Nachweis der Proteinaggregation mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie

Summary

Wir führen hier ein Verfahren zur Messung von Proteinoligomeren und Aggregation in Zelllysat und lebenden Zellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ein.

Abstract

Proteinaggregation ist ein Kennzeichen neurodegenerativer Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Huntington-Krankheit (HD) und so weiter. Zur Detektion und Analyse von löslichen oder diffusen Proteinoligomeren oder Aggregaten wurde die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) verwendet, die die Diffusionsgeschwindigkeit und Helligkeit eines einzelnen Teilchens mit einer einzigen Molekülempfindlichkeit erkennen kann. Das richtige Verfahren und Know-how für den Nachweis der Proteinaggregation wurde jedoch nicht weit verbreitet. Hier zeigen wir ein Standardverfahren der FCS-Messung für Diffusionseigenschaften von aggregationsanfälligen Proteinen in Zelllysat- und Lebendzellen: ALS-assoziiertes 25 kDa-Carboxyl-Terminalfragment des TAR-DNA/RNA-bindenden Proteins 43 kDa (TDP25) und der Superoxiddismutase 1 (SOD1). Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass ein Teil der Aggregate von grünem fluoreszierendem Protein (GFP)-getaggt TDP25 leicht in den löslichen Anteil des murinen Neuroblastoms Neuro2a-Zelllysat einbezogen wurde. Darüber hinaus zeigt GFP-markierte SOD1-Mutation, die ALS-assoziierte Mutation trägt, eine langsamere Diffusion in lebenden Zellen. Dementsprechend führen wir hier das Verfahren ein, um die Proteinaggregation über ihre Diffusionseigenschaft mit FCS zu erkennen.

Introduction

Proteinaggregationen mit neurodegenerativen Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit, und so weiter¹ sind als toxisch bekannt und würden Proteinhomöostase (Proteostase) in den Zellen und Organen stören, die dann zum Altern führen könnte². Die Clearance der Proteinaggregation wird als therapeutische Strategie erwartet; Chemikalien, die die Bildung von Proteinaggregationen verhindern und Proteinaggregate abbauen (z. B. kleine Moleküle oder Medikamente), sind jedoch noch nicht etabliert. Darüber hinaus bleibt die Art und Weise, wie die Proteinaggregati....

Protocol

1. Materialien und Reagenzien

1. Verwenden Sie pyrogene freie Lösungen und Medium für die Zellkultur (Tabelle 1).
2. Bereiten Sie Lösungen für das biochemische Experiment mit Reinstwasser vor und verwenden Sie als DNase/RNase frei.
3. Wählen Sie einen geeigneten FBS für die Zellkultur mit einem Chargenprüfungsprozess aus. Da sich das ausgewählte FBS-Los regelmäßig ändert, können der Katalog und die Chargennummer für FBS hier nicht dargestellt werden.
4. Plasmid-DNA
   1. Vorbereiten von pmeGFP-N1⁵ für eGFP-Monomerexpression; pmeGFP-C1-TDP25⁶ für GFP-TDP25-Ausdruck; pmeGFP-N1....

Results

Wir führten die FCS-Messung von GFP-TDP25 in Zelllysat und SOD1-G85R-GFP in lebenden Zellen durch. In beiden Fällen konnten eine positive Amplitude und glatte ACFs erworben werden. Wir haben gezeigt, dass ein Teil von GFP-TDP25, ausgedrückt in Neuro2a-Zellen, in der löslichen Fraktion unter der angegebenen Bedingung⁶zurückgewonnen wurde. Im löslichen Anteil des Zelllysats wurden extrem helle Fluoreszenzmoleküle im Photonenzählratenrekord mit FCS nachgewiesen(Abbildung 2A

Discussion

In Bezug auf die Systemkalibrierung vor Messungen sollten die gleichen Glaswaren verwendet werden, die zur Messung der Probe verwendet wurden (z. B. die 8-Wells-Abdeckungglaskammer für Zelllysat und die 35-mm-Glas-Basisschale für lebende Zellen). Aufgrund der Adsorption von Rh6G auf dem Glas kann seine effektive Konzentration manchmal abnehmen. In diesem Fall sollte eine hochkonzentrierte Rh6G-Lösung, wie z. B. 1 m, nur für die Lochverstellung verwendet werden. Zum Schutz des Detektors (z. B. mehr als 1000 kHz) müssen ex.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 % (w/v) Trypsin-1 mmol / l EDTA & Middot; 4Na-Lösung mit Phenolrot (Trypsin-EDTA)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
100-mm-Kunststoffschalen	CORNING	430167
35-mm-Glasbodenschale	IWAKI	3910-035	Für die Messung von lebenden Zellen
35-mm-Kunststoffschalen	Thermo Fisher Scientific	150460
Aluminiumplatte	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1,2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Carl Zeiss		Objektiver
Zellenabstreifer	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-93100
Celluloseacetat-Filtermembran (0,22 mm)	Advantech Toyo	25CS020AS
Deckglaskammer 8-Wells	IWAKI	5232-008	Für die Lösungsmessung
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	Basalmedium
Fötales Rinderserum (FBS)	Biosere		Chargenprüfung erforderlich
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		FCS-System
Maus-Neuroblastom Neuro2a-Zellen	ATCC	CCL-131	Zelllinie
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	Plasmid-DNA für den Transfektionsträger
Penicillin-Streptomycin-Lösung (&mal; 100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			Plasmid-DNA für TDP25, markiert mit monomerem eGFP
pmeGFP-N1			Plasmid-DNA für die eGFP-Monomer-Expression
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			Plasmid-DNA für ALS-verknüpfte G85R-Mutante von SOD1, markiert mit monomerem
	Sigma-Aldrich	P8304