Methodenartikel

Chromosomen-Screening von humanen Präimplantationsembryonen unter Verwendung von verbrauchtem Kulturmedium: Probenentnahme und Chromosomenploidie-Analyse

DOI:

10.3791/62619

⸱

7. September 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 2National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology(Peking University Third Hospital), 3Ministry of Education, Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), 4Beijing Key Laboratory of Reproductive Endocrinology and Assisted Reproductive Technology, 5Department of Clinical Research, Yikon Genomics Co. Ltd.

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

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Zusammenfassung

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Die vorliegende Studie berichtet über ein Protokoll für das Chromosomen-Screening menschlicher Embryonen, das verbrauchtes Kulturmedium verwendet, das eine Embryonenbiopsie vermeidet und die Identifizierung der Chromosomenploidie mittels NGS ermöglicht. Der vorliegende Artikel stellt das detaillierte Verfahren vor, einschließlich der Herstellung des Nährmediums, der Amplifikation des gesamten Genoms (WGA), der Vorbereitung der Next-Generation-Sequencing-Bibliothek (NGS) und der Datenanalyse.

Zusammenfassung

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Bei der klinischen In-vitro-Fertilisation (IVF) erfordert die vorherrschende Methode für PGT-A die Biopsie einiger Zellen aus dem Trophektoderm (TE). Dies ist die Abstammungslinie, die die Plazenta bildet. Diese Methode erfordert jedoch spezielle Fähigkeiten, ist invasiv und leidet unter falsch-positiven und negativen Ergebnissen, da die Chromosomenzahlen im TE und die innere Zellmasse (ICM), die sich zum Fötus entwickelt, nicht immer gleich sind. NICS, eine Technologie, die die Sequenzierung von DNA erfordert, die sowohl von TE als auch von ICM in das Nährmedium freigesetzt wird, könnte einen Ausweg aus diesen Problemen bieten, hat sich aber bisher als begrenzt wirksam erwiesen. Die vorliegende Studie berichtet über das vollständige NICS-Protokoll, das Methoden zur Probenahme von Nährmedien, zur Amplifikation des gesamten Genoms (WGA) und zur Bibliotheksvorbereitung sowie zur NGS-Datenanalyse durch Analysesoftware umfasst. In Anbetracht der unterschiedlichen Kryokonservierungszeiten in verschiedenen Embryonenlabors stehen den Embryologen zwei Methoden zur Entnahme des Embryokulturmediums zur Verfügung, die je nach den tatsächlichen Bedingungen des IVF-Labors ausgewählt werden können.

Einleitung

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Assistierte Reproduktionstechnologien (ARTs) werden zunehmend zur Behandlung von Unfruchtbarkeit eingesetzt. Die Erfolgsrate von ART, wie z. B. IVF, ist jedoch begrenzt, und die Rate der Fehlgeburten ist deutlich höher als die der Normalbevölkerung1. Die Hauptursache für diese Probleme sind Chromosomenanomalien, die häufig bei menschlichen Präimplantationsembryonen auftreten2. PGT-A ist eine wirksame Methode zum Screening von Embryonen auf Chromosomengleichgewicht vor der Implantation 3,4. Einige Studien haben bewiesen, dass PGT-A die Abtreibungsrate senken und die Schwangerschaftsrate verbessern kann 5,6,7,8. PGT-A erfordert jedoch komplexes technisches Fachwissen, das eine spezifische Ausbildung und Erfahrung erfordert. Die invasive Embryonenbiopsie kann auch zu einer Schädigung der Embryonen führen9. Studien haben gezeigt, dass die Blastomerbiopsie die spätere Entwicklung behindern kann und die Anzahl der biopsierten TEs die Implantationsraten beeinflussen kann10. Obwohl das Problem der langfristigen biologischen Sicherheit der Embryonenbiopsie beim Menschen noch nicht gründlich untersucht wurde, haben Tierstudien gezeigt, dass sie negative Auswirkungen auf die Embryonalentwicklung hat11,12,13.

Frühere Berichte deuteten darauf hin, dass während der Embryonalentwicklung Spuren von DNA-Material in das Kulturmedium abgesondert wurden, und es wurden Anstrengungen unternommen, ein umfassendes Chromosomen-Screening (CCS) mit verbrauchtem Embryokulturmedium durchzuführen 14,15,16,17,18. Die Nachweisraten und die Genauigkeit der Tests haben jedoch nicht die Anforderungen für einen umfassenden klinischen Einsatz erfüllt. Die vorliegende Studie berichtete über eine Verbesserung des NICS-Assays zur Erhöhung der Detektionsraten sowie der Genauigkeit des NICS-Tests19. In den letzten Jahren wurde Blastocoele-Flüssigkeit (BF) als analytische Probe der minimalinvasiven PGT-A untersucht. Der Anteil der erfolgreichen genomweiten Amplifikation und der nachweisbaren DNA in Blastozystenflüssigkeitsproben liegt jedoch zwischen 34,8 % und 82 %20,21,22. Das in verschiedenen Studien berichtete BF-Volumen reicht von 0,3 nL bis 1 μL. Angesichts der geringen Menge an DNA in BF ist es möglich, die Menge an zellfreier DNA durch Mischen von Blastozystenflüssigkeit und Kulturmedium zu erhöhen, um die Erfolgsrate und Konsistenz des Nachweises zu verbessern. Kuznyetsov et al.23 und Li et al.24 behandelten die Zona pellucida mit einem Laser und setzten Blastozystenflüssigkeit in das Kulturmedium frei, um die Gesamtmenge der embryonalen DNA zu verbessern, und die Amplifikationsrate der kombinierten Medium/BF-Proben nach WGA betrug 100 % bzw. 97,5 %. Jiao et al.25 erhielten mit der gleichen Methode ebenfalls eine 100%ige Amplifikationserfolgsrate.

Die vorliegende Studie berichtet über ein detailliertes Protokoll, das die Probenvorbereitung für verbrauchte Medien, die NGS-Vorbereitung und die Datenanalyse umfasst. Durch die sorgfältige Entfernung von Kumuluszellen aus den Eizellen wurden in der vorliegenden Studie intrazytoplasmatische Einzelspermieninjektionen (ICSI) und Blastozystenkulturen durchgeführt. Das verbrauchte Medium an Tag 4 Tag 5/Tag 6 wurde für die Vorbereitung der WGA- und NGS-Bibliothek gesammelt. Durch den Einsatz der NICS-Technologie konnte die vorliegende Studie die Vorbereitungsschritte der WGA- und NGS-Bibliothek in ca. 3 h rationalisieren und die nicht-invasiven CCS-Ergebnisse in ca. 9 h erhalten.

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Protokoll

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Die ethische Erlaubnis wurde von der Ethikkommission des Dritten Krankenhauses der Universität Peking eingeholt.

1. Vorbereitung

HINWEIS: Die erforderlichen Materialien und Ausrüstungen sind in der Materialtabelle aufgeführt.

  1. Reagenzien
    1. 20-30 μl Gametenmedium/Befruchtungsmedium und Spalt-/Blastozystenstadium Kulturmedium (mit Mineralöl bedeckt) und Hyaluronidase (in einem dicht verschlossenen Röhrchen) bei 37 °C, 5 % CO2 und 5 %O2 in einem Trigas-Inkubator über Nacht vor der Verwendung vorwärmen und ausbalancieren (balanciert).
    2. Hyaluronidase auf 37 °C auf einer Arbeitsfläche in einem Abzug vorwärmen.
    3. Vitrifikationspuffer und Reagenzien für die Probenentnahme gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereiten.
  2. Werkzeuge
    1. Bereiten Sie Probenentnahme- und Transferpipetten (Innendurchmesser von ~200 bis 250 μm), Denudations-/Stripperpipetten (Innendurchmesser von ≥150 μm, ~130-140 μm und ~120 μm) und Pipetten zum Waschen (Innendurchmesser von ~150 μm) vor, indem Sie Pasteurpipetten aus Glas ziehen, um feuerpolierte, offene feine Spitzen zu erzeugen.
      HINWEIS: Die Pipetten, die für die Probenentnahme/-übertragung, Denudation und das Waschen verwendet werden, können direkt erworben werden. Die Haltenadeln und Injektionsnadeln können auch direkt erworben werden.

2. Protokoll 1: Probenentnahme

  1. Vorbehandlung des Oozyten-Corona-Cumulus-Komplexes (OCCCs) vor der Verdauung mit Hyaluronidase
    1. Erreichen Sie eine Stimulation der Eierstöcke sowohl mit follikelstimulierendem Hormon (FSH) als auch mit humanen menopausalen Gonadotropinpräparaten (hMG). Wenn der Leitfollikel >18 mm groß ist, verwenden Sie 10.000 IE Choriongonadotropin (hCG) für die endgültige Eizellreifung.
    2. Führen Sie die Eizellentnahme 36 Stunden nach dem Triggerschuss durch. Die Eizellen werden mit 2,5 ml vorgewärmtem m-HTF, die mit Mineralöl bedeckt sind, entnommen und in Gewebekulturschalen übertragen.
    3. Die OCCCs werden mit einer Transferpipette schnell in die zentrale Vertiefung einer Organkulturschale mit 1 ml Befruchtungsmedium überführt und dann mit den Eizellen bei 37 °C in einem 5%igen CO2- und 5%O2-Inkubator für 2-4 h inkubiert.
  2. OCCCs mit Hyaluronidase werden verdaut, indem 1 ml 37 °C vorgewärmte Hyaluronidase (80 I.E./ml) in die zentrale Vertiefung einer Organkulturschale mit OCCCs gegeben wird (Schritt 2.1.3). Halten Sie die Endkonzentration der Hyaluronidase bei 40 IE/ml und mischen Sie sie gründlich.
    1. Inkubieren Sie die OCCCs 2 Minuten lang auf einer 37 °C heißen thermischen Plattform. Beobachten Sie die Veränderungen unter dem Mikroskop alle 30 s, bis nur noch 1-2 Schichten Granulosazellen übrig sind.
  3. Denudation von Granulosazellen
    1. Überführen Sie die verdauten OCCCs schnell in die Kulturschale für die Handhabung der Eizellen und bedecken Sie sie in jeder Vertiefung mit Mineralöl.
    2. Betrachten Sie die abgetrennten Granulosazellen unter dem Mikroskop. Saugen Sie die Eizellen vorsichtig ab und lassen Sie sie 5 Mal frei, um die restlichen Granulosazellen um die Eizellen herum zu entfernen.
    3. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt in den verbleibenden 3 Vertiefungen, um die Granulosazellen vollständig zu entfernen.
      HINWEIS: Die oben genannten Schritte (2.1-2.3) können entsprechend dem Routinebetrieb jedes Labors durchgeführt werden.
  4. Auswertung der Eizelle
    1. Beurteilen Sie die Vollständigkeit der Entfernung von Granulosazellen mit einem Mikroskop. Wenn die Zellen nicht vollständig entfernt werden konnten, ist die Retention von 5 oder weniger Granulosazellen zu diesem Zeitpunkt akzeptabel.
      HINWEIS: Wenn noch Cumuluszellen an die Eizelle gebunden sind, kann der Rest später am Tag 3 entfernt werden, bevor der Embryo vom Kulturmedium im Spaltstadium in das Kulturmedium im Blastozystenstadium überführt wird.
  5. Nach der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI)26 werden die Eizellen mit Hilfe von Transferpipetten in Mikrotröpfchen mit einem Spaltmedium für Embryonenkulturen (eine Eizelle entspricht einem Mikrotröpfchen) in 20-30 μl Embryonenkulturmedium überführt und in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 und 5 %O2 inkubiert.
    1. Notieren Sie den Tag der ICSI als Tag 0. Kontrollieren Sie die Embryonen und bewerten Sie sie gemäß dem Istanbuler Konsens-Workshop zur Beurteilung der Embryonen von Tag 1 für die Befruchtung (ca. 18 Stunden), Tag 2 (ca. 45 Stunden) und Tag 3 (ca. 68 Stunden) für die Embryonenspaltung27.
  6. Waschung von Embryonen
    1. Bereiten Sie 20-30 μl Mikrotröpfchen des Blastozystenkulturmediums für jeden mit Mineralöl bedeckten Embryo in Gewebekulturschalen an Tag 2 in einem Inkubator mit 5 % CO2 und 5 %O2 vor.
    2. Bereiten Sie weitere drei mit Mineralöl bedeckte Mikrotröpfchen vor und beschriften Sie das neue Gewebekulturgeschirr zum Spülen Nr. 1-3.
    3. Übertragen Sie die Embryonen von Tag 3 in die Waschmikrotröpfchen. Die Embryonen werden vorsichtig abgesaugt und 3 Mal in jedem Tröpfchen mit Denudationspipetten freigesetzt.
      HINWEIS: Dieses Verfahren kann auch dazu beitragen, die verbleibenden körnigen Zellen zu entfernen, die am Embryo haften.
    4. Beobachten und beurteilen Sie die Embryonen unter dem Mikroskop am Tag 3, bevor das Medium für die morphologische Bewertung von einem Kulturmedium im Spaltstadium in ein Blastozystenkulturmedium gewechselt wurde. Wenn noch Cumuluszellen am Embryo haften, pipettieren Sie das mit Mineralöl bedeckte Tröpfchen in einem anderen vorgewärmten und äquilibrierten Blastozystenkulturmedium mit einer Stripperpipette auf und ab, bis die Cumuluszellen vollständig entfernt sind.
      HINWEIS: Alle anhaftenden Cumuluszellen mussten am Tag 3 vollständig entfernt werden, bevor der Embryo von der Kulturmediumplatte im Spaltstadium auf die Kulturmediumplatte im Blastozystenstadium übertragen wurde. Alle verbleibenden Kumuluszellen stören die endgültige Analyse und liefern falsch negative Ergebnisse.
  7. Zwei Optionen für die Sammlung von Nährmedien
    HINWEIS: Das IVF-Zentrum kann je nach den Ressourcen, Anforderungen und Präferenzen des Zentrums eine von zwei Methoden für die Entnahme von Nährmedien wählen.
    1. Option 1: Embryonenwäsche und -kultur
      HINWEIS: Diese Option gilt für IVF-Labore, die die Vitrifikation am Morgen des 5. Tages durchführen.
      1. Der Embryo wird in vorgewärmte (37 °C) Mikrotröpfchen des Kulturmediums überführt und jeder Embryo am Nachmittag des 4. Tages nacheinander vorsichtig in 3 Mikrotröpfchen durch Pipettieren gewaschen.
      2. Jeder Embryo wird zur Probenentnahme in ein einzigartiges, vorgewärmtes (37 °C) einzelnes Mikrotröpfchen Kulturmedium übertragen. Das Volumen eines einzelnen Tropfens Nährmedium darf 25 μl nicht überschreiten.
      3. Die Blastozystenembryonenkultur wird an Tag 5/Tag 6 bei 37 °C, 5 % CO2 und 5 %O2 durchgeführt.
    2. Option 2: Embryonenwäsche und -kultur
      HINWEIS: Diese Option ist für IVF-Labore gedacht, die die Vitrifikation am 5. Tag nachmittags oder am 6. Tag durchführen.
      1. Übertragen Sie den Embryo in vorgewärmte (37 °C) Mikrotröpfchen von 10-15 μl Kulturmedium und waschen Sie jeden Embryo am 5. Tag sanft in 3 Mikrotröpfchen durch Pipettieren.
      2. Jeder Embryo wird zur Probenentnahme in ein einzigartiges, vorgewärmtes (37 °C) einzelnes Mikrotröpfchen Kulturmedium übertragen. Das Volumen eines einzelnen Tropfens Nährmedium darf 15 μl nicht überschreiten.
      3. Blastozystenembryonenkultur am Tag 5/Tag 6 bei 37 °C und 5 % CO2 durchführen.
  8. Musterkollektion
    1. Stellen Sie das ICM vorsichtig in einem beträchtlichen Abstand vom Zielpunkt des Laserstrahls ein, der sich auf die Zellverbindung des Trophektoderms konzentriert, um ein kleines Loch im Trophektoderm zu erzeugen, um die Flüssigkeit aus der Blastocoelhöhle freizusetzen. Dann werden die Embryonen zur Kryokonservierung nach dem herkömmlichen Verfahren in eine Gefrierlösung gebracht.
    2. Transfer des Kulturmediums von jedem kultivierten Embryo in ein RNase/DNase-freies PCR-Röhrchen, das 5 μl Zelllysepuffer enthält.
    3. Sammeln Sie die gleiche Menge an Nährmedium, ohne für die Embryonenkultur als Negativkontrolle verwendet zu werden. Alle gesammelten Proben werden sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und nach der Entnahme bei −80 °C gelagert, bis sie dem NICS-Assay unterzogen werden.
  9. Führen Sie die Vitrifikation wie im Protokoll beschrieben durch.

3. Protokoll 2: Bibliotheksaufbau

  1. Lyse des Nährmediums
    1. Verdünnen Sie 1 μl der Positivkontrolle (10 ng humane gDNA) mit 199 μl frischem Kulturmedium. Gründlich mischen und das Röhrchen kurz zentrifugieren (200 x g für 5 s).
    2. 10 μl Blastozystenkulturmedium von Tag 5 bis Tag 6, verdünnte Positivkontrolle und frisches Nährmedium in neue 0,2-ml-PCR-Röhrchen überführen.
    3. Geben Sie 1 μl MT Enzymmischung in jedes PCR-Röhrchen und mischen Sie es gründlich durch Pipettieren und zentrifugieren Sie sofort 2-3 s lang bei 200 x g.
    4. Das/die PCR-Röhrchen(s) aus Schritt 3.1.3 in eine vorgeheizte NICS-Probenvorbereitungsstation geben und das Lyseprogramm wie folgt ausführen: 10 min bei 75 °C; 4 min bei 95 °C; bei 22 °C halten.
      HINWEIS: Die Probenvorbereitungsstation ist vergleichbar mit einem Standard-PCR-Gerät.
      1. Klicken Sie auf das Lysis-Symbol , um den Setup-Bildschirm aufzurufen.
      2. Wählen Sie Tube für den Steuerungsmodus; Eingang 10 μl für Probenvolumen; Wählen Sie Ein für Hotlid-Steuerung und geben Sie 105 °C als Temperatur ein. Wählen Sie Nein für Pause beim ersten Seg. Klicken Sie auf OK , um fortzufahren.
      3. Warten Sie, bis unter Verbleibenszeit -- :--:-- angezeigt wird, was das Ende des Programms anzeigt, und klicken Sie dann auf Beenden , um das Programm zu beenden.
    5. Beenden Sie das Programm, nachdem der Vorgang abgeschlossen ist. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.
  2. Vorbereitung auf die Bibliothek
    1. Tauen Sie den Pre-Lib-Puffer auf RT auf. Durch Pipettieren gründlich mischen und sofort 2-3 s bei 200 x g zentrifugieren.
    2. Bereiten Sie eine Mastermischung für die Vorbibliotheksreaktion wie folgt vor: 2 μl Pre-Lib Enzymmischung zu 60 μl Pre-Lib Puffer geben, die Reaktion gründlich mischen und kurz zentrifugieren.
    3. Geben Sie 60 μl der Reaktionsmischung aus der Vorbibliothek in jede vorbehandelte Medienprobe aus dem vorherigen Schritt. Durch Pipettieren gründlich mischen und sofort 2-3 s bei 200 x g zentrifugieren.
    4. Legen Sie das/die PCR-Röhrchen(s) aus Schritt 3.2.3 in die Probenvorbereitungsstation und führen Sie das Vorbibliotheksprogramm wie folgt aus: 95 °C für 2 Minuten; 12 Zyklen mit 15 °C für 40 s, 22 °C für 40 s, 33 °C für 30 s, 65 °C für 30 s, 72 °C für 40 s, 95 °C für 10 s und 63 °C für 10 s; und bei 4 °C halten.
      1. Klicken Sie auf das Pre_Lib Symbol, um den Einrichtungsbildschirm aufzurufen.
      2. Wählen Sie Tube für den Steuerungsmodus; Eingang 70 μL für Probenvolumen; Wählen Sie Ein für Heißdeckelsteuerung und geben Sie 105 °C als Temperatur ein. Wählen Sie Nein für Pause beim ersten Seg. Klicken Sie auf OK , um fortzufahren.
      3. Warten Sie, bis unter Verbleibenszeit --:--:-- angezeigt wird, was das Ende des Programms anzeigt, und klicken Sie auf Beenden, um das Programm zu beenden.
    5. Beenden Sie das Programm, wenn der Vorgang abgeschlossen ist. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.
  3. Vorbereitung der Bibliothek
    1. Den Bibliothekspuffer auf RT auftauen. Durch Pipettieren gründlich mischen und sofort 2-3 s bei 200 x g zentrifugieren.
    2. Bereiten Sie eine Mastermischung für die Bibliotheksreaktion wie folgt vor: 1,6 μl Library Enzyme Mix zu 60 μl Library Buffer geben, die Reaktion gründlich mischen und kurz zentrifugieren.
    3. Geben Sie 60 μl Bibliotheksreaktionsmischung und 2 μl Barcode-Primer zu jedem Vorbibliotheksprodukt aus Schritt 3.2.3. Die Reaktion gründlich mischen und kurz zentrifugieren.
    4. Legen Sie das/die PCR-Röhrchen(s) aus Schritt 3.2.3 in den Thermocycler und führen Sie das Bibliotheksvorbereitungsprogramm wie folgt durch: 94 °C für 30 s; 17 Zyklen mit 94 °C für 25 s, 62 °C für 30 s und 72 °C für 45 s); und dann bei 4 °C halten.
      1. Klicken Sie auf das Lib_Prep Symbol, um den Einrichtungsbildschirm aufzurufen.
      2. Wählen Sie Tube für den Steuerungsmodus; Eingang 130 μL für Probenvolumen; Wählen Sie Ein für Hotlid-Steuerung und geben Sie 105 °C für die entsprechende Temperatur ein. Wählen Sie Nein für Pause beim ersten Seg. Klicken Sie auf OK , um fortzufahren.
      3. Warten Sie, bis unter Verbleibenszeit --:--:-- angezeigt wird, was das Ende des Programms anzeigt, und klicken Sie auf Beenden, um das Programm zu beenden.
  4. Bibliotheksreinigung
    1. Nehmen Sie Magbeads vor dem Reinigungsschritt mindestens 20 Minuten lang bei 2-8 °C aus dem Lager. Vortex und Mischen Sie die Magbeads 20 s lang. Geben Sie genügend Kügelchen für den Reinigungsschritt in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und erwärmen Sie die Kügelchen für RT.
    2. Fügen Sie 1x Magbeads zu jeder Bibliothek hinzu. Durch Auf- und Abpipettieren ≥10 Mal mischen und 5 Minuten bei RT inkubieren.
      HINWEIS: Geben Sie z. B. 100 μl Magbeads zu 100 μl Bibliotheksprobe.
    3. Nach der Inkubation das Röhrchen kurz zentrifugieren und auf einen magnetischen Ständer stellen.
    4. Warten Sie ca. 5 Minuten, bis die Lösung klar ist. Während Sie das Röhrchen auf dem magnetischen Ständer lassen, saugen Sie die Lösung vorsichtig an und entsorgen Sie sie.
    5. 200 μl frisch zubereitetes 80%iges Ethanol in das Röhrchen geben. 30 s bei RT inkubieren und den Überstand vorsichtig entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal.
    6. Entfernen Sie das Ethanol so vollständig wie möglich. Lassen Sie die Perlen auf dem magnetischen Ständer ca. 5-10 Minuten bei RT an der Luft trocknen.
    7. Nehmen Sie das Röhrchen vom magnetischen Ständer, fügen Sie 17,5 μl Elutionspuffer hinzu und wirbeln Sie das Röhrchen auf, um die Kügelchen wieder zu suspendieren. Das Röhrchen kurz zentrifugieren und 5 min bei RT inkubieren.
    8. Legen Sie das Röhrchen auf den magnetischen Ständer und warten Sie, bis die Lösung klar ist. 15 μl Überstand vorsichtig in ein neues Röhrchen überführen.
  5. Quantifizierung von Bibliotheken
    1. Quantifizieren Sie gereinigte Bibliotheken unter Verwendung des Fluorometers gemäß der Bedienungsanleitung der qubit dsDNA HS Assay-Kits28. Die Ausbeute der Bibliotheken reicht von ~15 bis 300 ng.
  6. Bibliotheks-Pooling
    1. Verwenden Sie 10 Nanogramm jeder Bibliotheksprobe für das Pooling.
  7. Sequenzierung
    1. Weitere Informationen finden Sie im Benutzerhandbuch für die Sequenzierung (15027617 v01)29.
    2. Gereinigte Bibliothekssequenzen von 50 bp an einem einzigen Ende auf der Plattform ergaben etwa 2 Millionen Reads für jede Probe, und es wurde eine Sequenzierungstiefe von 0,03 × empfohlen.
  8. Datenanalyse
    1. Geben Sie den Namen und das Kennwort des Benutzers auf der Anmeldeseite ein
    2. Nachdem Sie sich beim System angemeldet haben, klicken Sie auf Analyse und eine neue Seite wird angezeigt. Klicken Sie auf der Registerkarte NICS-A auf Übermittlung erstellen . Wählen Sie dann NGS für die Plattform aus, wählen Sie Unternehmen aus, wählen Sie NICSInst für das Reagenz, geben Sie die Projektinformationen in das Feld unter Projekt-ID ein, legen Sie die Analyseeinstellungen fest und laden Sie die Dateien hoch. Nachdem alle Sequenzierungsdateien erfolgreich hochgeladen wurden, klicken Sie auf Senden , um die Analyse zu starten (Abbildung 3A).
    3. Klicken Sie auf Einreichungen anzeigen , um die Liste der eingereichten Projekte anzuzeigen. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, ändert sich der Status eines Projekts in "Abgeschlossen" und im Berichtsfeld wird die Schaltfläche "Anzeigen" angezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Anzeigen , um die Übersichtstabelle der NICS-Analyse anzuzeigen (Abbildung 3B).
    4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bericht exportieren , um die Berichte zu speichern (Abbildung 3C).
      HINWEIS: Für jede Analyse werden drei Dateitypen exportiert. Eine Grafikdatei, die alle CNV-Diagramme (Copy Number Variation) für jedes Chromosom und das gesamte Genom enthält, die im Ordner "graph" gespeichert werden. eine Tabelle, die die Beispiel-QC-Details dieses Analyselaufs enthält; eine Dokumentdatei, die die vom Benutzer angepassten NICS-Berichte enthält; und eine Tabelle, die die Beispielzusammenfassungsinformationen dieses Analyselaufs enthält.

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Ergebnisse

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In der vorliegenden Studie wurde die vorgeschlagene Methode auf einen Patienten angewendet. Die IRB-Genehmigung und die Einwilligung nach Aufklärung wurden vor der Anwendung der NICS-Analyse eingeholt. In der vorliegenden Studie wurden 6 Blastozysten von Patientinnen entnommen und NICS an allen 6 Embryonen an Tag 4 bis Tag 5 durchgeführt. Chromosomenanomalien, die durch die balancierte Translokation der Eltern verursacht wurden, wurden in fünf Chromosomen mit dem NICS-Assay nachgewiesen; daher konnten sie nicht für die Ü...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modifikationen und Fehlerbehebung

Wenn die NICS-Ergebnisse mit elterlichem genetischen Material verunreinigt sind, stellen Sie sicher, dass alle Cumulus-Corona-Radiata-Zellen entfernt werden und stellen Sie sicher, dass eine ICSI zur Befruchtung durchgeführt wird. Unsachgemäße Medienlagerung oder Template-Vorbereitungsprozesse werden vermieden, die die DNA abbauen können. Der Arbeitsraum wurde gründlich mit DNase- und RNase-Dekontaminationsreagenzien gereinigt. Um eine Kontami...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaxin Yao, Jieliang Ma, Jing Wang und Sijia Lu sind Mitarbeiter von Yikon Genomics Co., Ltd.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Shiping Bo und Shujie Ma für ihre Unterstützung bei der NGS-Datenanalyse. Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch das National Key Research and Development Program unterstützt (Grant No. 2018YFC1003100).

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Materialien

Es werden

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL EP-Röhrchen, 0,2 mL PCR-RöhrchenAxygenMCT-150-C, PCR-02-CDNase/RNase frei, Low Binding PCR Röhrchen und 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen empfohlen.
10 & Mikro; L, 200 & Mikro; L, 1000 &Mikro; L DNase /RNase freie SpitzenAxygenT-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-SDies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Für den Probentransfer
100 % EthanolSinopharm Chemical 10009218Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Für die Aufreinigung von DNA-Bibliotheken
Barcode Primer1-48Yikon GenomicsReagenz in NICSInst-BibliotheksvorbereitungskitFür die Bibliotheksamplifizierung
BD Falcon Organkulturschale, SterileBD Bioscience363037Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Für Embryokulturen
BD Falcon Gewebekulturschalen (Easy Grip), SterileBD Bioscience353001Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Für Embryokulturen
BD Falcon Gewebekulturschalen, SterileBD Bioscience353002Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Für Embryokulturen
ZelllysepufferYikon GenomikReagenz in NICSInst Bibliothek VorbereitungskitFür die Vorbehandlung von Kulturmedien
Zelllyse EnzymYikon GenomicsReagenz in NICSInst Bibliothek VorbereitungskitFür die Vorbehandlung von Kulturmedien
ChromGo SoftwareYikon GenomicsDatenanalyse
CMPure MagbeadsYikon GenomicsReagenz in NICSInst Bibliothek VorbereitungskitFür die Bibliotheksaufreinigung
Cryotop offenes System  KITAZATO BioPharma81110Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden / Für die Vitrifikation von Embryonen
Destillieren Sie WasserYikon GenomicsReagenz in NICSInst Bibliothek VorbereitungskitZum Auflösen von DNA
ES (Vitrifikationskit)  KITAZATO BioPharmaReagenzien-inVitrifikations-KitDies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Für die Vitrifizierung von Embryonen
HOLDNIGORIGIOMPH-MED-35Dies kann durch eine andere
-Marke ersetzt werden/Für ICSI-Hyaluronidase-Lösung
, 80 U/mlSAGEART4007-ADies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Digest Eizell-Corona-Kumulus-Komplex
ICSIORIGIOMPH-35-35Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Für ICSI
Illumina MiSeq® SystemIlluminaSY-410-1001Für die Sequenzierung von Bibliotheken
InkubatorLabotectInkubator C16Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden / Für Embryokulturen
BibliothekspufferYikon GenomicsReagenz in NICSInst Bibliothek VorbereitungskitFür Bibliothek Amplifikaton
Bibliothek Enzym MixYikon GenomicsReagenz in NICSInst Bibliothek VorbereitungskitFür Bibliothek amplificaton
MagnetstativDynaMagTM-212321DFür die Bibliotheksaufreinigung
MikroskopOLYMPUS1X71Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Für die Embryonenbeobachtung
Mini-ZentrifugeESSENSCIENELF6Für die Trennung
MT Enzyme MixYikon GenomicsReagenz in NICSInst-BibliotheksvorbereitungskitFür die Vorbehandlung von Kulturmedium
NICSInst-Kit zur Vorbereitung von BibliothekenYikon GenomicsKT1000800324Amplifikation des gesamten Genoms und Bibliotheksaufbau
NICSInst ProbenvorbereitungsstationYikon Genomics  ME1001003Amplificate DNA
Nunc IVF 4-Well DishThermo Scientific144444Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden / Für das Waschen von Embryonen und Blastozystenkulturen
Pasteur PipetteOirgio  MXL3-IND-135Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Für Embryo-Tansfer-Pasteur-Pipetten
ORIGIOPP-9-1000Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Für IVF-Labore
Pre-Lib BufferYikon GenomicsReagenz in NICSInst Bibliothek VorbereitungskitPre-Lib
EnzymYikon GenomicsReagenz in NICSInst Bibliothek VorbereitungskitVorbibliothek Vorbereitung
Qubit® 3.0 FluorometerThermo ScientificQ33216Für die Quantifizierung von Bibliotheken
Quinn's Advantage Blastocyst MediumSAGEART-1029Für die Blastozystenkultur im Embryostadium
Quinn's Advantage SpaltmediumSAGEART-1026Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Für die Kultur im Spaltstadium des Embryos
Quinn's Advantage Befruchtung MediumSAGEART-1020Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Für die Befruchtung von Eizellen und Spermien
Quinn's Advantage m-HTF Medium mit HEPESSAGEART-1023Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Für Embryonen Clutrure
Quinn's Advantage SPS Serum Protein Substitute KitSAGEART-3010Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Zur Entblößung der Eizelle
Quinn's Advantage Gewebekultur-MineralölSAGEART-4008PDies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Um das Kulturmedium abzudecken
-SPITZENORIGIOMXL3-IND-135Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Zur Denudation von Granulosazellen
Vitrifikation Cryotop Offener SystemtermKIZTAZATO81111Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Für die Vitrifikation von Embryonen
Vitrifikationskit  KITAZATO BioPharmaVT101Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Für die Vitrifikation von Embryonen
VortexerQilinbeierDNYS8Probenmischung
VS (Vitrifikationskit)  KITAZATO BioPharmaReagenzien-inVitrifikations-KitDies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Für die Vitrifikation von Embryonen
ZILOS-tk Laser SystemHamilton ThorneCLASS 1 LaserDies kann durch eine andere Marke ersetzt werden/Für den künstlichen Blastocoele-Kollaps

Referenzen

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Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis
Posted by JoVE Editors on 10/01/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. The Protocol and Representaive Results sections were updated.

In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

to:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

In the Representative Results, Figure 3 was updated from:

Data analysis software screenshots, report export, computational results, chromatography data analysis.
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Data analysis software interface for embryo implantation potential; input form, result summary, export options.
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. Please click here to view a larger version of this figure.

Schlagwörter

Nicht invasive Chromosomen ScreeningGenomweite AmplifikationLibrary Pr parationNext Generation SequencingEmbryokulturmediumAneuploidie Detektion

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