Verwendung von Baseplating und einem Miniskop, das mit einer Objektivlinse vorverankert ist, für die Calcium-Transienten-Forschung bei Mäusen

Summary

Durch das Schrumpfen von Zahnzement während der Aushärtung wird die Grundplatte verdrängt. Dieses Protokoll minimiert das Problem, indem es ein erstes Fundament des Zahnzements schafft, das Platz für die Zementierung der Grundplatte lässt. Wochen später kann die Bodenplatte mit wenig neuem Zement auf diesem Gerüst zementiert werden, wodurch die Schwindung reduziert wird.

Abstract

Neurowissenschaftler verwenden Miniaturmikroskope (Miniskope), um die neuronale Aktivität in frei agierenden Tieren zu beobachten. Das Miniscope-Team der University of California, Los Angeles (UCLA) stellt Forschern offene Ressourcen zur Verfügung, mit denen sie Miniskope selbst bauen können. Das V3 UCLA Miniscope ist eines der beliebtesten Open-Source-Miniskope, die derzeit im Einsatz sind. Es ermöglicht die Bildgebung der Fluoreszenztransienten, die von genetisch veränderten Neuronen emittiert werden, durch eine Objektivlinse, die in den oberflächlichen Kortex implantiert wird (ein Ein-Linsen-System), oder in tiefen Hirnbereichen durch eine Kombination aus einer Relaislinse, die in das tiefe Gehirn implantiert wird, und einer Objektivlinse, die im Miniskop vorverankert ist, um das weitergeleitete Bild zu beobachten (ein Zwei-Linsen-System). Selbst unter optimalen Bedingungen (wenn Neuronen Fluoreszenzindikatoren exprimieren und die Relaislinse ordnungsgemäß implantiert wurde) kann eine Volumenänderung des Zahnzements zwischen der Grundplatte und ihrer Befestigung am Schädel bei der Zementhärtung zu einer Fehlausrichtung mit einem veränderten Abstand zwischen Objektiv und Relaislinse führen, was zu einer schlechten Bildqualität führt. Eine Grundplatte ist eine Platte, die hilft, das Miniskop auf dem Schädel zu befestigen und den Arbeitsabstand zwischen dem Objektiv und dem Relaisobjektiv zu fixieren. So verändern Änderungen des Volumens des Zahnzements um die Grundplatte herum den Abstand zwischen den Linsen. Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, das Problem der Fehlausrichtung, das durch Volumenänderungen im Zahnzement verursacht wird, zu minimieren. Das Protokoll reduziert die Fehlausrichtung, indem es während der Implantation der Relaislinse ein erstes Fundament aus Zahnzement bildet. Die Rekonvaleszenzzeit nach der Implantation reicht aus, damit das Fundament aus Zahnzement die Grundplatte vollständig aushärten kann, so dass die Grundplatte mit möglichst wenig neuem Zement auf diesem Gerüst zementiert werden kann. Im vorliegenden Artikel beschreiben wir Strategien für die Baseplattierung bei Mäusen, um die Abbildung der neuronalen Aktivität mit einer im Miniskop verankerten Objektivlinse zu ermöglichen.

Introduction

Fluoreszierende Aktivitätsreporter sind ideal für die Bildgebung der neuronalen Aktivität, da sie empfindlich sind und große Dynamikbereiche ^1,2,3 haben. Daher wird in immer mehr Experimenten die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die neuronale Aktivität^direkt zu beobachten 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ....

Protocol

Alle in dieser Studie durchgeführten Verfahren wurden vom National Taiwan University Animal Care and Use Committee genehmigt (Zulassungsnummer: NTU-109-EL-00029 und NTU-108-EL-00158).

1. Beurteilung der Volumenveränderung von Zahnzement

HINWEIS: Änderungen des Volumens von Zahnzement treten während des Aushärtungsprozesses auf. Testen Sie die Volumenänderungen von Zahnzement vor der Implantation und Baseplattierung. Forscher können jede Marke von Dentzement testen und die Marke mit der geringsten Volumenänderung verwenden, um die Grundplatte zu zementieren. Ein Beispiel ist in ....

Results

Beurteilung der Volumenveränderung des Dentzement
Da sich das Volumen des Zahnzement während des Aushärtungsprozesses ändert, kann dies die Abbildungsqualität erheblich beeinträchtigen, da der Arbeitsabstand einer GRIN-Linse etwa 50 bis 350 μm ^4,8 beträgt. Daher wurden in diesem Fall zwei kommerziell erhältliche Zahnzemente, Tempron und Tokuso, vor der Implantation und Baseplattierung getestet (Abbildung 5). Zunäc.......

Discussion

Der vorliegende Bericht beschreibt ein detailliertes Versuchsprotokoll für Forscher, die das zweilinsige UCLA Miniscope-System verwenden. Die in unserem Protokoll entwickelten Werkzeuge sind relativ erschwinglich für jedes Labor, das die In-vivo-Calcium-Bildgebung ausprobieren möchte. Einige Protokolle, wie z. B. Virusinjektion, Linsenimplantation, Dummy-Baseplating und Baseplating, könnten auch für andere Versionen des Miniscope-Systems verwendet werden, um die Erfolgsrate der Kalzium-Bildgebung zu verbessern. .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,7-mm-Bohrer	#19008-07	Fine Science Tools; USA	für Chirurgie
0,1– 10 μ l Pipettenspitzen	104-Q; QSP	Fisher Wissenschaftlich; Singapur	für die Prüfung von Zahnzement
20 G IV Cathater	#SR-OX2032CA	Terumo Corporation; Tokio, Japan	für chirurgische
Eingriffe 27 G Nadel	AGANI, AN*2713R	Terumo Corporation; Tokio, Japan	für die Operation
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE	#104487-AAV9; 1,5*10^13	Addgene Virusvorbereitung; MA, USA	für die Virusinjektion
Atropinsulfat		Astart; Hsinchu, Taiwan	für Chirurgie/Dummy-Basisbeschichtung/Basisbeschichtung
Basisplatte	V3	http://miniscope.org	für Dummy-Basisbeschichtung/Basisbeschichtung
BLU TACK	#30840350	Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA Wiederverwendbare	Klebemasse; für Chirurgie/Dummy-Basisbeschichtung/Basisbeschichtung
Knochen Rongeur Friedman	13 cm	Diener; Tuttlingen, Deutschland	für die Grundierung von
Buprenorphin		INDIVIOR; Großbritannien	für die Chirurgie
Carprofen	Rimadyl	Zoetis; Exton, PA	Analgesie
Ceftazidim		Taiwan Biotech; Taiwan	verhindert Infektionen
Datenerfassung PCB für UCLA Miniscope	gekauft am https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq		für die Grundierung
Zahnzement-Set	Tempron	GC Corp; Tokio, Japan	zum Testen von Zahnzement Zahnzement-Set
	Tokuso Curefast	Tokuyama Dental Corp.; Tokio, Japan	zum Testen von Zahnzement/Chirurgie/Dummy-Grundierung/Grundbeschichtung
Dual Lab Standard mit Maus- und Rattenadaptern	# 51673	Stoelting Co; Illinois, USA	für Chirurgie/Dummy-Basisbeschichtung/Grundierung
Duratear Salbe		Alcon; Genf, Schweiz	für Chirurgie/Dummy-Baseplatting/Baseplating
Ibuprofen		YungShin; Taiwan	Analgesie
Isofluran		Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan	für Chirurgie/Dummy-Basisbeschichtung/Grundbeschichtung
Inscopix	nVista System	Inscopix; Palo Alto, CA	zum Vergleich mit V3 UCLA Miniscope
Ketamin		Pfizer; NY, NY	für die Euthanasie
Normale Kochsalzlösung			für die Chirurgie
Mikro-Bulldoggenklemmen	#12.102.04	Dimedo; Tuttlingen, Deutschland	für die Linsenimplantation
Mikroliter Mikrospritzen, 2.0 & micro; L, Spur 25	#88400	Hamilton; Bonaduz, Schweiz	für den Virusspritzguss
Silikonkautschuk	ZA22 Thixo	Zhermack; Badia Polesine, Italien	für Dummy-Basisbeschichtung
mit Gradientenindex (GRIN) Linse	#64519	Edmund Optics; NJ, USA	für Dummy-Basisbeschichtung/Grundbeschichtung
Parafilm	#PM996	Bemis; Neenah, USA	für Dummy-Grundierung
Tragbare Absaugung	#DF-750	Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan	für die
Chirurgie Relais GRIN Linse	#1050-002177	Inscopix; Palo Alto, CA, USA	für Dummy-Basisplattierung/Grundierung
Ankerschrauben aus Edelstahl	mit einem Durchmesser von 1,00 mm, einer Gesamtlänge von 3,00 mm		für die Chirurgie
Stereomikroskop	#SL720	Sage Vison; New Taipei City, Taiwan	für Chirurgie/Dummy-Baseplatting/Baseplating
Stereotaktische Apparatur	#51673	Stoelting; IL, USA	für Chirurgie/Dummy-Basisbeschichtung/Basisbeschichtung
UV-Härtungsklebstoff	#3321	Loctite; Dü Düsseldorf, Deutschland	für die Prüfung von Zahnzement
V3 UCLA Miniskop	gekauft am https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components		für Chirurgie/Dummy-Basisbeschichtung/Grundierung
Xylazin	X1126	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	für Euthanasie
Xylocain Pumpspray 10%		AstraZeneca; Sö dertä lje, Schweden	für chirurgische Eingriffe