Optische Pinzette untersucht RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt einen vollständigen experimentellen Workflow für die Untersuchung von RNA-Protein-Interaktionen mit optischen Pinzetten dar. Mehrere mögliche Versuchsanordnungen werden skizziert, einschließlich der Kombination von optischen Pinzetten mit konfokaler Mikroskopie.

Zusammenfassung

RNA nimmt verschiedene strukturelle Falten an, die für ihre Funktionen essentiell sind und dadurch verschiedene Prozesse in der Zelle beeinflussen können. Darüber hinaus kann die Struktur und Funktion einer RNA durch verschiedene transaktive Faktoren wie Proteine, Metaboliten oder andere RNAs moduliert werden. Frameshifting-RNA-Moleküle zum Beispiel sind regulatorische RNAs in kodierenden Regionen, die Ribosomen direkt in einen alternativen offenen Leserahmen übersetzen und dadurch als Genschalter fungieren. Sie können auch verschiedene Falten annehmen, nachdem sie an Proteine oder andere Transfaktoren gebunden sind. Um die Rolle von RNA-bindenden Proteinen bei der Translation zu analysieren und wie sie die RNA-Struktur und -Stabilität modulieren, ist es wichtig, das Zusammenspiel und die mechanischen Eigenschaften dieser RNA-Protein-Komplexe gleichzeitig zu untersuchen. Diese Arbeit zeigt, wie man mit einer einzelnen Molekül-Fluoreszenz-gekoppelten optischen Pinzette die Konformations- und thermodynamische Landschaft von RNA-Protein-Komplexen mit hoher Auflösung erforscht. Als Beispiel wird die Interaktion des SARS-CoV-2 programmierten ribosomalen Frameshifting-Elements mit der trans-wirkenden Faktor-Kurzisoform des antiviralen Zinkfingerproteins herausgearbeitet. Darüber hinaus wurden fluoreszenzmarkierte Ribosomen mit der konfokalen Einheit überwacht, was letztendlich die Untersuchung der Translationsdehnung ermöglichen würde. Der fluoreszenzgekoppelte OT-Assay kann weit verbreitet eingesetzt werden, um verschiedene RNA-Proteinkomplexe oder trans-wirkende Faktoren zu erforschen, die die Translation regulieren, und könnte Studien zur RNA-basierten Genregulation erleichtern.

Einleitung

Die Übertragung genetischer Information von DNA auf Proteine durch mRNAs ist ein komplexer biochemischer Prozess, der auf allen Ebenen durch makromolekulare Interaktionen innerhalb von Zellen präzise reguliert wird. Für die translationale Regulation spielen RNA-Protein-Interaktionen eine entscheidende Rolle, um schnell auf verschiedene Reize und Signale zu ^reagieren1,2. Einige RNA-Protein-Interaktionen beeinflussen die mRNA-Stabilität und verändern dadurch die Zeit, in der eine RNA translational aktiv ist. Andere RNA-Protein-Interaktionen sind mit Rekodierungsmechanismen wie Stop-Codon-Readthrough, Bypassing o....

Protokoll

1. Probenvorbereitung

1. Klonen Sie die interessierende Sequenz in den Vektor, der die Lambda-DNA-Fragmente enthält, die als Griffsequenzen dienen (Abbildung 2)^43,50.
2. Generieren Sie zunächst eine DNA-Vorlage für die anschließende In-vitro-Transkription mittels PCR (Abbildung 2B; Reaktion 1). Bei diesem PCR-Schritt wird der T7-Promotor am 5'-Ende des Sinnes-DNA-Moleküls 32,33,43,50 hinzugefügt.

Ergebnisse

In diesem Abschnitt liegt der Schwerpunkt hauptsächlich auf Messungen von RNA-Protein/Liganden-Wechselwirkungen durch die fluoreszenzoptischen Pinzetten. Für eine Beschreibung allgemeiner Experimente mit optischen RNA-Pinzetten und entsprechenden repräsentativen Ergebnissen siehe ³². Für eine detailliertere Erörterung der RNA/DNA-Protein-Interaktionen siehe auch ^1,2,26,59,60

Diskussion

Hier demonstrieren wir die Verwendung von fluoreszenzgekoppelten optischen Pinzetten, um Wechselwirkungen und dynamisches Verhalten von RNA-Molekülen mit verschiedenen Liganden zu untersuchen. Im Folgenden werden kritische Schritte und Einschränkungen der vorliegenden Technik diskutiert.

Kritische Schritte im Protokoll
Wie bei vielen anderen Methoden ist die Qualität der Probe entscheidend, um zuverlässige Daten zu erhalten. Um Proben von höchstmöglicher Qualität zu erhalte.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bacterial Stämme
E. coli HB101	Laborsammlung	N/A	Klonierung der Vektoren
Chemikalien und Enzyme
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	31424	Puffer
Biotin-16-dUTP	Roche	11093070910	Biotinylierung
BSA	Sigma-Aldrich	A4737	Puffer
Katalase	Lumicks	N/A	Sauerstofffängersystem
Dithiothreitol (DTT)	Melford Labs	D11000	Puffer
DNAse I aus der bovinen Bauchspeicheldrüse	Sigma-Aldrich	D4527	in vitro Transkription
dNTPs	Th.Geyer	11786181	PCR
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Puffer
Formamid	Sigma-Aldrich	11814320001	Puffer
Glukose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG	Sauerstofffängersystem
Glukose-Oxidase	Lumicks	N/A	Sauerstofffängersystem
HEPES	Carl Roth	HN78.3	Puffer
Magnesiumchlorid	Carl Roth	2189.1	Puffer
Phusion DNA-Polymerase	NEB	M0530L	Gibson-Assemblierung, Klonierung
Kaliumchlorid	Merck	529552-1KG	Puffer
PrimeSTAR GXL DNA-Polymerase	Takara Bio Clontech	R050A	PCR
Pyrophosphotase, thermostabil, anorganisch	NEB	M0296L	in vitro Transkription
RNase Inhibitor	Molox	1000379515	Puffer
rNTPS	life technologies	R0481	in vitro Transkription
Natriumthiosulophat	Sigma-Aldrich	S6672-500G	Bleichmitteldeaktivierung
Sytox Green	Lumicks	N/A	konfokale Messungen
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203S	Biotinylierung
T5 Exonuklease	NEB	M0363S	Gibson-Assemblierung, Klonierung
T7-RNA-Polymerase	Eigenhergestellte	N/	A-In-vitro-Transkription
Taq-DNA-Polymerase	NEB	M0267S	PCR
Taq-Ligase	Biozym	L6060L	Gibson-Assemblierung, Klonierung
TWEEN 20 BioXtra	Sigma-Aldrich	P7949	Puffer
Kits
Monolithisches Proteinmarkierungskit RED-NHS 2. Generation (aminreaktiv)	Nanotemper	MO-L011	Wird für die Ribosomenmarkierung
Purefrex 2.0	GeneFrontier	PF201-0.25-EX	Ribosomen werden für die Markierung
verwendetOligonukleotide
5' Griff T7 forward	Microsynth	Sonderanfertigung	5' - CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC - 3', zur Generierung einer OT in vitro Transkriptionsvorlage in der PCR 1
3' Griff reverse	Microsynth	Custom Order	5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', zur Generierung eines OT in vitro Transkriptions-Templates in der PCR 1
5' Handle Forward	Microsynth	Custom Order	5' - TCCTTTCTCTGTGGACGCCGC - 3' , zur Generierung von 5' Handle in PCR 2
5' Handle Reverse	Microsynth	Custom Order	5' - CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3', zur Generierung von 5' Handle in PCR 2
3' Griff vorn	Microsynth	Custom Order	5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG - 3', zur Generierung von 3' Griff in PCR 3
3' Griff umgekehrt 5' markiert mit Digoxigenin	Microsynth	custom order	5' -[Dig]-GTCAAAGTGCCCCCGTTATCC - 3', verwendet zur Generierung von 3'-Handle in der PCR 3
DNA-Vektoren
pMZ_OT	hergestellt im eigenen Haus	N/A	weitere Beschreibung in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control" Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atom	https://atom.io/packages/ide-python	N/A
Bluelake	Lumicks	N/A
Graphpad	https://www.graphpad.com/	N/A
InkScape 0.92.3	https://inkscape.org/	N/A
Matlab	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	N/A
POTATO		N/A
RNAstructure	https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html	N/A
Spyder	https://www.spyder-ide.org/	N/A
Other
Streptavidin-beschichtete Polystyrolpartikel, 1,5-1,9 & Mikro; m, 5 ml, 1,0 % w/v	Spherotech	SVP-15-5
Anti-Digoxigenin-beschichtete Polystyrolpartikel, 2,0-2,4 & Mikro; m, 2 ml, 0,1% w/v	Spherotech	DIGP-20-2
Spritzen	VWR	TERUMO SS+03L1
Devices
C-Trap	Lumicks	N/A	Optische Pinzette gekoppelt mit konfokaler Mikroskopie

verwendet https://github.com/lpekarek/POTATO.git