Methodenartikel

Handhabungstechniken zur Stressreduzierung bei Mäusen

DOI:

10.3791/62593

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25. September 2021

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1Campbell Family Mental Health Research Institute of CAMH, 2Department of Psychiatry, University of Toronto, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 4Departamento de Investigación, Universidad Central de Queretaro, 5Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 5287, Institut de Neurosciences Cognitives et Intégratives d'Aquitaine, Université de Bordeaux

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieser Artikel beschreibt eine Handhabungstechnik bei Mäusen, die 3D-Handhabungstechnik, die die routinemäßige Handhabung erleichtert, indem sie angstähnliche Verhaltensweisen reduziert, und präsentiert Details zu zwei bestehenden verwandten Techniken (Tunnel- und Schwanzhandhabung).

Zusammenfassung

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Versuchstiere werden mehrfachen Manipulationen durch Wissenschaftler oder Tierpfleger ausgesetzt. Der Stress, den dies verursacht, kann tiefgreifende Auswirkungen auf das Wohlbefinden der Tiere haben und auch ein Störfaktor für experimentelle Variablen wie Angstmessungen sein. Im Laufe der Jahre wurden Handhabungstechniken entwickelt, die den mit der Handhabung verbundenen Stress minimieren, mit besonderem Fokus auf Ratten und wenig Aufmerksamkeit für Mäuse. Es hat sich jedoch gezeigt, dass Mäuse mitHilfe von Handhabungstechniken an Manipulationen gewöhnt werden können. Die Gewöhnung von Mäusen an den Umgang reduziert Stress, erleichtert die routinemäßige Handhabung, verbessert das Wohlbefinden der Tiere, verringert die Datenvariabilität und verbessert die Experimentellentlastlichkeit. Trotz positiver Auswirkungen der Handhabung ist der besonders belastende Tail-Pick-up-Ansatz immer noch weit verbreitet. Dieses Papier bietet eine detaillierte Beschreibung und Demonstration einer neu entwickelten Maus-Handhabungstechnik, die den Stress des Tieres während der menschlichen Interaktion minimieren soll. Diese manuelle Technik wird über 3 Tage durchgeführt (3D-Handhabungstechnik) und konzentriert sich auf die Fähigkeit des Tieres, sich an den Experimentator zu gewöhnen. Diese Studie zeigt auch die Wirkung von zuvor etablierten Tunnelhandhabungstechniken (unter Verwendung eines Polycarbonattunnels) und der Tail-Pick-up-Technik. Speziell untersucht werden ihre Auswirkungen auf angstähnliche Verhaltensweisen, indem Verhaltenstests (Elevated-Plus Maze und Novelty Suppressed Feeding), freiwillige Interaktion mit Experimentatoren und physiologische Messungen (Corticosteronspiegel) verwendet werden. Die 3D-Handhabungstechnik und die Tunnelhandlingtechnik reduzierten angstähnliche Phänotypen. Im ersten Experiment mit 6 Monate alten männlichen Mäusen verbesserte die 3D-Handhabungstechnik die Interaktion der Experimentatoren signifikant. Im zweiten Experiment mit einer 2,5 Monate alten Frau reduzierte es den Corticosteronspiegel. Daher ist das 3D-Handling ein nützlicher Ansatz in Szenarien, in denen eine Interaktion mit dem Experimentator erforderlich oder bevorzugt ist oder in denen das Tunnelhandling während des Experiments möglicherweise nicht möglich ist.

Einleitung

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Mäuse und Ratten sind wesentliche Vermögenswerte für präklinische Studien1,2 für mehrere Zwecke, einschließlich endokriner, physiologischer, pharmakologischer oder Verhaltensstudien2. Aus der zunehmenden Anzahl von Tierstudien ergab sich, dass unkontrollierte Umweltvariablen einschließlich menschlicher Interaktion verschiedene Ergebnisse in der biomedizinischen Forschung beeinflussen3,4,5. Dies ist verantwortlich für die signifikante Variabilität, die in Experimenten und Forschungslabors4,5beobachtet wurde, was einen großen Vorbehalt in der Tierforschung darstellt.

Verschiedene Ansätze wurden mit dem Ziel implementiert, die Auswirkungen von Umweltstressoren zu begrenzen und die Reaktivität auf menschliche Interaktion zu reduzieren. Um beispielsweise die Auswirkungen von Umweltstressoren zu begrenzen, wurden laborübergreifendeine Standardisierungder Gehäusebedingungen und automatisierte Gehäusesysteme 6,7 implementiert. In Bezug auf die Interaktion mit Menschen hatten die üblicherweise verwendeten Ansätze für den Umgang mit und den Transport von Tieren wenig Rücksicht auf tierische Beschwerden und Stress. Zum Beispiel erhöht das Aufnehmen von Tieren am Schwanz oder die Verwendung einer Stoßzette8 die Grundangst9,10,11, reduziert die Exploration9,12 und trägt erheblich zur interinternen Variabilität innerhalb und zwischen den Studien bei13,14. Als Ergebnis wurden andere Ansätze entwickelt, wie die Cup-Handling-Technik, die auf Mäuse und Ratten anwendbar ist. Bei diesem Ansatz werden die Tiere aus ihrem Käfig "geschröpft" und von den Experimentatoren mit ihren Händen gehalten, die eineTasse 9,10,11bilden . Eine weitere nützliche Alternative zum Tail-Handling ist die Verwendung eines Polycarbonattunnels zum Transfer von Mäusen9,10,15. Dieser Ansatz eliminiert die direkte Interaktion zwischen der Maus und dem Experimentator. Sowohl der Cup- als auch der Tunnelansätze zeigten Wirksamkeit bei der Verringerung angstähnlicher Verhaltensweisen und Ängste vor dem Experimentator, die durch aversive Handhabungstechniken wie Tail Pick Up / Tail Handling übertrieben werden können9,10.

Daher zeigen zunehmende Beweise die Nützlichkeit der richtigen Handhabung von Mäusen für die Verringerung der Variabilität zwischen Individuen9,11und die Verbesserung des Tierschutzes10. Die oben genannten Techniken sind jedoch immer noch mit Einschränkungen konfrontiert. Die Cup-Handling-Technik wurde mit Zeitplänen implementiert, die von 10 Tagen (10 Sitzungen über 2 Wochen16)bis zu 15 Wochen17reichen, was für das Personal der Einrichtung und die Experimentatoren eine beträchtliche Zeitspanne darstellt. Darüber hinaus variiert die Effektivität des Cup-Handlings je nach Stamm9 und herkömmliches Cup-Handling in offenen Händen kann dazu führen, dass naive Mäuse oder besonders sprunghafte Stämme aus der Handspringen 9,18. Der Tunnelabschlag führt zu konsistenteren und im Allgemeinen schnelleren Ergebnissen bei Gentling19. Tunnel werden auch als Käfiganreicherung zu Hause verwendet. Sie helfen Tieren, sich an eine schnelle Handhabung zu gewöhnen und bieten die zusätzlichen Vorteile der Anreicherung. Der Tunnelabling hat jedoch Einschränkungen beim Transfer von Tieren zwischen Geräten. Interessanterweise zeigten und West9und Henderson et al.20, dass die sanfte und kurze manuelle Handhabung, um Tiere aus dem Tunnel in den Apparat zu übertragen, ihren Phänotyp nicht beeinflusst.

Um eine Alternative zu bestehenden Methoden mit erreichbarer Gewöhnung in kurzer Zeit zu bieten, beschreibt dieser Artikel eine neuartige Technik, die die Becherhandhabungstechnik erweitert und daher keine besondere Ausrüstung erfordert. Dieser Ansatz verwendet Meilensteine, um den Komfort von Mäusen mit dem Handhabungsprozess zu messen. Es zeigt Wirksamkeit bei der Verringerung der Reaktivität und des Stresses der Maus (auf Verhaltens- und Hormonebene), erleichtert die routinemäßige Handhabung und trägt zur Verringerung der Variabilität zwischen den Tieren bei. Details zu dieser Technik werden hier bereitgestellt, und ihre Wirksamkeit bei der Verringerung angstähnlicher Verhaltensweisen, der Verbesserung der Interaktion mit Experimentatoren und der Begrenzung der freisetzung von peripherem Stresshormon (Corticosteron) wird in zwei separaten Studien (männliche und weibliche Mäuse) im Vergleich zu Tunnelhandhabung (Positivkontrolle) und Schwanzbehandlungstechniken (Negativkontrolle) nachgewiesen.

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Protokoll

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Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom CAMH-Tierpflegeausschuss genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt.

HINWEIS: Die hier beschriebene Handhabungsmethode kann in verschiedenen Mausstämmen verwendet werden, einschließlich nicht-transgener (C57/BL6, BalbC, CD1, SV129 usw.) und transgener Linien. Es kann auch mit jungen oder alten Mäusen verwendet werden, wobei festgestellt wird, dass junge erwachsene (4-6 Wochen alte) Mäuse dazu neigen, etwas aktiver zu sein als erwachsene oder alte Mäuse, besonders an Tag 1.

1. Experimentelle Vorbereitung

  1. Vor Beginn der Studie werden gemäß den ARRIVE-Richtlinien21Mäuse nach dem Zufallsprinzip jeder Handhabungsgruppe (3D-Handling, Tunnel Handling oder Tail Handling) zugewiesen.
  2. Identifizieren Sie den Raum, in dem die Handhabung durchgeführt werden soll. Es kann im Wohnraum oder in einem separaten Raum durchgeführt werden. Wenn die Handhabung in einem separaten Raum durchgeführt wird, was erfordert, dass die Tiere auf einem beweglichen Wagen bewegt werden, lassen Sie die Tiere vor Beginn des Handhabungsprotokolls 20-30 Minuten lang an den neuen Raum gewöhnen.
  3. Verwenden Sie für Gruppentiere einen temporären Käfig, um Mäuse nach der Handhabung unterzubringen, bevor Sie sie alle in ihrem ursprünglichen Heimkäfig gruppieren. Dies reduziert mögliche Kämpfe zwischen Tieren vor der Handhabung (insbesondere bei Männchen).
  4. Arbeiten Sie an einer Theke (vorzugsweise einer gereinigten Arbeitsplatte) oder in einer Biosicherheitswerkbank, wobei der Haltungskäfig vom Tier entfernt behandelt wird. Die Nähe zum Gehäusekäfig erhöht das Sprungrisiko. Wenn Tiere in Gruppen untergebracht sind, kann das Springen der Maus, die in den Hauskäfig gehandhabt wird, Stress für Käfigkameraden verursachen.
    HINWEIS: Die Arbeit in einer Biosicherheitswerkbank begrenzt das Risiko, dass Mäuse auf den Boden springen, und kann in bestimmten Einrichtungen erforderlich sein. Diese Technik kann in einer Biosicherheitswerkbank verwendet werden, um sicherzustellen, dass immer alle Schritte innerhalb der Biosicherheitswerkbank ausgeführt werden und Mäuse nicht auf den Unterarmen des Handlers laufen.

2. TAG 1: 5 min pro Maus

  1. Öffnen Sie vorsichtig den Käfig und legen Sie den Deckel auf die Seite, entfernen Sie Nistmaterial und andere Anreicherungen wie Laufräder oder Unterstände.
  2. Führen Sie eine behandschuhte offene Hand in den Heimkäfig ein und legen Sie die Hand langsam entlang einer Seite der Käfigwand (die Wand, die dem Handler am nächsten ist, Abbildung 1A).
    1. Versuchen Sie nicht sofort, die Maus in die Hand zu nehmen.
  3. Bleiben Sie unbeweglich und lassen Sie das Tier sich für etwa 30 s an die Anwesenheit der Hand im Käfig gewöhnen.
  4. Versuchen Sie, die Maus in der Handfläche aufzunehmen (d. H. Vermeiden Sie es, das Tier am Schwanz aufzuheben).
    1. Wenn die Maus nach 3 Versuchen nicht leicht aufgenommen werden kann, führen Sie die Maus mit beiden Händen in eine Ecke und Tasse.
    2. Bewegen Sie die schröpften Hände vorsichtig in Richtung maus, um zu versuchen, sie aufzunehmen.
    3. Wenn sie nach maximal 3 Versuchen mit beiden Händen nicht erfolgreich ist, nehmen Sie die Maus sanft an der Schwanzbasis auf und übertragen Sie sie auf Ihren Unterarm oder Ihre flache Hand.
  5. Halten Sie die Hand mit der Maus in der Hand so flach und offen wie möglich.
    HINWEIS: Dies bietet eine flache Plattform, auf die die Maus treten kann, und begrenzt das Risiko von Bissen.
  6. Halten Sie die Hand offen und flach mit der Handfläche nach oben, legen Sie die andere Hand neben die Hand, die die Maus hält, und lassen Sie die Maus frei von Hand zu Hand ohne Einschränkungen bewegen (Abbildung 1B).
  7. Lassen Sie die Maus erkunden und bewegen Sie sich zwischen den Händen für 1 min.
    1. An diesem Punkt können Mäuse versuchen, wegzuspringen. Positionieren Sie die Hände so, dass die Maus, wenn sie springt, auf einer Arbeitsplatte und nicht auf dem Boden landet.
    2. Wenn eine Maus so aussieht, als würde sie sich auf den Sprung vorbereiten (sich zum Rand der Hand bewegen und sich auf den Hinterbeinen aufziehen), legen Sie langsam die andere Hand davor und versuchen Sie, sie dazu zu bringen, auf diese Hand zu gehen. Vermeiden Sie plötzliche Bewegungen, da dies das Risiko des Springens erhöht.
    3. Wenn eine Maus springt, versuchen Sie, sie aufzunehmen, um die Schwanzbehandlung zu vermeiden, und setzen Sie die Handhabungssitzung fort. Wenn die Maus länger als 10 s auf dem Boden oder außerhalb der Hände bleibt, fügen Sie der Handhabungssitzung zusätzliche Zeit hinzu, um die Zeit auszugleichen, in der die Maus nicht in den Händen war.
    4. Machen Sie sich Notizen vom Sprung. Die Gesamtzahl der Sprünge kann verwendet werden, um die potenzielle Variabilität zwischen den Tieren zu bewerten.
  8. Nach 1 Minute Handhabung mit flachen Händen entspannen Sie die Handfläche und halten die Maus leicht in der Hand, bevor Sie die Maus vorsichtig zwischen den Händen rollen(Abbildung 1C).
    1. Um zu "rollen", positionieren Sie die Maus in der Handfläche, auf einer flachen Hand, senkrecht zu den Fingern.
    2. Schließen Sie langsam die Hand und legen Sie die Finger auf die Rückseite der Maus.
    3. Legen Sie die freie Hand direkt unter die Hand und halten Sie die Maus.
    4. Drehen Sie die Hand langsam mit der Maus, um die Maus vorsichtig auf die andere Hand zu übertragen (180° Flip).
    5. Wiederholen Sie dies zwischen den Händen hin und her.
  9. Wechseln Sie zwischen sanften Rollen zwischen den Händen und freier Erkundung auf offenen Händen für 60 s, abwechselnd zwischen Techniken etwa alle 20 s.
  10. Führen Sie einen "Shelter-Test" durch (Abbildung 1D).
    1. Lassen Sie die Maus zum Rand der Hand bewegen und bringen Sie dann die 2 Hände zusammen.
    2. Bechern Sie sie sehr langsam, damit die Maus in einen von den Händen gebildeten "Unterschlupf" passt. Lassen Sie eine Öffnung, damit die Maus bei Bedarf entkommen kann.
    3. Ziel ist es, die Maus für 5-10 s ohne Einschränkungen im Unterschlupf zu halten.
    4. Wechseln Sie zwischen dem Shelter-Test, rollen Sie zwischen den Händen und der freien Erkundung der offenen Hände für weitere 60 s, wobei Sie sicherstellen, dass Sie den Shelter-Schritt 3 oder mehr Mal durchführen.
  11. Bei allen in 2.10 beschriebenen Verfahren sollten Sie den Prozess nicht überstürzen. Wenn die Maus gestresst erscheint (d. H. Zaghaft zu entkommen, springt von den Händen, vermeidet den Kontakt mit den Händen usw.), indem sie in den Händen eingeschlossen wird, fahren Sie mit dem Rollen zwischen den Händen und der freien Erkundung für 20 s fort und versuchen Sie es dann erneut.
  12. Meilenstein: Führen Sie mindestens 1 erfolgreichen Shelter-Test von 10 s für den Abschluss von Tag 1 durch.
    1. Betrachten Sie einen Shelter-Test als erfolgreich, wenn die Maus in den Händen bleibt. Wenn die Maus den Kopf herausspringt und in den Unterstand zurückkehrt, ist es immer noch ein erfolgreicher Test. Wenn das Tier vollständig aus dem Tierheim austritt, ist es ein Misserfolg.
  13. Erlauben Sie freie Erkundung in händen für 30 s.
  14. Ersetzen Sie vorsichtig die Maus in ihrem Käfig. Wenn die Gruppe untergebracht ist, legen Sie die Maus in den temporären Käfig, bis alle Käfigkameraden behandelt sind. Bringen Sie die Mäuse in ihren ursprünglichen Käfig zurück, indem Sie sie in der Handfläche aufheben. Verwenden Sie keine Schwanzabholung.
  15. Reinigen Sie die Tischplatte von potenziellem Kot und Urin mit 70% Ethanol.
  16. Spülen Sie Handschuhe gründlich mit 70% Ethanol (oder einer geeigneten Reinigungslösung) oder wechseln Sie die Handschuhe vor dem Umgang mit der nächsten Maus (es ist möglich, die gleichen Handschuhe für Käfigkameraden zu behalten).
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Handhabung mit einer angemessenen Anzahl von Tieren durchzuführen, um eine Ermüdung durch den Handler zu vermeiden. Die Handhabung von 24 Mäusen dauert etwa 2 Stunden und es wird empfohlen, 24 Mäuse pro Handler nicht zu überschreiten. Wenn mehr Tiere behandelt werden müssen, wird empfohlen, entweder mehrere Handler zu haben oder die Handhabungsverfahren über mehrere Tage in Untergruppen aufzuteilen.

3. TAG 2: 3 bis 5 min pro Maus

  1. Versuchen Sie, die Maus in der Handfläche aufzunehmen. In diesem Stadium sollte es bereits machbar sein und Mäuse sollten nicht aus der Hand springen.
  2. Beginnen Sie mit einer offenen Handfläche wie an Tag 1, so dass die Maus 20 s lang frei erkunden kann.
  3. Dann rollen Sie die Maus ein paar Mal zwischen den Händen (4-5 mal).
  4. Führen Sie den "Shelter-Test" für 5 s durch.
  5. Wiederholen Sie den Shelter-Test mehrmals (~ 5-6) über einen Zeitraum von 2 bis 3 Minuten.
  6. Wechseln Sie während des gleichen Zeitraums von 2 bis 3 Minuten mit dem Rollen zwischen den Händen und der freien Erkundung offener Hände ab Tag 1, um die Gewöhnung zu verbessern.
    1. Berühren Sie die Maus 5-6 Mal auf kopf und hinten (Abbildung 1E). Ein Zeichen der Gewöhnung ist, wenn die Maus Sie berühren lässt, ohne zu versuchen, zu entkommen.
    2. Führen Sie einen "Nose Poke" durch: Versuchen Sie, die Schnauze der Maus 2 bis 3 Mal zu berühren (Abbildung 1F).
      1. Wenn die Maus versucht zu beißen oder offensichtliche Anzeichen von Stress bei berührung zeigt, versuchen Sie nicht sofort, die Nase erneut zu stochern. Wechseln Sie sich stattdessen mit flachen Handerkundungen und Rollen ab. "Gewöhnung" spiegelt sich darin wider, dass das Tier bei menschlichem Kontakt nicht wegläuft oder den Kopf dreht.
  7. Bei allen in 3.4-3.6 beschriebenen Verfahren sollten Sie den Prozess nicht überstürzen. Wenn die Maus gestresst erscheint, indem sie in den Händen eingeschlossen ist oder nicht berührt werden möchte, rollen Sie 20-30 s zwischen den Händen und versuchen Sie es dann erneut.
  8. Meilensteine: Führen Sie mindestens 1 erfolgreichen Nasenstocher für 2-3 s durch, um Tag 2 abzuschließen.
  9. Beenden Sie diese Sitzung nach ca. 3 Minuten Handhabung, wenn das Tier gut auf das "Tierheim", "Kopfstreicheln", "Nasenstocher" reagiert und wenn die Maus bereit zu sein scheint, die Hände ohne Anzeichen von Stress zu erkunden.
  10. Wenn die Maus weiterhin Anzeichen von Stress zeigt oder nicht gut auf den "Shelter Test" oder "Nose Poke" -Test reagiert, setzen Sie die Sitzung fort, bis Sie 5 Minuten wie an Tag 1 erreicht haben.
  11. Ersetzen Sie die Maus in ihrem Käfig, reinigen Sie die Tischplatte und die Handschuhe wie in Tag 1.

4. TAG 3: Ca. 3 min pro Maus

  1. Fahren Sie am dritten Tag mit den gleichen Schritten wie in Tag 2 fort, für 2 bis 3 Minuten.
    1. Nehmen Sie die Maus in die Handfläche.
    2. Übertragen und rollen Sie die Maus zwischen den Händen
    3. Führen Sie einen Shelter-Test durch.
    4. Versuchen Sie, die Maus auf dem Rücken und Kopf zu streicheln.
  2. Wechseln Sie zwischen diesen Schritten über ca. 1 bis 2 min.
  3. Setzen Sie den Vorgang fort, bis die Maus entspannt genug ist, um in der Handfläche zu sitzen, ohne zu versuchen, zu entkommen.
  4. Wiederholen Sie vor dem Ende von Tag 3 den Shelter-Test und den Nose-Poke-Test als Gewöhnungstest.
    1. Wenn beide Tests beim ersten Versuch abgeschlossen werden können, ist der Gewöhnungsprozess abgeschlossen. Fahren Sie mit der Maus 30 s bis zu einer Minute lang vorsichtig fort.
    2. Wenn die Maus zunächst resistent gegen einen der beiden Tests ist, wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.3 für 20-30 s, bevor Sie den Nasenstocher und den Shelter-Test erneut versuchen.
    3. Wenn die Maus nach 3 Minuten gegen diese Tests resistent bleibt, kann der dritte Tag wiederholt werden.
  5. Meilensteine: Führen Sie mindestens 2 erfolgreiche Shelter-Tests von jeweils 10 s und 2 erfolgreiche Nose-Poke-Tests für den Abschluss von Tag 3 und den Abschluss des gesamten 3D-Handling-Verfahrens durch.
  6. Bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück, reinigen Sie die Tischplatte und die Handschuhe.

5. Fakultativer Ansatz für Tiere, die zur Injektion oder Wüstung zurückzuhalten sind

HINWEIS: Wenn das Tier an Tag 3 zu Versuchszwecken (mundliche Gavage, intraperitoneale Injektion usw.) zurückgehalten wird, können die Mäuse dem Nackenquetschtest unterzogen werden.

  1. Greifen Sie den Nacken zwischen Daumen und Zeigefinger (Abbildung 1G).
  2. Heben Sie die Maus 3-5 cm über die Hand für 2-3 s.
    HINWEIS: Dies ist normalerweise eine nicht natürliche Position für erwachsene Mäuse, und wenn die Mäuse in der Nähe von unbeweglich bleiben, sind sie gut an die Handhabung gewöhnt und können für experimentelle Zwecke leicht zurückgehalten werden.
  3. Legen Sie die Maus wieder in die flache Hand, oder wenn die Maus auf die Nackenklemme reaktiv ist, sollten Sie sie auf die Hülle, den Käfigdeckel oder die Arbeitsplatte des Experimentators legen.
    HINWEIS: Wenn Sie in einer Biosicherheitswerkbank arbeiten, legen Sie die Maus nicht auf die Hülse, da sie sonst die Biosicherheitswerkbank verlassen und verlassen könnte. Legen Sie die Maus lieber auf die Arbeitsplatte in der Biosicherheitswerkbank.
  4. Lassen Sie die Maus die Hand des Experimentiers für 1 minute frei erkunden.

6. Optionaler Ansatz für zusätzliche Bearbeitungstage

  1. Im Falle einer stark beanspruchten Mauslinie fügen Sie zusätzliche Tage hinzu, um die Reaktivität und das Stressniveau der Tiere zu verringern, indem Sie die in Tag 2/3 beschriebenen Methoden verwenden.
    HINWEIS: Viele Faktoren können den Ausgangsstress der Tiere beeinflussen, einschließlich Belastung, Vorhandensein transgener Modifikationen, Alter, Geschlecht und Haltungsbedingungen. Wenn diese Faktoren zwischen Gruppen wie gealterten Tieren, die gegen junge Kontrollen getestet werden, oder transgenen Tieren, die gegen Wildtypkontrollen getestet werden, nicht konsistent sind, wird empfohlen, für jede Gruppe die gleiche Anzahl von Gewöhnungstagen zu verwenden.

7. Tunnelabfertigung

HINWEIS: Diese Technik gilt nur für die mit tunnelbehabten Mäusen. Tunnel sind Polycarbonatrohre von etwa 13 cm Länge und 5 cm Durchmesser.

  1. Legen Sie den Tunnel in den Käfig der Maus.
  2. Lassen Sie den Tunnel vor der Handhabung 7 Tage im Käfig.
  3. Öffnen Sie den Käfig und legen Sie den Deckel auf die Seite.
  4. Führen Sie die Maus vorsichtig in den Polycarbonattunnel (bereits im Käfig).
  5. Heben Sie den Tunnel horizontal aus dem Käfig. Falls erforderlich, decken Sie die Enden des Tunnels locker ab, um zu verhindern, dass das Tier aus dem Tunnel springt / fällt und möglicherweise in seinen Käfig oder auf den Boden zurückfällt.
  6. Bewegen Sie das Tier im Tunnel weg vom Hauskäfig und halten Sie es 30 s lang von allen Oberflächen fern.
  7. Legen Sie den Tunnel wieder in den Heimkäfig, damit die Maus die Röhre verlassen kann.
  8. Warten Sie 60 s und wiederholen Sie dann die Schritte 7.4-7.7 einmal.
  9. Spülen Sie Handschuhe gründlich mit 70% Ethanol aus oder wechseln Sie die Handschuhe, bevor Sie sich an die nächste Maus gewöhnen.
  10. Wiederholen Sie diesen Vorgang für 10 aufeinanderfolgende Tage.

8. Tail Handling

HINWEIS: Diese Technik gilt nur für Mäuse mit Schwanz. Es wird verwendet, um Mäuse aus ihrem Käfig in einen Apparat zu übertragen und umgekehrt.

  1. Öffnen Sie den Käfig und legen Sie den Deckel auf die Seite.
  2. Greifen Sie die Mäuse an der Schwanzbasis zwischen Daumen und Zeigefinger.
  3. Heben Sie die Maus aus dem Käfig.
  4. In 2-3 s die Maus auf den gegenüberliegenden Unterarm des Experimentatores übertragen, während Sie einen Griff am Schwanz behalten, um ein Baumeln der Maus zu vermeiden.
  5. Wenn bei der Durchführung dieses Experiments eine Schwanzbehandlung erforderlich ist (z. B. vor Blutentnahmen für Cortisoltests), werden die Tiere durch Schwanzhandhabung in den Unterarm des Versuchshelfers übertragen und 15 s lang gehalten, bevor sie in ihren Käfig zurückgebracht werden.

9. Erhöhtes Plus Labyrinth

  1. Raumaufstellung
    1. Platzieren Sie das Labyrinth in der Mitte des Raumes unter einer Digitalkamera, die mit einer Speicherkarte ausgestattet ist.
    2. Stellen Sie das Licht des Raumes bei ~ 60 Lux mit 2 Stehlampen auf, die hinter dem Labyrinth platziert sind.
    3. Schalten Sie die Deckenbeleuchtung aus, um direktes Licht auf das Labyrinth zu vermeiden, das Reflexion erzeugt und die Erkennung der Tiere im Labyrinth stört.
    4. Sobald die gesamte Ausrüstung eingerichtet ist, bringen Sie die Tiere in den Raum und lassen Sie sie für 30 Minuten an die Lichteinstellungen und die neue Umgebung gewöhnen.
  2. Testen
    1. Reinigen Sie das Labyrinth mit 70% Ethanol, um Gerüche von Staub oder dem zuvor getesteten Tier zu vermeiden.
    2. Starten Sie die Kamera.
    3. Verwenden Sie ein Blatt Papier mit dem Tierausweis, um den Ausweis auf dem Video aufzuzeichnen, bevor Sie das Tier in das Labyrinth legen (dies erleichtert die korrekte Identifizierung, welche Maus auf jedem Video gefilmt wird).
    4. Verwenden Sie die entsprechende Handhabungstechnik für jedes Tier, um es in das Labyrinth zu übertragen.
    5. Platzieren Sie die Maus auf der zentralen Plattform mit Blick auf einen offenen Arm.
    6. Lassen Sie die Maus das Gerät 10 Minuten lang ungestört erkunden.
    7. Stoppen Sie die Kamera nach 10 Minuten.
    8. Holen Sie die Maus aus dem Labyrinth und setzen Sie sie wieder in ihren Käfig.
    9. Reinigen Sie Kot und Urin aus dem Labyrinth mit 70% Ethanol.
    10. Sobald der Test mit allen Mäusen abgeschlossen ist, übertragen Sie Videos von der Speicherkarte auf einen Computer für die Videoverfolgung.
    11. Verfolgen Sie mithilfe einer automatisierten Tierverfolgungssoftware die Anzahl der Einträge zu den offenen und geschlossenen Armen und die Zeit, die in offenen oder geschlossenen Armen verbracht wird (hier Ethovision XT 14).

10. Experimenter Interaction (abgeleitet von und West9)

  1. Raumaufstellung
    1. Stellen Sie einen Tisch in der Mitte des Testraums unter eine Digitalkamera, die mit einer Speicherkarte ausgestattet ist.
    2. Stellen Sie das Licht auf 50-70 Lux mit 4 Glühbirnen auf, die in der Ecke des Raumes zur Decke hin platziert sind. Schalten Sie die Deckenbeleuchtung aus, um direktes Licht auf das Labyrinth zu vermeiden, das Reflexion erzeugt und die Erkennung der Tiere in der Arena stört.
    3. Bringen Sie die Tiere ins Zimmer.
    4. Lassen Sie sie sich für 30 Minuten in den Raum akklimatisieren.
  2. Experiment
    1. Stellen Sie den Heimkäfig unter die Digitalkamera.
    2. Entfernen Sie den Deckel.
    3. Entfernen Sie Nistmaterial und andere Anreicherungen, die die Verfolgung von Tieren beeinträchtigen könnten.
    4. Starten Sie die Kamera.
    5. Verwenden Sie die Käfigkarte mit dem Tierausweis, um das Tier auf dem Video zu identifizieren.
    6. Legen Sie eine Hand in den Hauskäfig entlang der Wand des Käfigs auf der vorderen rechten Seite.
      1. Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Handlers die Kamera nicht blockiert, um die Maus zu filmen.
    7. Starten Sie einen Timer.
    8. Halten Sie die Hand 2 Minuten lang unbeweglich und lassen Sie die Maus die Hand erkunden.
    9. Nehmen Sie die Hand für 15 s aus dem Käfig.
    10. Versuchen Sie, die Maus mit schröpften Händen aufzuheben und zeichnen Sie auf, ob die Maus flieht.
    11. Wiederholen Sie den letzten Schritt bis zu fünf Mal, alle 5 Sekunden oder bis die Maus sich selbst aufnehmen lässt.
    12. Notieren Sie die Anzahl der Versuche, die erforderlich sind, um die Maus aufzunehmen.
    13. Nistmaterial und Anreicherung in den Käfig zurückgeben.
    14. Reinigen Sie die Handschuhe mit 70% Ethanol oder wechseln Sie die Handschuhe, bevor Sie zum nächsten Tier übergehen.
    15. Übertragen Sie nach dem Testen Videos von der Speicherkarte auf einen Computer.
    16. Teilen Sie den Käfig mithilfe einer automatisierten Video-Tracking-Software in vier gleiche Quadranten auf und zeichnen Sie die Zeit auf, die die Maus in jedem Quadranten verbracht hat (hier Ethovision XT 14).

11. Neuheit Unterdrückte Fütterung

  1. Nahrungsentzug
    1. Führen Sie 3 Tage vor dem Test einen vollständigen Käfigwechsel durch und beherbergen Sie die Tiere (eine Einzelunterkunft ist vorzuziehen, um den Käfigtest zu Hause durchzuführen).
      HINWEIS: Die Bereitstellung von frischer Einstreu entfernt potenziellen Staub oder kleine Futterstücke, die sich seit dem letzten Käfigwechsel in der Einstreu ansammeln.
    2. Am Tag vor dem Test alle Tiere gegen 18 Uhr wiegen.
    3. Entfernen Sie alle Lebensmittel aus dem Futtertrichter und stellen Sie sicher, dass sich keine Futterstücke im Käfig oder in der Einstreu befinden.
  2. Raumaufstellung
    1. Legen Sie die NSF-Kammer auf einen Tisch.
    2. Füllen Sie die Kammer mit einer dünnen Schicht Maiseinstreu (oder einer anderen Einstreu, die sich von der Einstreu unterscheidet, die im Hauskäfig von Tieren verwendet wird).
    3. Stellen Sie das Licht bei 70 Lux mit 4 Glühbirnen auf, die in der Ecke des Tisches platziert sind, wo die Kammer steht, zur Decke hin. Schalten Sie die Deckenbeleuchtung aus, um eine geringe Raumbeleuchtung beizubehalten.
    4. Legen Sie ein Pellet Standard-Chow, das in der Anlage verwendet wird, auf die dem Experimentator zugewandte Seite der Kammer (≈10 cm von der Wand entfernt).
  3. Testen
    1. Bringen Sie die Tiere morgens nach dem Nahrungsentzug 30 Minuten vor dem Test in den Raum, damit sie sich an die Lichteinstellungen und die neue Umgebung gewöhnen können.
    2. Wiegen Sie alle Tiere, um ihren Gewichtsverlust basierend auf dem am Vortag gemessenen Gewicht zu messen. Tiere sollten über Nacht 8-12% verlieren, um die Aufgabe richtig ausführen zu können.
    3. Sortieren Sie die Tiere nach Gewichtsverlust und screenen Sie sie von der Maus, die am meisten verloren hat, bis zur Maus, die am wenigsten Gewicht verloren hat.
    4. Stellen Sie sicher, dass die Kammer mit Einstreu und mit einem einzigen Pellet gefüllt ist.
    5. Legen Sie das Tier auf die gegenüberliegende Seite der Kammer, weg vom Futterpellet.
    6. Starten Sie den Timer sofort.
    7. Lassen Sie die Maus die Kammer bis zu 12 Minuten lang erkunden.
    8. Messen Sie die Latenz, um sich dem Futterpellet zu nähern und zu füttern (Tier muss beißen und essen).
      1. Betrachten Sie es als einen Ansatz, wenn das Tier dem Pellet nahe kommt, es riecht und nicht beißt.
      2. Definieren Sie einen Biss, wenn das Tier beginnt, das Pellet zu konsumieren.
    9. Notieren Sie die Latenz, um sich dem Pellet in Sekunden zu nähern und es zu füttern.
    10. Sobald sich die Maus von dem Futterpellet ernährt hat, entfernen Sie die Maus aus der Kammer.
    11. Entsorgen Sie die Bettwäsche, aber speichern Sie das Pellet, das zum Testen des Appetits im Maus-Heimkäfig verwendet wird.
    12. Setzen Sie die Kammer für das nächste Tier zurück und fahren Sie mit dem nächsten Tier fort.
    13. 15 Minuten nach Abschluss des Tests in der Kammer das während des Tests verwendete Pellet im Hauskäfig der Maus gegen die Wand an der Vorderseite des Käfigs fallen lassen.
    14. Messen Sie die Latenz, um sich vom Pellet zu ernähren, wenn sich das Pellet im Heimkäfig befindet. Dies ist eine Maßnahme für den Appetittrieb.
      1. Es ist vorzuziehen, das Nistmaterial zu entfernen, um sicherzustellen, dass die Maus sieht, dass das Pellet in ihren Käfig fällt.

12. Serumsammlung und Corticosteronmessung

  1. Behandeln Sie Tiere für 1 Minute mit der zugewiesenen Technik, 15 Minuten vor der Blutentnahme (dies kann mit Gruppen- oder Einzeltieren erfolgen, wobei das Risiko von Kämpfen bei der Umgruppierung von Mäusen zu berücksichtigen ist).
    1. Für die tunnelgeleiteten Mäuse führen Sie sie zum Tunnel, heben Sie den Tunnel für 1 Minute aus dem Käfig und ersetzen Sie die Maus in ihrem Käfig.
    2. Für Mäuse mit Schwanzgriff greifen Sie die Schwanzbasis der Maus und entfernen Sie die Maus aus ihrem Käfig. Übertragen Sie die Maus für 1 Minute in die Experimentierhülle und bringen Sie die Maus durch Schwanzhandhabung in ihren Käfig zurück.
    3. Verwenden Sie bei Mäusen mit 3D-Griff die Maus mit schröpftigen Händen, um die Maus aus ihrem Käfig zu entfernen. Halten Sie die Maus 1 Minute lang in schröpften Händen und bringen Sie sie in ihren Käfig zurück.
  2. 15 Minuten nach der Handhabung mit der Blutentnahme aus der Submandibulärvenefortfahren 22.
  3. Die Maus fest so schuppen, dass der Kopf der Maus sicher immobilisiert ist.
  4. Suchen Sie die Punktionsstelle.
    1. Es gibt einen kleinen haarlosen Grübchen entlang des Unterkiefers des Gesichts, der als Wahrzeichen verwendet werden kann, um die Einstichstelle zu lokalisieren. Wenn man eine Linie zwischen der Basis des Kiefers und diesem Grübchen zieht, liegt die Einstichstelle hinter diesem Grübchen in Richtung Ohr um etwa 5 mm, direkt hinter dem Scharnier des Kiefers.
  5. Halten Sie eine saubere 23 G Nadel senkrecht zur Einstichstelle und verwenden Sie eine schnelle feste Stechbewegung. Die Nadelspitze sollte bis zu einer Tiefe zwischen 1-2 mm eindringen, Blut fließt sofort, sobald die Vene punktiert wird.
  6. Sammeln Sie ~ 150 μL Blut in EDTA-beschichteten Entnahmeröhrchen und lagern Sie sie auf Eis.
  7. Tragen Sie leichten Druck mit einem sterilen Mullkissen für 5 s oder mehr auf die Einstichstelle aus, damit das Blut gerinnen kann.
  8. Sobald das Blut geronnen ist, bringen Sie die Maus in ihren Heimatkäfig zurück.
  9. Zentrifugenblut bei 4 °C 3.500 x g für 10 min.
  10. Dekantieren Sie den Überstand.
  11. Lagern Sie den Überstand bei -20 °C für nachgeschaltete Analysen.
  12. Messen Sie den Corticosteronspiegel mit einem Corticosteron-ELISA-Kit nach dem Protokoll des Herstellers.
  13. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die ELISA-Ergebnisse abzulesen.

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Ergebnisse

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Zwei separate Studien wurden mit C57BL/6-Mäusen durchgeführt. Studie #1 umfasste 6 Monate alte Männer und Studie #2 umfasste 2,5 Monate alte Frauen (N = 36 / Studie) von Jackson Laboratories (Cat #000664). Mäuse kamen im Alter von 2 Monaten in die Einrichtung. Während Studien- #2 Frauen zwei Wochen nach der Ankunft behandelt und getestet wurden, wurden Studien- #1 Männer erst im Alter von 6 Monaten behandelt und getestet (Verzögerung aufgrund der globalen Pandemiestilllegung). Während dieser Zeit starb eine Maus aus Stud...

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Diskussion

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Diese Studie und Methodenentwicklung basieren auf der Beobachtung, dass Handhabungstechniken bei Mäusen von der wissenschaftlichen Gemeinschaft immer noch übersehen werden und dass einige Labore immer noch zögern, Gewöhnungs- oder Handhabungstechniken zu implementieren, um Stress und Reaktivität ihrer Tiere vor den Experimenten zu reduzieren. Obwohl es sich um einen zeitlichen Einsatz handelt, bietet der Umgang mit Tieren positive Auswirkungen auf die Tiere, die zum Erfolg der durchzuführenden Experimente beitragen könne...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Danksagungen

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Die Autoren danken dem Animal Care Committee von CAMH für die Unterstützung dieser Arbeit sowie den Tierpflegern von CAMH, die umfangreiches Feedback zur Nützlichkeit des Verfahrens gegeben haben, die Durchführung der beschriebenen Experimente und die Einreichung des detaillierten Protokolls für andere Benutzer motiviert haben. Diese Arbeit wurde teilweise von der CAMH BreakThrough Challenge finanziert, die an TP vergeben wurde, und aus internen Mitteln von CAMH.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
23 G x 1 Zoll BD PrecisionGlide sterile Injektionsnadel für den allgemeinen Gebrauch. Normaler Wandtyp und regelmäßige Abschrägung.BD2546-CABD305145Nadeln für die Blutentnahme
BD Vacutainer® Venöse Blutentnahme EDTA-Röhrchen mit Lavendel BD Hemogard & Handel; Verschluss, 2,0 ml (13x75 mm), 100/pkBD367841EDTA Beschichtete Röhrchen für die Blutentnahme
Bed' o cobs ¼ ” Einstreu für Labortiere aus MaiskolbenBed-O-CobsBEDO1/4Neuartige Einstreu für neuartige unterdrückte Fütterung
ZentrifugeEppendorfCentrifuge 5424 RZur Zentrifugation von Blut.
Corticosteron ELISA KitArbor AssaysK003-H1W
DigitalkameraPanasonicHC-V770Kamera zur Aufzeichnung von EPM/Experimentator-Interaktionen
Elevated Plus MazeHome Maden/aCustom Maze bestehend aus vier schwarzen Plexiglasarmen (zwei offene Arme (29 cm lang und 7 cm breit) und zwei geschlossenen Armen (29 cm lang x 7 cm breit mit 16 cm hohen Wänden)), die eine Kreuzform bilden, wobei die beiden offenen Arme einander gegenüberliegen 55 cm über dem Boden gehalten
EthanolMedstore House Brand39753-P016-EA95Auf 70% mit destilliertem Wasser verdünnen, zur Reinigung
Ethovision XT 15Noldusn/aAutomatisierte Tierverfolgungssoftware
Labor NagetierdiätLabDiätNagetierdiät 5001Standard Nagetierdiät
SpeicherkarteKingstone TechnologySDA3/64GBFür Videoaufnahmen und Dateiübertragung
Neuheit Unterdrückte FütterungskammerHausgemachtn/aBenutzerdefinierte Test-Testkammer aus Plexiglas mit klaren Böden und Wänden 62 cm lang, 31 cm breit x 40 cm hoch.
Parlycarbonat-TubenHausgemachtn/a13 cm lang und 5 cm breit
Purina Yesterday' s news recycelte ZeitungseinstreuPurinan/aStandard Bedding
SpectrophotometerBiotekEpoch Microplate Reader

Referenzen

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