100
Celluloseacetat-Filtermembran (0,22 mm)Advantech Toyo25CS020AS
Deckglaskammer 8-WellsIWAKI5232-008Für die Lösungsmessung
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796Basalmedium
Fötales Rinderserum (FBS)BiosereChargenprüfung erforderlich
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019
LSM510 META + ConfoCor3Carl ZeissFCS-System
Maus-Neuroblastom Neuro2a-ZellenATCCCCL-131Zelllinie
Opti-MEM IThermo Fisher Scientific31985070
pCAGGSRIKENRDB08938Plasmid-DNA für den Transfektionsträger
Penicillin-Streptomycin-Lösung (&mal; 100 )Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.168-23191
pmeGFP-C1-TDP25Plasmid-DNA für TDP25, markiert mit monomerem eGFP
pmeGFP-N1Plasmid-DNA für die eGFP-Monomer-Expression
pmeGFP-N1-SOD1-G85RPlasmid-DNA für ALS-verknüpfte G85R-Mutante von SOD1, markiert mit monomerem
Sigma-AldrichP8304
eGFP-Protease-Inhibitor-Cocktail

Referenzen

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  1. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
  2. Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-....

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Schlagwörter

Neurodegenerative ErkrankungenDiffusionseigenschaftenZelllysatLebendzellmessungGFP markierte ProteineCurve Fitting AnalyseKonfokalmikroskopiel sliche Oligomere

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