Methodenartikel

Ein neuronales Apoptosemodell, das durch Rückenmarkskompression bei Ratten induziert wird

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DOI:

10.3791/62604

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29. Juni 2021

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Research Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein Rückenmarkskompressionsmodell für Ratten zu erstellen, seinen Verhaltenswert zu bewerten und die komprimierte Rückenmarksregion zu beobachten. Die Verhaltensbewertungen zeigten eine verminderte motorische Behinderung des Monitors. Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen und Immunfärbungen zeigten eine beträchtliche neuronale Apoptose im komprimierten Bereich des Rückenmarks.

Zusammenfassung

Als schwere fortschreitende degenerative Erkrankung hat die zervikale spondylotische Myelopathie (CSM) eine schlechte Prognose und ist mit körperlichen Schmerzen, Steifheit, motorischer oder sensorischer Dysfunktion und einem hohen Risiko für Rückenmarksverletzungen und Akrolähmung verbunden. Daher sind therapeutische Strategien, die eine effiziente Regeneration des Rückenmarks bei dieser chronischen und fortschreitenden Erkrankung fördern, dringend erforderlich. Effektive und reproduzierbare Modelle zur Kompression des Rückenmarks bei Tieren sind erforderlich, um den komplexen biologischen Mechanismus zu verstehen, der der CSM zugrunde liegt. Die meisten Modelle für Rückenmarksverletzungen spiegeln akute und strukturell destruktive Zustände wider, während Tiermodelle der CSM eine chronische Kompression im Rückenmark darstellen. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Generierung eines Rückenmarkskompressionsmodells von Ratten vorgestellt, das durch die Bewertung des Verhaltensscores und die Beobachtung der komprimierten Rückenmarksregion weiter evaluiert wurde. Die Verhaltensbewertungen zeigten eine verminderte motorische Behinderung des Monitors, einschließlich Gelenkbewegungen, Schrittfähigkeit, Koordination, Rumpfstabilität und Muskelkraft der Gliedmaßen. Die Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Färbung und Immunfärbung zeigte eine beträchtliche neuronale Apoptose im komprimierten Bereich des Rückenmarks.

Einleitung

Als häufige progrediente degenerative Erkrankung macht CSM 5-10% aller zervikalen Spondyloseaus 1. Wenn Patienten, die an CSM leiden, ihre Symptome ignorieren und sie nicht rechtzeitig und wirksam behandeln, kann dies zu schweren Komplikationen wie Rückenmarksverletzungen und Gliedmaßenlähmungen führen, die sich mit zunehmendem Alter verschlimmern und eine erhebliche wirtschaftliche und psychische Belastung für die Patienten und ihre Angehörigen darstellenwürden 2,3. Die Pathogenese der CSM ist komplex und umfasst statische und dynamische Faktoren, die Hypoxie-Ischämie-Theorie, die Endothelzellverletzung, die Theorie der Zerstörung der Rückenmarksbarriere im Blut und die Entzündungs- und Apoptosetheorie 4,5,6,7.

Die statischen und dynamischen Mechanismen der Kompression auf das Rückenmark verursachen klinische Symptome. Vorstehende Bandscheiben, deformierte Wirbelkörper und verkalkte Bänder können zu einer verlängerten Rückenmarkskompression führen, die sich allmählich auf die Blut-Rückenmarks-Schranke und die lokalen Mikrovaskulatur im Rückenmark auswirkt 4,8. Ischämie, Entzündung und Apoptose wirken sich wiederum auf die Neuronen, Axone und Gliazellen aus 6,9.

Zu den experimentellen Tiermodellen für Rückenmarksverletzungen gehören Kontusionsverletzungen, Druckverletzungen, Traktionsverletzungen, photochemisch induzierte Verletzungen und Ischämie-Reperfusionsschäden. Die meisten dieser Modelle spiegeln auch einige akute und strukturell destruktive Zustände (Transsektion oder chemische Toxizität) wider. Diese Tiermodelle der CSM können jedoch keine progressive neuronale Apoptose im Rückenmark aufweisen.

In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll zur Generierung eines Rückenmarkskompressionsmodells von Ratten beschrieben, das durch die Bewertung des Verhaltensscores und die Beobachtung der komprimierten Region des Rückenmarks weiter evaluiert wurde. Dieses Modell der Rückenmarkskompression von Ratten ist ein zuverlässiges Tiermodell für die weitere Untersuchung der Mechanismen, die an der CSM beteiligt sind.

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Protokoll

Das folgende Verfahren wurde mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine durchgeführt. Alle Überlebensoperationen wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt, wie in den NIH-Richtlinien beschrieben. Schmerzen und Infektionsrisiko wurden mit geeigneten Analgetika und Antibiotika behandelt, um ein erfolgreiches Ergebnis zu gewährleisten. Dieses chirurgische Verfahren ist für männliche Ratten mit Sprague-Dawley (SD) im Alter von 12 Wochen und einem Gewicht von 400 g optimiert.

1. PVA-Polyacrylamid-Hydrogel-Zubereitung

HINWEIS: Wie in Abbildung 1G, 1H gezeigt, handelt es sich bei dem PVA-Polyacrylamid-Hydrogel um eine wasserabsorbierende Polymerplatte. Im natürlichen Zustand lässt sich das Gel nur sehr schwer in kleine Stücke schneiden. Die Zubereitung wird wie folgt beschrieben.

  1. Legen Sie ein PVA-Polyacrylamid-Hydrogel für 24 Stunden in Wasser, um das Schneiden nach der Flüssigkeitszufuhr zu erleichtern.
  2. Verwenden Sie ein selbstgebautes Schneidwerkzeug (Abbildung 1H), um das gesamte Hydrogel in Stücke mit den Maßen 2 mm x 2 mm x 2 mm zu teilen.
  3. Diese Hydrogelstücke werden für 12 Stunden bei 60 °C in einen Ofen überführt, um sie in kleine Stücke von 1 mm x 1 mm x 1 mm als Implantationsmaterial zu dehydrieren.

2. Anästhesie und Vorbereitung

HINWEIS: Achten Sie darauf, während des gesamten sterilen chirurgischen Prozesses eine OP-Kappe, medizinische Einwegmasken und sterile OP-Handschuhe zu tragen.

  1. Legen Sie die Ratte auf ein Heizkissen und stellen Sie sicher, dass die Rektaltemperatur während der Anästhesie bei 37±1 °C gehalten wird.
  2. Legen Sie die Ratte für 3 Minuten in die mit 3% Isofluran gefüllte Anästhesiekammer.
  3. Kneifen Sie die Gliedmaßen und Zehen der Ratte vorsichtig mit einer Pinzette, um zu testen, ob die Entzugsreaktion verloren geht, was auf eine erfolgreiche Anästhesie hinweist.
  4. Fixieren Sie die Ratte in Bauchlage auf dem Operationstisch und stellen Sie sicher, dass die Gliedmaßen und der Kopf der Ratte fest sitzen.
  5. Fixieren Sie die Anästhesiemaske auf dem Gesicht der Ratte. Verabreichen Sie 2% Isofluran in einem Sauerstoff-Luft-Gemisch über eine Standard-Rattennasenmaske, um die Ratte während der gesamten Wirbelsäulenkompressionsoperation zu betäuben.
  6. Platzieren Sie ein zylindrisches Mullkissen (Größe ca. 30 mm x 20 mm x 60 mm) zwischen der Ratte und dem Operationstisch (Abbildung 1A), um während der gesamten Operation einen freien Atemweg und eine vollständig freiliegende Operationsstelle zu gewährleisten.
  7. Rasieren Sie die Haare um den chirurgischen Bereich des Halses der Ratte mit einem Elektrorasierer.
  8. Tragen Sie Enthaarungscreme auf, um die restlichen Haare zu entfernen und die Haut freizulegen.
  9. Desinfizieren Sie das Operationsgebiet mit einem Jodophor.
  10. Decken Sie den desinfizierten Bereich mit einem sterilen Handtuch ab, dessen Loch nur den Operationsbereich auf der Rückenseite des Halses der Ratte freilegt.

3. Chirurgischer Ansatz

  1. Machen Sie mit einem Skalpell einen Längsschnitt in der dorsalen Mittellinie vom zweiten zervikalen Dornfortsatz zum zweiten thorakalen Dornfortsatz, nachdem Sie den zweiten zervikalen Dornfortsatz und den zweiten thorakalen Dornfortsatz perkutan positioniert haben.
  2. Trennen Sie die Muskeln beider Seiten mit einer hämostatischen Pinzette, um die C2-T2-Lamina freizulegen, nachdem Sie das Unterhautgewebe und die Faszien Schicht für Schicht durchtrennt haben.
  3. Bohren Sie ein Loch (1 mm x 1 mm) in die zervikale Lamelle (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Um übermäßige Verletzungen des Rückenmarks zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass der Hals der Ratte in einem dorsalen Bogenzustand gehalten wird, so dass genügend Platz zwischen den Halslaminen bleibt.
  4. Fassen Sie mit einer mikrochirurgischen Pinzette ein Stück PVA-Polyacrylamid-Hydrogel in der Größe von 1 mm x 1 mm x 1 mm und führen Sie es in das zuvor gebohrte Loch ein (Abbildung 1C, 1D).
    HINWEIS: Die vorübergehende Zuckungsleistung zeigt an, dass das Rückenmarkskompressionsmodell erfolgreich etabliert wurde.
  5. Vernähen Sie das Muskel-, Faszien-, Unterhaut- und Hautgewebe Schicht für Schicht mit dreieckigen Nadeln und 5-0-Naht.
  6. Nach der Desinfektion bringen Sie die Tiere zurück in den Käfig und halten Sie sie warm.
  7. Injizieren Sie die Buprenorphinhydrochlorid-Analgesie (0,03 mg/kg) subkutan alle 6 Stunden für 3 Tage nach der Operation und danach nach Bedarf.

4. Postoperatives Management

  1. Injizieren Sie den Ratten einmal täglich ein Äquivalent von 100.000 Einheiten Penicillin intraperitoneal, um postoperative Infektionen zu verhindern und Schmerzen zu lindern.
  2. Bringen Sie die Ratten in neue Käfige, die kontinuierlich mit einer Infrarotlampe beheizt wurden, um einen ausreichenden Wärmeerhalt nach der Operation zu gewährleisten.
    HINWEIS: Entfernen Sie die Heizlampe, nachdem das Bewusstsein der Ratte wiederhergestellt ist
  3. Sorgen Sie für Hygiene und Belüftung des Futterkäfigs der Ratte.
  4. Helfen Sie den Ratten, zweimal täglich zu essen und zu trinken. Verabreichen Sie bei Bedarf eine Blasenmassage, um das Wasserlassen zu unterstützen, bis die Harnfunktion wiederhergestellt ist.

5. Verhaltensbewertung

  1. Verwenden Sie die Bewertungsskala von Basso, Beattie und Bresnahan (BBB), um das postoperative Verhalten zu beurteilen.
    HINWEIS: Die BHS-Bewertungsskala ist ein Goldstandard (Tabelle 1), der zur Bewertung der Rückenmarksfunktion bei Ratten verwendet wird. Es bewertet die Bewegung der Ratten anhand von Werten von 0 (es wurde keine Bewegung der hinteren Gliedmaßen beobachtet) bis 21 (Gangkoordination, Konsistenz des Zehenraums, parallele Position der Hauptkralle in der gesamten Haltung, konsistente Rumpfstabilität und konsistente Schwanzhebung).

6. Prüfung der Griffkraft

  1. Verwenden Sie ein elektronisches Griffkraftmessgerät, um die Griffkraft zu messen.
  2. Greifen Sie die untere Hälfte der Ratte, um die Ratte aufzuhängen, und lassen Sie sie die Metallstange des vorderen Griffmessers greifen.
  3. Wenn die Ratte den Metallstab greift, ziehen Sie ihn weg und notieren Sie die Griffstärke.
  4. Messen Sie die Griffkraft dreimal für jede Ratte und notieren Sie die höchste Punktzahl.

7. Prüfung der geneigten Platte

  1. Lege die Ratte auf eine Gummiplatte mit verstellbarem Winkel.
  2. Den Winkel der geneigten Platte nach und nach jedes Mal um 5° anheben, bis die Ratte es schafft, das Gleichgewicht zu halten und 5 s lang fest zu stehen.
  3. Notieren Sie den maximalen Winkel, in dem sich die Ratte auf der geneigten Platte balancieren kann.
  4. Messen Sie den maximalen Winkel dreimal für jede Ratte und notieren Sie die höchste Punktzahl.

8. Euthanasie, Rückenmarkstrennung und eingefrorene Einbettung

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass eine geeignete Augenbrille und ein Gesichtsschutz/eine Gesichtsmaske getragen werden, um Augen, Gesicht und Atemwege vor Paraformaldehyd und Formaldehydgas zu schützen.

  1. Injizieren Sie ein Äquivalent von 10% Chloralhydrat intraperitoneal, um die Ratten zu betäuben, bevor Sie das Brustbein öffnen und das Herz freilegen.
  2. Führen Sie eine Perfusionsnadel in die Spitze des Herzens ein, fixieren Sie sie mit einer hämostatischen Pinzette und infundieren Sie sie langsam mit normaler Kochsalzlösung.
  3. Bohren Sie ein Loch in das rechte Vorhofohr, bis saubere normale Kochsalzlösung aus dem rechten Vorhof fließt, was auf eine erfolgreiche Infusion hinweist.
  4. Stoppen Sie die normale Kochsalzlösungsperfusion, nachdem die Leber weiß geworden ist.
  5. Mit einem Äquivalent von 10 % Paraformaldehyd aufgießen, bis der Körper der Ratte steif wird.
  6. Entfernen Sie nach der Paraformaldehyd-Perfusion die Haut, Muskeln und Weichteile um die Wirbelsäule. trennen Sie das C2-C7-Segment der Halswirbelsäule; und tauchen Sie es in 10% Paraformaldehyd zur Fixierung über Nacht.
  7. Trennen Sie das zervikale Rückenmark von der Wirbelsäule und legen Sie es in einen Konzentrationsgradienten von 10 %, 20 % und 30 % Saccharoselösungen, um eine allmähliche Dehydrierung zu erzielen.
  8. Das komprimierte Rückenmark mit einer Höhe von 2 mm wird zusammen mit einem OCT-Einbettungsmittel in einen -80 °C heißen Gefrierschrank gegeben.
  9. Nach dem Schneiden in 7 μm dicke Schichten und der Färbung (H&E-Färbung und dUTP-Nick-End-Markierung (TUNEL)/neuronale Kerne (NeuN), siehe Abschnitt 9) ist die Histopathologie des Rückenmarks bzw. der neuronalen Apoptose zu beobachten.

9. TUNEL/NeuN-Immunfärbung

  1. Tauchen Sie die Rückenmarksabschnitte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und blockieren Sie sie dann 1 h lang mit PBS-Lösung, die 0,3 % Triton X-100 und 5 % Rinderserumalbumin (BSA) enthält.
  2. Die Rückenmarksabschnitte werden über Nacht bei 4 °C mit einem polyklonalen Kaninchen-Anti-NeuN-Antikörper (verdünnt 1:200;) inkubiert.
  3. Spülen Sie die Rückenmarksabschnitte dreimal in PBS. Anschließend mit Alexa Fluor 594-konjugierten Sekundärantikörpern für 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Führen Sie das einstufige TUNEL-Apoptose-Assay-Kit (grüne Fluoreszenz) durch, um die apoptotischen Kerne der Rückenmarksabschnitte zu färben.

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Ergebnisse

Eine Kompressionsverletzung des Rückenmarks kann zu neuromuskulären Behinderungen in den Gliedmaßen führen
Da sich das Hydrogelstück allmählich ausdehnt, komprimiert es die Rückenmarksregion über einen längeren Zeitraum anhaltend, was die durch zervikale Rückenmarkserkrankungen induzierten Behinderungen der Vordergliedmaßen simuliert 8,10. Im aktuellen Modell wurde bei den meisten Ratten (9/10) der Modellgruppe eine signifikante ipsilaterale V...

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Diskussion

Ziel dieses chirurgischen Eingriffs war es, eine reproduzierbare, verlängerte, neuronale Apoptose im Rückenmark der Ratte zu erzeugen. Ein wesentlicher Vorteil dieses Modells besteht darin, dass die expandierbaren Hydrogel-Implantate eine verlängerte Kompression des Rückenmarks ermöglichen, was zu einer progressiven neuronalen apoptotischen Reaktion führt (Abbildung 2C), die mit dem pathologischen Prozess der CSM übereinstimmt. In der aktuellen Studie war di...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen und geben an, dass es keine Einschränkungen für den vollen Zugang zu allen in dieser Studie verwendeten Materialien gibt.

Danksagungen

Diese Studie wurde unterstützt vom National Key R&D Program of China (2018YFC1704300), der National Natural Science Foundation of China (81930116, 81804115, 81873317 und 81704096), dem Shanghai Sailing Program (18YF1423800) und der Natural Science Foundation of Shanghai (20ZR1473400). Dieses Projekt wurde auch von der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2019LK057) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Antibiotische SalbeVerhindern Sie Wundinfektionen
Buprenorphin-SRSchmerzlinderung
IsofluranVeteasyAnästhesie
InhalationsanästhesiegerätAnästhesie
Mikroophthalmische ZangeMingren medizinische GeräteLänge: 11 cm, Kopfdurchmesser: 0,3 mmSchneiden Sie den Muskel ab
Ophthalmische ZangeShanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Fabrik für chirurgische InstrumenteJD1050Schneiden Sie die Haut
ab Ophthalmische Schere (10 cm)Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Fabrik für chirurgische InstrumenteY00030Hautschnitt
SD männliche RattenShanghai SLAC Laboratory Animal Co., LtdSCXK2018-0004Tiermodell
Sterile chirurgische Klingen (22#)Verifizierter Lieferant - Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.35T0707Muskelschnitt
KleintiertrimmerHaarentfernung
Veet HaarentfernungscremeRECKITT BENCKISER (India) LtdHaarentfernung
Venus schertMingren medizinische GeräteLänge: 12,5 cmMuskelschnitt

Referenzen

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Rattenmodellzervikale spondylotische MyelopathieR ckenmarksverletzungVerhaltensbeurteilungH matoxylin Eosin F rbungImmunf rbungmotorische DysfunktionR ckenmarksregeneration
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