Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

שימוש בריצוף הדור הבא כדי לזהות מוטציות הקשורות לתיקון של שבר גדיל כפול המושרה על ידי CAS9 ליד מקדם CD4

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/62583
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 2,3
1Division of Biology, Kansas State University, 2Kansas State Veterinary Diagnostic Laboratory, Kansas State University, 3Department of Diagnostic Medicine/Pathobiology, Kansas State University
* These authors contributed equally

Summary

מוצג כאן sgRNA/CAS9 endonuclease ופרוטוקול ריצוף מהדור הבא שניתן להשתמש בו כדי לזהות את המוטציות הקשורות לתיקון שבר גדיל כפול ליד מקדם CD4.

Abstract

שברים של גדיל כפול (DSBs) בדנ"א הם הסוג הציטוטוקסי ביותר של נזק לדנ"א. מאחר ששלל עלבונות יכולים לגרום לנגעים אלה (למשל, מתח שכפול, קרינה מייננת, נזקי UV לא מתוקנים), DSBs מתרחשים ברוב התאים בכל יום. בנוסף למוות תאי, DSBs שלא עודכנו מפחיתים את שלמות הגנום והמוטציות המתקבלות יכולות להניע גידולים סרטניים. סיכונים אלה ושכיחותם של DSBs מניעים חקירות של המנגנונים שבאמצעותם תאים מתקנים נגעים אלה. ניתן לשלב את ריצוף הדור הבא עם אינדוקציה של DSBs על ידי קרינה מייננת כדי לספק כלי רב עוצמה להגדרה מדויקת של המוטציות הקשורות לפגמים בתיקון DSB. עם זאת, גישה זו דורשת ריצוף גנום שלם מאתגר מבחינה חישובית ועלותית כדי לזהות את התיקון של ה-DSBs המתרחשים באופן אקראי הקשורים לקרינה מייננת. אנדונוקליזות חיתוך נדירות, כגון I-Sce1, מספקות את היכולת ליצור DSB יחיד, אך יש להכניס את אתרי הזיהוי שלהן לגנום המעניין. כתוצאה מכך, אתר התיקון הוא מלאכותי מטבעו. ההתקדמות האחרונה מאפשרת ל-RNA מנחה (sgRNA) לכוון אנדונוקלאז Cas9 לכל מוקד גנום שמעניין אותו. ניתן ליישם זאת במחקר של תיקון DSB שהופך את ריצוף הדור הבא לחסכוני יותר בכך שהוא מאפשר להתמקד בדנ"א האגף ל-DSB המושרה על ידי Cas9. מטרת כתב היד היא להדגים את ההיתכנות של גישה זו על ידי הצגת פרוטוקול שיכול להגדיר מוטציות הנובעות מתיקון של DSB במעלה הזרם של הגן CD4. ניתן להתאים את הפרוטוקול כדי לקבוע שינויים בפוטנציאל המוטאגני של DSB הקשורים לגורמים אקסוגניים, כגון מעכבי תיקון, ביטוי חלבונים ויראליים, מוטציות וחשיפות סביבתיות עם דרישות חישוב מוגבלות יחסית. לאחר ריצוף הגנום של אורגניזם, ניתן להשתמש בשיטה זו באופן תיאורטי בכל לוקוס גנומי ובכל מודל תרבית תאים של אותו אורגניזם שניתן לבצע טרנספקטציה. התאמות דומות של הגישה יכולות לאפשר השוואות של נאמנות תיקון בין מוקדים שונים באותו רקע גנטי.

Introduction

שמירה על יציבות גנומית היא קריטית עבור כל האורגניזמים החיים. שכפול דנ"א מדויק ותגובת נזק חזקה לדנ"א (DDR) נחוצים כדי להפיץ בנאמנות את החומר הגנטי 1,2. נזקי דנ"א מתרחשים באופן קבוע ברוב התאים 2,3. כאשר חשים נזקים אלה, התקדמות מחזור התאים נעצרת, ומנגנוני תיקון הדנ"א מופעלים. שברים של גדילים כפולים בדנ"א או ב-DSBs הם הסוג הרעיל והמוטגני ביותר של נזק לדנ"א 3,4.

בעוד שכמה מסלולי איתות DDR יכולים לתקן נגעים אלה, מסלולי תיקון DSB שנחקרו ביסודיות הרבה ביותר הם רקומבינציה הומולוגית (HR) והצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ). HR הוא מסלול נטול שגיאות ברובו, המתקן DSB באמצעות כרומטיד אחות כתבנית הומולוגית. זה נוטה לקרות בשלב S ובשלב G2 של מחזור התא 5,6,7. NHEJ מועד יותר לשגיאות, אבל זה יכול לקרות לאורך כל מחזור התא 8,9. מבחני כתבים שונים פותחו כדי למדוד את היעילות של מנגנוני תיקון ספציפיים 10,11,12. מבחנים אלה נוטים להסתמך על ציטומטריית זרימה למדידת תפוקה גבוהה של פעילות מסלול תיקון DSB באמצעות GFP או mCherry כקריאה11,13. למרות שהם יעילים מאוד, הם מסתמכים על תיקון קנוני המתרחש ב- DSB שהוכנס באופן מלאכותי.

ישנן מגוון שיטות אחרות המשמשות לחקר תיקון DSB. רבים מהם מסתמכים על מיקרוסקופיה אימונו-פלואורסצנטית (IF) 1,14. אם מיקרוסקופיה מזהה מוקדים גרעיניים בדידים המייצגים את מתחמי התיקון לאחר ש-DSBs מושרים על ידי חשיפה לכימיקלים גנוטוקסיים או קרינה מייננת15,16. מעקב אחר היווצרותם ופתרונן של מוקדים אלה מספק אינדיקציה לתחילת התיקון ולהשלמתו, בהתאמה14,17. עם זאת, שיטות אלה של אינדוקציה DSB (כלומר, כימיקלים או קרינה מייננת) אינן גורמות ל-DSBs במקומות מוגדרים בגנום. זה גם בלתי אפשרי מבחינה פונקציונלית להשתמש בהם כדי לגרום באופן עקבי רק למספר קטן (למשל, 2-4) של DSBs. כתוצאה מכך, השיטות הנפוצות ביותר של גרימת DSBs לגרום לשפע של נגעים המופצים באופן אקראי ברחבי הגנום18. ניתן להציג מספר קטן של DSBs על ידי הכנסת אתר הזיהוי לאנדונוקלאז חותך נדיר והבעת האנדונוקלאז הרלוונטי, כגון I-Sce119. למרבה הצער, האינטגרציה הנדרשת של אתר מטרה מונעת בדיקה של DSB במוקדים גנומיים אנדוגניים.

כתב יד זה מתאר שיטה לאיתור מוטציות הקשורות לתיקון של DSB שנוצר בלוקוס המוגדר על ידי המשתמש. אנו מספקים דוגמה מייצגת לגישה המיושמת להערכת יכולתו של חלבון נגיפי להגדיל את מספר המוטציות הקשורות ל-DSB. באופן ספציפי, כתב יד זה מתאר את השימוש ברנ"א מנחה יחיד (sgRNA) כדי לכוון אנדונוקלאז CAS9 כדי לגרום ל-DSB במסגרת קריאה פתוחה CD4 אנושית בעורלה אנושית קרטינוציטים המבטאים שליטה וקטורית (HFK LXSN) ו-HFK המבטאת את חלבון E6 של נגיף הפפילומה האנושי מסוג 8 (HFK 8E6). ריצוף ממוקד של הדור הבא (NGS) של האזור המקיף את השבר מאפשר להגדיר בקפדנות מוטציות הקשורות לתיקון הנגע. נתונים אלה מראים כי החלבון הנגיפי גורם לעלייה של כ-20 פעמים במוטציות במהלך תיקון DSB. הוא גם מספק אפיון בלתי משוחד של ההשלכות המוטגניות של DSBs במוקד יחיד ללא צורך בריצוף גנום שלם. באופן עקרוני, ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות כדי להשוות את הסיכון היחסי למוטציות בין מוקדי הגנום או קווי התאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ציפוי סלולרי

  1. לגדל תאי HFK LXSN ו-HFK 8E6 בלוחות של 10 ס"מ במדיה של תרביות קרטינוציטים (10 מ"ל/צלחת) עם תוסף גדילה קרטינוציטים אנושי (HKGS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. לגדל תאים לכ-80% מפגש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת ז'קטים עם 5% CO2.
  2. החלף את מדיית התרבית ב-3 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.05%, חומצה טטראצטית אתילנדיאמין). אינקובציה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. נטרלו את טריפסין עם נפח שווה של סרום בקר עוברי (FBS) עם תוספת מדיה והעבירו תאים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
  3. תאי החייאה עם 10 מ"ל של מדיה של תרבית קרטינוציטים עם HKGS. לקבוע את ריכוז התאים עם המוציטומטר.
  4. צלחת 4 x 105 תאים / 6 ס"מ צלחות (זרע שתי צלחות עבור HFK LXSN ושתי צלחות עבור HFK 8E6) ב 4 מ"ל של מדיה תרבית קרטינוציטים עם HKGS ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין. לגדול ב 37 °C (84 °F) בחממת ז'קט עם 5% CO2.
    הערה: ניתוח של תאי HFK נבחר עבור פרוטוקול זה משתי סיבות. ראשית, HFK הוא קו תאים קשה להעברה. לפיכך, על ידי הוכחה כי הפרוטוקול עובד בקו תאים זה, מסופקות ראיות לכך שהוא ככל הנראה יעבוד בתאים נפוצים יותר ומתמרים בקלות רבה יותר. שנית, נתונים שפורסמו בעבר מראים כי חלבון נגיפי (8E6) מעכב את תיקון של שברים דו-גדיליים בדנ"א 20,21,22. לפיכך, השוואת HFK LXSN ו- HFK 8E6 מאפשרת לנו להדגים את יכולת הבדיקה לזהות עליות במוטציות הקשורות לירידה ביכולת התיקון התאי.

2. טרנספקציה

  1. ביום הטרנספקציה (24 שעות לאחר הציפוי), החליפו את המדיה ב-3 מ"ל של מדיה ללא אנטיביוטיקה. דגירה במשך 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור ז'קט.
  2. תאים טרנספקטים עם ריאגנטים מתאימים של טרנספקציה על בסיס שומנים על פי הוראות היצרן.
    1. מחממים ריאגנטים של טרנספקציה לטמפרטורת החדר ופיפטה בעדינות לפני השימוש.
    2. עבור כל קו תאים (HFK LXSN ו- HFK 8E6), מקם כמות מתאימה של מאגר טרנספקציה (לפי הוראות היצרן) בצינור צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל (Tube 1). כלול צינור אחר עם אותה כמות של מאגר טרנספקציה (טרנספקציה מדומה או צינור 2).
    3. הוסף 2 מיקרוגרם של דנ"א פלסמידי המבטא CAS9/sgRNA המכוון ל-CD4 אנושי (px330-CD4, 5'- GGCGTATCTGTGTGAGGACT) לצינור 1 משלב 2.2.2. פיפט בעדינות כדי לערבב לחלוטין. הוסף נפח שווה של מים סטריליים לצינור 2.
    4. כלול לוחית בקרה עם ריאגנטים טרנספקציה בלבד (ללא פלסמיד) עבור כל קו תאים.
      הערה: הלוחית השנייה משמשת כבקרה שלילית בניסוי, ומאפשרת למשתמש לאשר כי טרנספקציה עם CAS9/sgRNA אינה אחראית למוטציות כלשהן.
    5. הוסף כמות מתאימה של מגיב הטרנספקציה (לפי הוראות היצרן) לצינור עם תערובת DNA (צינור 1) משלב 2.2.3 ואת הטרנספקציה המדומה (Tube 2) משלב 2.2.2. פיפט בעדינות כדי לערבב לחלוטין. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות כדי לאפשר מספיק זמן להיווצרות קומפלקסים.
    6. מוסיפים את תערובת הטרנספקציה בצורה טיפתית לצלחת. נדנדו בעדינות את התרבות במשך דקה אחת כדי להפיץ באופן שווה את תערובת הטרנספקציה.
  3. דגירה למשך 48 שעות לאחר הטרנספקציה כדי לאפשר ביטוי CAS9.
  4. תאי קציר על ידי טריפסיניזציה.
    1. החלף את מדיית התרבית ב-1 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.05%, חומצה טטראצטית אתילנדיאמין). אינקובציה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. נטרל טריפסין עם נפח שווה של מדיה משלימה של FBS.
    2. עבור כל צלחת של תאים, להעביר את תרחיף התא לשני צינורות microcentrifuge עם aliquots שווה. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
    3. בצעו החייאה של גלולת התא מצינור אחד בשלב 2.4.2 ב-1 מ"ל של מלח בעל מאגר פוספט (PBS) לריצוף. יש להחיות את הצינור השני משלב 2.4.2 עם PBS קר כקרח עבור אימונובלוט.
  5. קוצרים את כל התא ליזאטים לאימונובלוט.
    1. צנטריפוגה הצינור ב 300 x g במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט.
    2. הוסיפו 100 μL חיץ בדיקת רדיו-אימונופרציפציה (RIPA lysis buffer) מעורבב עם מעכב פרוטאז 1% ומעכב פוספטאז של 1% לתוך הצינור, ערבבו היטב עם פיפטה ודגירה במשך 10 דקות על קרח.
      הערה: מאגר ריפא ליזיס מכיל 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA; 0.5 mM EGTA; 1% טריטון X-100; 0.1% נתרן דאוקסיכולאט; 0.1% SDS; 140 mM NaCl, ומים שעברו דה-יוניזציה.
    3. צנטריפוגה lysates ב 13,000 x g במשך 10 דקות. לאסוף סופרנאטים עבור אימונובלוט.

3. מדידת ביטוי CAS9 באמצעות אימונובלוט

  1. קבעו את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונינית (BCA) בהתאם להוראות היצרן.
  2. הפעל 20 מיקרוגרם חלבון של כל דגימה בבארות של ג'ל Tris-acetate של 3%-8% למשך 150 דקות והעברה סמידרית (10 וולט למשך 30 דקות ולאחר מכן 25 V למשך 12 דקות) לממברנת פוליווינילידן דיפלואוריד.
  3. לאחר חסימת הממברנה בחלב יבש ללא שומן ב-5% ב-PBS עם 0.1% טווין (PBST) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, הוסיפו נוגדנים נגד CAS9 (1:1000) ונוגדנים נגד GAPDH (1:1000). אינקובציה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ללילה.
  4. לאחר שטיפת הממברנה עם PBST, דגירה של הממברנה עם נוגדן משני בחלב יבש ללא שומן 5% ב- PBST למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  5. דמיינו את הכתם וקבעו את רמת CAS9 לפי דחיסות23. ראו איור 1 עבור כתם מייצג.
    הערה: ניתן להשתמש באיתור היווצרות מוקדי H2AX (S139) זרחניים על ידי מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית כדי לאמת את פעילות CAS914. מספר נמוך של מוקדים מובחנים (בדרך כלל 1-4 מוקדים) צפויים בהתאם למיקום מחזור התא, האם מוטציות באתר המטרה CAS9 מונעות חיתוך נוסף, וכמה עותקים של אתר החיתוך CAS9 קיימים בגנום המעניין. תמונה מייצגת מוצגת באיור 2.

4. מיצוי חומצות גרעין ויצירת אמפליקון

  1. חלץ דנ"א מדגימות תאים משלב 2.4.3 באמצעות ערכת מיצוי DNA במשקל מולקולרי גבוה, כפי שצוין על ידי היצרן.
  2. פריימרים Resuspend עם ממס המצוין על פי גליון הנתונים. דיללו עם אותו מגיב ל-20 μM ואגרו פריימרים של 20 μM לתוך הבריכות שצוינו.
    הערה: מאגר הפריימרים מופיע בטבלה משלימה 1.
  3. צור תערובת PCR Master באמצעות הגברה ארוכה Taq פולימראז עבור כל מאגר פריימרים של 20 μM כמפורט בטבלה 1.
    1. הוסף 21 μL של mastermixes כדי להפריד צינורות PCR.
  4. הוסף 4 μL של דגימת המטרה (100 ng/μL) משלב 4.1 לצינורות בדיקת PCR המכילים צינורות בדיקה mastermix ו- cap. הקפידו על תגובות נפרדות עבור כל מאגר פריימרים.
    1. מערבולת לערבוב צינורות בדיקת PCR וצנטריפוגה (ספין מהיר) להסרת טיפות ממכסי הצינור.
    2. הניחו את צינורות ה-PCR על מכונת רוכבי אופניים תרמית קונבנציונלית.
    3. מכונת PCR של תוכנית כמפורט בטבלה 2.
    4. הפעל את התוכנית על רוכב אופניים תרמי.

5. ניקוי PCR

  1. הסר פריימרים מתגובות PCR באמצעות מערכת ניקוי PCR מבוססת חרוזים.
    1. מוציאים את חרוזי הניקוי מהמקרר 30 דקות לפני השימוש.
    2. חרוזי וורטקס הרבה לפני השימוש ומבטיחים שכל החרוזים ישוחזרו.
    3. הוסיפו 30 μL (פי 1.2) של חרוזים משופעים לכל באר של צלחת באר עמוקה בת 96 בארות.
    4. הוסף 25 μL של תגובת PCR לבארות המכילות חרוזים.
    5. מניחים את הצלחת על שייקר צלחות ב-2000 סל"ד למשך 2 דקות.
    6. אפשרו לצלחת להישאר בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות לאחר הרעידות.
    7. מניחים את צלחת הבאר העמוקה על מגנט צלחת 96 בארות ודגירה למשך 2 דקות.
    8. הסר והשליכו את חומר העל ללא החרוזים המפריעים.
    9. בעוד שהצלחת נשארת על המגנט, מוסיפים 180 μL של 80% אתנול ודגירה במשך 30 שניות. הסר והשליכו את ה-supernatant.
    10. חזור על שלב 5.1.9.
    11. באמצעות פיפטה של 10 μL, הסר והשלך את כל הנוזלים שנותרו מהבארות.
    12. אפשרו לחרוזים להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    13. מוסיפים 20 μL של מים נטולי נוקלאז לבארות המכילות חרוזים ומסירים את הצלחת מהמגנט.
    14. יש לנער את הצלחת ב-2,000 סל"ד למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    15. דגירה של הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    16. מניחים את הצלחת על מעמד מגנט ודוגרים למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    17. הסר את ה-supernatant לתוך צלחת PCR שנייה עם תווית. זה מכיל את הדנ"א המנוקה.
  2. מדוד את הריכוז של כל תגובה באמצעות פלואורומטר.
    1. ודא כי ריאגנטים פלואורומטר dsDNA נמצאים בטמפרטורת החדר.
    2. הגדר צינורות בדיקה פלואורומטריים בתוספת שני צינורות נוספים לתקנים.
    3. הוסף 199 μL של תמיסת עבודה 1x dsDNA לכל הצינורות מלבד שניים. הוסף 190 μL של הפתרון עובד לשני הצינורות האחרונים.
    4. הוסף 10 μL של שני התקנים (הכלולים בטבלת החומרים) כדי להפריד בין צינורות הבדיקה.
    5. הוסף 1 μL של כל תגובת PCR לצינורות מאסטרמיקס פלואורומטר.
    6. צינורות מערבולת לערבב ולדגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות.
    7. במסך הבית של הפלואורומטר, בחר/י את הכפתור עם השימוש ב-assay kitin (1x dsDNA) ולאחר מכן בחר קרא תקנים והפעל דוגמאות.
    8. הכנס צינור 1 סטנדרטי, בחר בלחצן קרא ולאחר מכן חזור על הפעולה עבור תקן 2.
    9. לאחר שלב 5.2.6, חזור על הפעולה עבור מדגם אחד, בחר נפח דגימה של 1 μL והריכוז המתקבל יסופק.
    10. חזור על שלב 5.2.7 עבור הדגימות הנותרות.
  3. חשב את הטחנות הצפויה של כל התגובות ואגד ריכוזים שווים של תגובות מכל דגימה בנפרד (מאגר סופי אחד לכל מדגם) באמצעות המשוואה שלהלן.
    Equation 1
    1. חזור על שלבים 5.2.1 עד 5.2.7 כדי לקבל את ריכוז הבריכה הסופי.
  4. בדוק את מאגר האמפליקון על מכונת אלקטרופורזה נימית / ג'ל אגרוז כפי שצוין על ידי היצרן.
    1. הכן צינורות אלקטרופורזה נימיים למספר המתאים של דגימות. הוסף 7 μL של מאגר ה- DNA כפי שצוין על ידי היצרן.
    2. הוסף 4 μL של בריכת amplicon לצינור המכיל מאגר DNA.
    3. מקם שפופרות על מכונת האלקטרופורזה והפעל את המכונה כפי שצוין על ידי היצרן עבור dsDNA.
    4. צפו בתמונות ג'ל האלקטרופורזה המבטיחות שהפסים יתמקמו ל-~5 קילובייט (גודל האמפליקונים).
  5. חשב את הטחנות הצפויה של כל התגובות ואגד ריכוזים שווים של תגובות מכל דגימה בנפרד (מאגר סופי אחד לכל מדגם) באמצעות המשוואה שלהלן.
    Equation 2

6. הכנת הספרייה

  1. דיללו בריכות לדוגמה משלב 5.3.1 עד 0.2 ננוגרם/מיקרול להכנת ספרייה.
    1. שימוש בערכת הכנה של ספריית קלט נמוך התואמת לרצפים קצרים (300bp) מכינים ספריות באמצעות שילובי אינדקס ייחודיים עבור כל מאגר דגימות שנוצר בשלב 5.3 בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: בצע את הוראות היצרן כדי לבחור רצפי אינדקס. כל האינדקסים המתאימים לערכת ההכנה של הספרייה יעבדו עבור הדוגמאות.
    2. לאחר הכנת הספרייה, אחסנו את כל הדגימות בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: לפני יצירת מאגר הספרייה, חשב את מספר הקריאות הדרושות לכיסוי של פי 250 של רצף היעד שלך וודא שמחסנית הריצוף שנבחרה יכולה לספק כיסוי הולם לכל דגימה כלולה. עבור 0.5Mb בסך הכל, זה ישתווה ל-1M קריאות.
  2. הכינו את מאגר הספרייה לריצוף.
    1. להפשיר ולהכין מחסנית של 300 מחזורים וריאגנטים לריצוף.
    2. דנטורציה ודילול מאגר הריצוף שנוצר בשלב 5.1.1 על פי הוראות היצרן של הרצף.
    3. הוסף מאגר ספריות מפורק ומדולל לריאגנטים לריצוף והפעל את מכונת הריצוף כפי שצוין על ידי היצרן.
      הערה: ראה טבלה 3 המצורפת לצילומי בעיות.

7. ניתוח נתונים

הערה: כל שלבי הנתונים מבוצעים בתוכנת ניתוח הנתונים הגנומית. סוגריים מציינים קלט משתמש. גדול מסימן מציין את סדר לחיצות העכבר עבור כל שלב נתון (לדוגמה, לחיצתעכבר 1 >לחיצהשנייה על העכבר)

  1. יבא את הקריאות על ידי לחיצה על > תוכנה פתוחה ייבוא > Illumina > בחר קבצים > הבא > בחר מיקום כדי לחסוך > סיום. הקריאות יופיעו כעת בתוכנה.
  2. חתוך וסנן את הקריאות.
    1. בתוכנת ניתוח נתוני הרצף העמוק, חתוך את פרמטרי ברירת המחדל של הקריאות הגולמיות.
    2. סמן את הקריאות ולחץ על ארגז כלים > הכן נתוני רצף > חיתוך קריאות > > הבא > הבא > הבא > הבא > שמור > > > הבא (בחר מיקום לשמירה) > סיום
  3. מפה את הקריאות החתומות כדי להפנות.
    1. מפה חתוכה קוראת לרצף ההפניה המשמש בשלב 4.1 באמצעות ציון התאמה של 2, עלות אי התאמה של 3 ועלויות הוספה/מחיקה של 2. ודא ששבר האורך הוא מעל 0.7 ושבר הדמיון הוא ב- 0.8 או מעל.
    2. סמן את קובץ הקריאה החתוך ולחץ על ארגז כלים > ניתוח ריצוף מחדש > קריאת מפה כדי להפנות > > הבא (בחר רצף הפניה) > > הבא (ודא שהפרמטרים מסומנים כנ"ל) > > הבא שמור > (בחר מיקום לשמירה) > סיום.
  4. חילוץ וריאנטים ואינדלים.
    1. באמצעות מתקשר אינדל מתאים, חלצו אינדלים באמצעות סף ערך p של 0.005 ומטה ומספר מרבי של אי-התאמות של 3.
    2. הדגש קובץ קריאה ממופה ולחץ על ארגז כלים > ניתוח רצף מחדש > זיהוי וריאנטים > אינדלים ווריאנטים מבניים > > הבא (ודא שהמשמעות הנדרשת היא קלט > > הבא שמור > (בחר מיקום לשמירה) > סיום.
    3. באמצעות מתקשר וריאנט מתאים, קוראים וריאנטים ממיפוי הקריאה במשמעות של 5%.
    4. הדגש קובץ קריאה ממופה ולחץ על ארגז כלים > ניתוח ריצוף מחדש > זיהוי וריאנטים > זיהוי וריאנטים בתדר נמוך > > הבא (ודא שהמשמעות הנדרשת היא קלט > > הבא > שמור > (בחר מיקום לשמירה) > סיום.
      הערה: הקפד לקחת בחשבון את התכסיס של הגנום המארח במתקשרי האינדל והווריאנטים. אין לחלץ מוטנטים מתחת ל-5%. סף זה מסביר שגיאות PCR וריצוף המשויכות לבדיקה. הנורמליזציה (המבוססת על זיהוי אימונובלוט של CAS9) צריכה להיעשות על ידי התאמת כיסוי הריצוף. לדוגמה, אם למדגם A יש יעילות כפולה של טרנספקציה מדגימה B, אז 50% מהקריאות ממדגם A צריכות לשמש לניתוח. זה צריך להיעשות על ידי דגימה אקראית ולא להפחית את הכיסוי עבור כל מדגם מתחת 100x.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שלוש תוצאות מייצגות מוצגות עבור פרוטוקול זה. איור 1 הוא אימונובלוט המאשר ביטוי של CAS9 בבקרת HFK (LXSN) ו-HFK המבטאת בטא-HPV 8E6 (8E6). 48 שעות לאחר הטרנספקציה, נקטפו ליזטים של תאים שלמים ולאחר מכן נבדקו עם נוגדן נגד CAS9 (או GAPDH כבקרת העמסה). התוצאה מראה כי HFK LXSN ו- HFK 8E6 מבטאים כמות דומה של CAS9 המצביעה על כך שנצילות הטרנספקציה דומה בין שני קווי תאים. איור 2 הוא תמונה של מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית המציגה DSBs המושרים על ידי CAS9 באמצעות מוקדי pH2AX, סמן סטנדרטי עבור DSBs24. זה מצביע על כך ששני DSBs מושרים על ידי CAS9/sgRNA ובכך מאשר כי אינדוקציה DSB מתרחשת כצפוי. איור 3 מראה ש-8E6 מגביר את הווריאציות הגנומיות בתוך 200 Kb סביב ה-DSB22 המושרה על ידי CAS9. זה עולה בקנה אחד עם ההשערה כי HPV8 E6 מבטל את הרגולציה על תיקון DSB ומגביר את חוסר היציבות הגנומית. איור זה מראה דרך אחת שבה ניתן להציג נתונים המתקבלים מגישה זו.

Figure 1
איור 1: תמונה מייצגת של אימונובלוט המשווה את ביטוי CAS9 בתאי HFK לא מתורגמים ומתורגמים. נוגדן Anti-CAS9 שימש לזיהוי החלבון CAS9. GAPDH משמש כפקד טעינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: תמונה אימונופלואורסצנטית מייצגת של היסטון H2AX (S139) שעבר זרחון בתאים שעברו טרנספקטציה של sgRNA/CAS9 ובקרה לא מתורגמת. DAPI שימש להכתמת דנ"א (כחול). pH2AX (אדום) הוא סמן עבור DSB המושרה על ידי CAS9. זה מדגים כי ביטוי CAS9 אופטימלי הושג על ידי היעדר מחשוף מחוץ למטרה. בהתאם למספר מוקדי הגנום הממוקדים (שהשתנו על-ידי שינויים בפלואידיות של התא, בשינויים במספרי העתקת אתר המטרה או במיקום מחזור התא), מספר המוקדים עשוי להיות גבוה יותר. עם זאת, כל עלייה צריכה להיות ניתנת לחיזוי בהתבסס על סוג התא ואתר היעד שנותח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: Beta-HPV 8E6 מגביר את חוסר היציבות הגנומית במהלך תיקון DSB. (A) סכמטית של מיקום ה-DSB המושרה CAS9 לאורך החלק המרוצף של הגנום. (B) וריאציות גנומיות המקובצות לפי סוגים של אירועים מוטציוניים ב-HFK LXSN וב-HFK 8E6. כל קבוצה של וריאציות גנומיות ומספר כולל של וריאציות הושוו בין HFK LXSN ו- HFK 8E6. (C) תרשים Circos של מוטציות בדנ"א בתאי HFK LXSN (צד ימין) ו-HFK 8E6 (צד שמאל). חצים שחורים מציינים אתרי חיתוך CAS9. המעגל הפנימי ביותר מציג קשרים בין סידור מחדש גנומי זהה. המיקום של סידור מחדש גנומי הצבוע לפי סוגים של וריאציות גנומיות מוצג בחמישה עיגולים קונצנטריים (כחול מייצג SNP, ירוק מייצג הכנסה, אדום מייצג מחיקה, סגול מייצג MNV, ושחור מייצג החלפה). תרשים הפיזור בעיגול החיצוני ביותר מציג נקודות שבירה (שחור), כפילויות טנדם (אדום) ואינדלים נקודתיים (אפור), שבהם הקרבה לקצה החיצוני מייצגת יחס משתנה גבוה. SNP, פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד. MNV, וריאציה מרובת נוקלאוטידים. הבדלים סטטיסטיים בין קווי התאים נמדדו באמצעות מבחן t של התלמידים. מציין p < 0.001". זה מותאם מתוך הפניה שפורסמה בעבר עם הרשאה22. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: רכיבי תערובת PCR Master. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: הגדרות תוכנית PCR. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: ירי צרותי. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 1: רשימת מאגר הפריימרים עבור PCR. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בנוסף לעומק המידע המסופק, ישנם מספר יתרונות לשיטה זו. ראשית, תיקון DSB, בתיאוריה, ניתן להעריך בכל מוקד גנומי מבלי לשנות את הגנום של התא המעניין. שנית, הגישה לניתוח NGS של תיקון גדלה על ידי העלות המופחתת והמאמץ החישובי הניתנים על ידי ביצוע וניתוח של DSB יחיד המיועד לאזור מוגדר. לבסוף, כאשר הגנומים של אורגניזמים נוספים הופכים לזמינים באופן שגרתי ופרסומים מרובים המדגימים טרנספקציה מוצלחת של קווי תאים מגוונים של יונקים ולא יונקים, התועלת של גישה זו צפויה להיות רחבהשל 10,23,24.

כתב יד זה ניתח תיקון DSB בעורלה אנושית קרטינוציטים כדוגמה להמחשה. יעילות הטרנספקציה נוטה להיות נמוכה יותר בקרטינוציטים מאשר בסוגי רקמות אחרים. לכן, פרוטוקול זה השתמש בגישת טרנספקציה המותאמת לתאים קשים אלה. יש לייעל את גישת הטרנספקציה לסוג התא שנותח. היכולת של DSB המושרה CAS9 המשמש בפרוטוקול זה אושרה באוסטאוסרקומה, סרטן המעי הגס, סרטן הריאות, פיברובלסט, כליה עוברית ותאי קרטינוציטים אנושיים10,23. עם זאת, לפני ביצוע ריצוף הדור הבא, מומלץ כי ביטוי CAS9 ופעילות מאושרים.

שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא כאשר משווים בין או בין דגימות שונות כדי לנרמל את הניתוח כדי להסביר את ההבדלים ביעילות הטרנספקציה של CAS9. כדי לעשות זאת, יש למדוד את רמת החלבון היחסית של CAS9 על ידי אימונובלוטציה וצפיפות (איור 1). חשוב גם להבטיח את הספציפיות של ביקוע CAS9 כפי שמצוין על ידי היווצרות מוקדי pH2AX (S139) מובחנת, הניתנת לזיהוי על ידי מיקרוסקופ IF14 (איור 3). לחלופין, ניתן להשתמש בבדיקת האנדונוקלאז T7 כדי לבחון את פעילות הקריספר/Cas9 ואת יעילות ה-sgRNA.

מגבלה בולטת של גישה זו היא ש-DSB המושרה על ידי CAS9 נוטה להיות "נקי יותר" מ-DSB הנגרם על ידי קרינה או נזק פיזיולוגי דומה. לכן, השיטה המתוארת כאן עלולה לזלזל במספר או בחומרת המוטציות הקשורות לתיקון נגעים המתרחשים באופן טבעי. השימוש בנוקלאזות ספציפיות לרצף אחר הגורמות ל-DSB עם תקרה ארוכה יותר עשוי לסייע להתגבר על מגבלה זו26. יתר על כן, לא ברור לחלוטין אם אזור הכרומטין (למשל, הטרוכרומטין ואאוכרומטין) משפיע על פעילות CAS9. לפיכך, על המשתמש להיות זהיר כדי לאשר פעילות CAS9 שווה ערך בעת השוואת מוטציות באתרים שונים.

השיטה המתוארת כאן יכולה לשמש להגדרת ההשלכות המוטגניות היחסיות של תיקון DSBs במגוון הקשרים. לדוגמה, זה יכול להקל על בדיקה של מעכבי תיקון DNA חדשים של מולקולות קטנות. זה יאפשר למעכבים שהם מוטגניים יותר בתאים שעברו טרנספורמציה (בהשוואה לתאים לא מתורגמים) לקבל עדיפות לפיתוח כחומרים כימותרפיים. גישה זו עשויה גם להיות שימושית להשוואה באותו רקע גנומי כדי לקבוע את התדירות של מוטציות הקשורות לתיקון DSB בהקשרים שונים של גנים (למשל, ליד מקדם, משפר או מדכא), בין תאים עם מוטציות שונות (למשל, איתות גנים פעילים באופן מכונן או מוטציות שגויות), או תמורות דומות אחרות. הגמישות והמחירים הזולים של הגישה מספקים כלי רב עוצמה לניתוחים עתידיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחקר שדווח בכתב יד זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים של המכונים הלאומיים לבריאות (P20GM130448) (NAW ו- RP); המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות (NCI R15 CA242057 01A1); מרכז ג'ונסון לחקר הסרטן באוניברסיטת קנזס סטייט; ומשרד ההגנה של ארה"ב (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). אנו מעריכים את KSU-CVM Confocal Core ואת ג'ואל סנמן על המיקרוסקופיה האימונופלואורסצנטית שלנו. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של הכותבים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של סוכנויות מימון אלה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 Well Tissue Culture Plate Celltreat 229106 Cell culture plate
BCA Kit VWR 89167-794 BCA assay kit
Centrifuge 5910 R Eppendorf 2231000772 Tabletop Centrifuge
CLC Genomic Workbench Qiagen 832001 deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller
Digital Microplate Genie pulse Scientific industries SI-400A Plate shaker
DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) ThermoFisher Scientific MA191878 Anti-FLAG antibody
Epilife CF Kit ThermoFisher Scientific MEPICF500 Cell cultrue media and supplements
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 89510-194 Cell culture supplement
Goat anti-Rabbit IgG ThermoFisher Scientific A-11012 Secondary antibody
HighPrep PCR Clean-up system MagBio AC-60005 Bead-based PCR cleanup kit
KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit KAPA Biosystems KK2600 PCR mastermix/PCR assay
MagAttract HMW DNA kit Qiagen 67563 High Molecular Weight DNA extraction kit
Magnetic Stand-96 Thermo Fisher Scientific AM10027 96-Well Magnetic Rack
MiniAmp Thermal Cycler Applied Biosystems A37834 Thermal Cycler
Miseq Illumina SY-410-1003 Sequencer
Miseq v2 300 cycle reagent kit Illumina MS-102-2002 300-cycle cartridge/sequencing reagents
Nextera XT DNA Library Prep kit Illumina FC-131-1024 Library preparation kit
Nextera XT Kit v2 Set A Illumina 20027215 Indexes
Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates Thermo Fisher Scientific 260251 deep well 96-well plates
Penicillin-Streptomycin Solution (100X) Calsson Labs PSL02-6X100ML Antibiotics for cell culture
Phosphate Buffered Saline (PBS) Bio Basic PD8117 PBS
px330-CD4 Addgen 136938 SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT
QIAxcel Advanced System Qiagen 9001941 capillary electrophersis machine
QIAxcel DNA screening kit Qiagen 929004 DNA buffer/ capillary electrophersis tubes
Qubit 1x ds HS Assay Kit ThermoFisher Scientific Q23851 Fluorometer reagents/1x dsDNA solution
Qubit 4 Fluorometer ThermoFisher Scientific Q33238 Fluorometer
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Scientific Q32856 Fluorometer assay tubes
RIPA Lysis Buffer VWR VWRVN653-100ML Lysis buffer for protein extraction
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300054 Trypsin
Vortex-Genie 2 Scientific industries SI-0236 Vortex
Xfect Transfection Reagent Takara Bio 631318 Transfection reagent
genomic data analysis software QIAGEN CLC Workbench v21.0. Data analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
  2. Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).
  3. Khanna, K. K., Jackson, S. P. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
  4. vanden Berg, J. G., et al. A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression. Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).
  5. Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
  6. Daley, J. M., Sung, P. 53B. P. 1 BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).
  7. Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication. Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).
  8. Jette, N., Lees-Miller, S. P. The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (0), 194-205 (2015).
  9. Weterings, E., van Gent, D. C. The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis. DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).
  10. Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells. Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).
  11. Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).
  12. Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).
  13. Certo, M. T., et al. Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints. Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).
  14. Murthy, V., et al. Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy. JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).
  15. Wang, J. L., et al. Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
  16. Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -P., Pain, D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Letters. 327 (0), 48-60 (2012).
  17. Kuo, L. J., Yang, L. -X. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 5, (2008).
  18. Sanders, J. T., et al. Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization. Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).
  19. Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila. Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).
  20. Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation. PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).
  21. Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity. Cancers. 12 (9), 2356 (2020).
  22. Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors. PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).
  23. Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -C., Smith, R., Tolosa, J. M. Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures. BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).
  24. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  25. Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
  26. Ghezraoui, H., et al. Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining. Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).

Tags

גנטיקה גיליון 181 תגובת נזק לדנ"א DSB תיקון DSB CAS9 המושרה DSB ריצוף הדור הבא גנומיקה
שימוש בריצוף הדור הבא כדי לזהות מוטציות הקשורות לתיקון של שבר גדיל כפול המושרה על ידי CAS9 ליד מקדם CD4
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hu, C., Doerksen, T., Bugbee, T.,… More

Hu, C., Doerksen, T., Bugbee, T., Wallace, N. A., Palinski, R. Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter. J. Vis. Exp. (181), e62583, doi:10.3791/62583 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter