Visualisierung und Quantifizierung der TGFβ/BMP/SMAD-Signalisierung unter verschiedenen Fluidscherspannungsbedingungen mittels Proximity-Ligation-Assay

Summary

Hier etablieren wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Visualisierung und Analyse mehrerer SMAD-Komplexe mittels Proximity Ligation Assay (PLA) in Endothelzellen, die pathologischen und physiologischen Flüssigkeitsscherstressbedingungen ausgesetzt sind.

Abstract

Transforming Growth Factor β (TGFβ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) Signalisierung ist während der Entwicklung und Homöostase des Gefäßsystems streng reguliert und ausgeglichen Daher führt eine Deregulation in diesem Signalweg zu schweren vaskulären Pathologien wie pulmonaler Arterienhypertonie, hereditärer hämorrhagischer Teleangiektasie und Atherosklerose. Endothelzellen (ECs), als innerste Schicht der Blutgefäße, sind ständig Flüssigkeitsscherstress (SS) ausgesetzt. Es wurde gezeigt, dass abnormale Muster von Fluid-SS die TGFβ / BMP-Signalgebung verbessern, die zusammen mit anderen Reizen eine Atherogenese induzieren. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, dass atheroprones, niedriges laminares SS die TGFβ / BMP-Signalisierung verbessert, während atheroprotektives, hochlaminares SS diese Signalisierung verringert. Um die Aktivierung dieser Signalwege effizient zu analysieren, haben wir einen Workflow entwickelt, um die Bildung von Transkriptionsfaktorkomplexen unter niedrigen laminaren SS- und hohen laminaren SS-Bedingungen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen pneumatischen Pumpensystems und eines Proximity Ligation Assay (PLA) zu untersuchen.

Aktive TGFβ/BMP-Signalisierung erfordert die Bildung von trimeren SMAD-Komplexen, die aus zwei regulatorischen SMADs (R-SMAD) bestehen; SMAD2/3 bzw. SMAD1/5/8 für TGFβ bzw. BMP Signalisierung) mit einem gemeinsamen Mediator SMAD (Co-SMAD; SMAD4). Mit Hilfe von PLA, das auf verschiedene Untereinheiten des trimeren SMAD-Komplexes abzielt, d.h. entweder R-SMAD/co-SMAD oder R-SMAD/R-SMAD, kann die Bildung aktiver SMAD-Transkriptionsfaktorkomplexe quantitativ und räumlich mittels Fluoreszenzmikroskopie gemessen werden.

Die Verwendung von Strömungsschienen mit 6 kleinen parallelen Kanälen, die in Reihe geschaltet werden können, ermöglicht die Untersuchung der Komplexbildung des Transkriptionsfaktors und die Einbeziehung notwendiger Kontrollen.

Der hier erläuterte Workflow kann leicht für Studien angepasst werden, die auf die Nähe von SMADs zu anderen Transkriptionsfaktoren oder zu Transkriptionsfaktorkomplexen außer SMADs unter verschiedenen flüssigen SS-Bedingungen abzielen. Der hier vorgestellte Workflow zeigt eine schnelle und effektive Möglichkeit, die fluid-SS-induzierte TGFβ/BMP-Signalisierung in ECs sowohl quantitativ als auch räumlich zu untersuchen.

Introduction

Proteine der Superfamilie der transformierenden Wachstumsfaktoren beta (TGFβ) sind pleiotrope Zytokine mit einer Vielzahl von Mitgliedern, darunter TGFβs, knochenmorphogenetische Proteine (BMPs) und ^Activine1,2. Die Ligandenbindung induziert die Bildung von Rezeptoroligomeren, die zur Phosphorylierung und damit zur Aktivierung der zytosolischen regulatorischen SMAD (R-SMAD) führen. Je nach Unterfamilie der Liganden werden unterschiedliche R-SMADs ^aktiviert1,2. Während TGFβs und Activine hauptsächlich die Phosphorylierung von SMAD2/3 induzieren, induzie....

Protocol

1. Exposition gegenüber Zellkultur- und Flüssigkeitsscherstress

HINWEIS: Menschliche Nabelschnurvenen-ECs (HUVECs) wurden als Beispiel verwendet, um die SS-induzierte Interaktion von SMADs zu untersuchen. Das unten beschriebene Protokoll kann auf jeden SS-responsiven Zelltyp angewendet werden.

1. 6-Kanal-Objektträger mit 0,1% Schweinehautgelatine in PBS für 30 min bei 37 °C bestreichen.
2. Seed HUVECs in vorbeschichteten 6-Kanal-Objektträgern mit einer Dichte von 2,5 x ¹⁰⁶ Zellen pro ml in 30 μL M199 Vollmedium.
   HINWEIS: Weitere Informationen zum Seeding von Zellen im Flow Slide finden Sie unter

Results

Wir haben pla zuvor verwendet, um Wechselwirkungen verschiedener SMAD-Proteine3 zu detektieren und scherspannungsinduzierte Veränderungen in der SMAD-Phosphorylierung ^{zu analysieren28}.

Hier wurden beide Methoden mit dem oben beschriebenen Protokoll kombiniert. HUVECs wurden einer Scherspannung von 1 Dyn/^cm2 und 30 Dyn/^cm2 ausgesetzt und auf Wechselwirkungen von SMAD-Transkriptionsfaktoren analysiert. Wir zeigen, dass im Verg.......

Discussion

Das hier beschriebene PLA-basierte Protokoll bietet eine effiziente Möglichkeit, die Nähe von zwei Proteinen (z. B. deren direkte Interaktion) in ECs, die Scherspannung ausgesetzt sind, mit quantitativer und räumlicher Auflösung zu bestimmen. Durch den Einsatz von Strömungsobjektträgern mit mehreren parallelen Kanälen können mehrere verschiedene Proteininteraktionen gleichzeitig in Zellen unter identischen mechanischen Bedingungen untersucht werden. Im Gegensatz dazu verwenden speziell angefertigte Durchflusskammersystem.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide VI 0.4	ebd.	80606	6-Kanal-Slide
Ammoniumchlorid	Carl Roth	K298.1	Quenching
Rinderserumalbumin	Carl Roth	8076.4	Blocking
DAPI	Sigma Aldrich/ Merck	D9542	Färben DNA/Zellkerne
DPBS	PAN Biotech	P04-53500	PBS
Duolink In Situ Detektionsreagenzien Grünes	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92014	PLA-Kit mit Ligase, Ligationspuffer, Polymerase und Amplifikationspuffer (mit grün markierten Oligonukleotiden)
Duolink In Situ PLA Sonde Anti-Maus MINUS	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92004	MINUS Sonde
Duolink In Situ PLA Sonde Anti-Kaninchen PLUS	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92002	PLUS Sonde
Duolink In Situ Waschpuffer, Fluoreszenz	Sigma Aldrich/ Merck	DUO82049	PLA Waschpuffer A und B
Endothelial Cell Growth Supplement	Corning		Supplement für Medium (ECGS)
Fötales Kalb Serumsupplement			für Medium
Fidschi			Bildanalysesoftware
Formaldehydlösung 4% gepuffert	KLINIPATH/VWR	VWRK4186. BO1	PFA
Vollmedium			M199 Basalmedium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +  25 & Mikro; g/mL Hep +    50 & Mikro; g/mL EKGS
Gelatine aus Schweinehaut, Typ A	Sigma Aldrich	G2500	Verwendung von 0,1% in PBS für die Beschichtung von Strömungskanälen
GraphPad Prism v.7	GarphPad		Statistical Program für die Diagramme und statistischen Berechnungen
Heparin-Natriumsalz aus der Darmschleimhaut von Schweinen	Sigma Aldrich	H4784-250MG	Ergänzung für mittlere (Hep)
HUVECs
ibidi Eindeckmedium	ibidi	50001	Eindeckmedium
flüssig ibidi Pump System	ibidi	10902	pneumatische Pumpe
Leica TCS SP8	Leica		konfokales Mikroskop
L-Glutamin 200mM	PAN Biotech	P04-80100	Ergänzung für Medium (L-Glu)
Medium 199	Sigma Aldrich	M2154	Basismedium
Maus Anti-SMAD1 Antikörper	Abcam	ab53745	Geeignet für PLA
Maus Anti-SMAD2/3 Antikörper	BD Bioscience	610843	Nicht geeignet für PLA in Kombination mit CST 9515
Maus Anti-SMAD4 Antikörper	Sanata Cruz Biotechnology	sc-7966	Geeignet für PLA
Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml	PAN Biotech	P06-07100	Ergänzung für Medium (P/ S)
Perfusionsset WEISS	ibidi	10963	Schläuche für 1 dyn/cm2
Perfusionsset GELB und GRÜN	ibidi	10964	Schläuche für 30 dyn/cm2Kaninchen
Anti-Phospho SMAD1/5 Antikörper	Cell Signaling Technologies	9516	Geeignet für PLA
Kaninchen Anti-SMAD2/3 XP Antikörper	Cell Signaling Technologies	8685	für PLA
Kaninchen Anti-SMAD4 Antikörper	Cell Signaling Technologies	9515	Nicht geeignet für PLA in Kombination mit BD 610843
Serieller Steckverbinder für µ-Slides	ibidi	10830	serielle Verbindungsschläuche
Triton X-100	Carl Roth	6683.1	Permeabilisierung