Methodenartikel

Einzelzellcharakterisierung von Kalziumzufluss und HIV-1-Infektion mit einer multiparametern optofluidischen Plattform

DOI:

10.3791/62632

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18. Mai 2021

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1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, 3Black Family Stem Cell Institute, Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, 4Sema4, a Mount Sinai venture

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein Protokoll vor, in dem einzelne Zellen auf akute Ereignisse und produktive HIV-1-Infektionen auf einem nanofluidischen Gerät überwacht werden. Bildgebende Daten definieren Virus-Wirt-Rezeptor-Interaktionen und Signalwegdynamik. Dies ist die erste Methode für nanofluidische Hochdurchsatz-Längskultur und Bildgebung von Einzelzellen, um Signalkinetik und molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HIV-1 verursacht eine chronische Infektion, von der weltweit mehr als 37 Millionen Menschen betroffen sind. Menschen, die mit dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) leben, erleben trotz antiretroviraler Therapie eine Komorbidität im Zusammenhang mit chronischen Entzündungen. Diese entzündlichen Signale wurden jedoch nicht vollständig charakterisiert. Die Rolle von Früheintrittsereignissen bei der Aktivierung zellulärer Signalereignisse und der nachgelagerten Genexpression wurde auf Einzelzellebene nicht erfasst. Hier beschreiben die Autoren eine Methode, die Prinzipien der Lebendzellfluoreszenzmikroskopie auf eine automatisierte Einzelzellplattform anwendet, die Zellen über benutzerspezifische Zeitkurse kulturiert und abbildet, was eine Hochdurchsatzanalyse dynamischer zellulärer Prozesse ermöglicht. Dieser Assay kann die einzellige Live-Fluoreszenzmikroskopie von frühen Ereignissen verfolgen, die unmittelbar auf eine HIV-1-Infektion folgen, insbesondere den Zustrom von Kalzium, der mit der Exposition gegenüber dem Virus einhergeht, und die Entwicklung einer produktiven Infektion mit einem fluoreszierenden Reportervirus. MT-4-Zellen werden mit einem kalziumempfindlichen Farbstoff beladen und in isolierten Pens auf einem nanofluidischen Gerät kultiviert. Die kultivierten Zellen sind mit einem HIV-1-Reportervirus (HIV-1 NLCI) infiziert. Ein Fluoreszenzmikroskop, das über dem nanofluidischen Gerät positioniert ist, misst den Kalziumzustrom über einen Zeitraum von 8 Minuten nach akuter HIV-1-Exposition. Die HIV-1-produktive Infektion wird in denselben Zellen über ein 4-Tage-Intervall gemessen. Bildgebende Daten aus diesen Zeitverläufen werden analysiert, um Virus-Wirt-Rezeptor-Interaktionen und Signalwegdynamik zu definieren. Die Autoren präsentieren eine integrierte, skalierbare Alternative zu herkömmlichen Bildgebungsmethoden mit einer neuartigen optofluidischen Plattform, die in der Lage ist, Einzelzellensortierung, Kultivierung, Bildgebung und Softwareautomatisierung zu ermöglichen. Dieser Assay kann die Kinetik von Ereignissen unter verschiedenen Bedingungen messen, einschließlich Zelltyp, Agonist oder Antagonisteneffekt, während er eine Reihe von Parametern misst. Dies ist die erste etablierte Methode für nanofluidische Hochdurchsatz-Längskultur und Bildgebung: Diese Technik kann breit angepasst werden, um zelluläre Signalkinetik und dynamische molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen.

Einleitung

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Chronische Entzündungen sind eine der Hauptursachen für HIV-assoziierte frühe Morbiditäten und Mortalität1,2,3. Es gibt mehrere Mechanismen, durch die HIV entzündliche Signale aktivieren kann, und neuere Beweise deuten auf eine Rolle für die P2X-Rezeptoren beim HIV-Eintritt hin, die Calcium-gating Adenosintriphosphat (ATP)-Rezeptorensind 3,4,5,6,7,8,9,10. Der P2X-Subtyp der purinergen Rezeptoren (P2XR) kann wichtige Vermittler dieser Entzündung sein. Die molekularen Mechanismen der HIV-P2XR-Interaktionen sind jedoch weitgehend unbekannt und können sich auf frühe und späte Schritte des viralen HIV-1-Lebenszyklus auswirken. Die Definition der Wege und Kinetik, die HIV-assoziierte chronische Entzündungen antreiben, ist entscheidend für die Weiterentwicklung der Behandlungsmöglichkeiten für Menschen mit HIV.

Um zu beurteilen, ob HIV-1 P2X-Rezeptoren direkt quälisiert, müssen P2XR-Aktivierung und HIV-1-Infektion parallel gemessen werden. Assays der P2XR-Aktivität und der HIV-1-Infektion wurden unabhängig voneinander etabliert: Der zelluläre Kalziumzustrom ist ein Indikator für die P2XR-Aktivierung, und die HIV-1-produktive Infektion kann durch RNA-Häufigkeit quantifiziert werden. Der Fluoreszenznachweis von Kalziumzustrom ist mit dem calciumempfindlichen Farbstoff Fluo-4 möglich, und eine HIV-1-Infektion kann mit dem mCherry Fluoreszenz-Reportervirus HIV-NLCI11,12,13,14,15visualisiert werden .

Da diese Indikatoren für die P2X-Aktivierung (akuter zellulärer Kalziumzustrom) und die HIV-1-Infektion (HIV-1-RNA-Synthese) auf unterschiedlichen Zeitskalen (Minuten versus Tage) auftreten, fehlt eine Hochdurchsatzmethode, die eine gepaarte Analyse der P2XR-Aktivierung und der HIV-1-Infektion ermöglicht. Experimentelle Standardtechniken mit hohem Durchsatz, wie die Durchflusszytometrie, ermöglichen die Populationsanalyse, können jedoch den Zusammenhang zwischen akuten und longitudinalen Ereignissen in einzelnen Zellen nicht beurteilen. Alternativ ist die Einzelzellbildgebung mit Standard-Fluoreszenzmikroskopie ein niedriger Durchsatz. Diese experimentellen Einschränkungen erfordern neuartige Hochdurchsatztechniken, um Assoziationen zwischen akuten und longitudinalen zellulären Ereignissen direkt zu messen.

Ein beschriebenes optofluidisches System ist eine neuartige Plattform, die in der Lage ist, Einzelzellensortierung und -isolierung, Kultivierung, Bildgebung und Softwareautomatisierung16,17,18,19zu verwenden. Dieses System stellt eine integrierte Alternative mit hohem Durchsatz zu den Einschränkungen herkömmlicher bildgebender Verfahren dar. Die Beacon-Plattform besteht aus einem Kohlendioxid (CO2)und einem temperaturgesteuerten Inkubator, der die auf einem Chip enthaltenen Zellen unterstützt. Der Chip besitzt lichtempfindliche Transistoren, die als Reaktion auf gezieltes Licht einen elektrischen Gradienten erzeugen. Diese resultierende dielektrophoretische Kraft wird genutzt, um einzelne Zellen über den nanofluidischen Chip in die gewünschten Regionen zu bewegen. Die Zellen werden auf dem Chip in Stifte sortiert, die eine Barriere darstellen, um einzelne Zellen physisch zu isolieren. Ein kontinuierlicher laminarer Fluss von Wachstumsmedien im gesamten Chip verhindert die Zellmigration aus den Pens und ermöglicht gleichzeitig die Diffusion von Nährstoffen und experimentspezifischen Reagenzien mit kleinen Partikeln. Über dem Chip sitzt ein Fluoreszenzmikroskop. Software-Automatisierung wird verwendet, um Bilder des Chips zum benutzerdefinierten Zeitpunkt zu erfassen.

Die gesamte Zellcharakterisierung wurde mit einem optofluidischen System zur Einzelzellselektion und -manipulation durchgeführt. Dieses System besteht aus integrierten mechanischen, mikrofluidischen und optischen Komponenten, die Einzelzellmanipulation, Assay, Kultur und Bildgebung ermöglichen. Die Zellen werden auf das nanofluidische Einweggerät geladen und kultiviert, das aus 3.500 einzelnen Kammern (Pens) besteht, die jeweils ein Sub-Nanoliter-Volumen halten können. Zellen können in Pens mit lichtinduzierten dielektrophoretischen "Käfigen" positioniert und unter temperatur- und CO2-kontrollierten Bedingungenkultiviert werden. Die Mikrofluidik ermöglicht die Perfusion von Medien oder Puffern auf dem Chip zur Zellkultur oder medikamentösen Behandlung. Eine betätigte Nadel ermöglicht den Import und Export von Zellen aus inkubierten und geschlossenen Brunnenplatten. Der Chipbereich kann bei 4- oder 10-facher Vergrößerung in Hellfeld- und Fluoreszenzkanälen (einschließlich DAPI, FITC, TRed oder Cy5) abgebildet werden, um zelluläre Phänotypen oder Funktionsanalysen zu charakterisieren. Das gesamte System wird mithilfe von Software automatisiert, die für vorgefertigte Workflows oder benutzerdefinierte Experimente verwendet werden kann.

Beziehungen zwischen HIV-1-Infektion und P2XR wurden untersucht, aber ein Hochdurchsatzverfahren zur direkten Charakterisierung dieser Wechselwirkungen parallel wurde nicht berichtet. Hier beschreiben die Autoren eine Methodik zur Untersuchung von HIV-P2XR-Interaktionen durch Verfolgung des akuten Kalziumzustroms und der anschließenden HIV-1-produktiven Infektion auf Einzelzellebene. Insbesondere etabliert dies ein neuartiges Werkzeug, das eine direkte Längsmessung mehrerer Ziele in einzelnen Zellen mit hohem Durchsatz ermöglicht.

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Protokoll

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1. Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung

  1. Bereiten Sie eine frische Fluo-4 AM-Ladelösung vor: Fügen Sie 25 μL 100x konzentriertes Reinigungsmittellösungsmittel hinzu und fügen Sie dann 2,5 μL Fluo-4 AM 1000x in ein 1,5 ml Röhrchen hinzu. Wirbel zum Mischen.
  2. 2,5 ml Nährmedien in die Ladelösung pipetten und zum Mischen invertieren. Vor Licht schützen.
  3. Zentrifuge 2 x 106 MT-4 Zellen bei 500 x g für 3 min.
  4. Entfernen Sie das Medium und entfernen Sie das Pellet in 2 ml der vorbereiteten Fluo-4 AM-Ladelösung. Vor Licht schützen.
  5. Pipette resuspendierte Zellen in eine 35 mm Petrischale. Bei 37 °C 15-30 min inkubieren und dann weitere 15-30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  6. Die Zellsuspension in ein Zentrifugenrohr überführen. Zentrifugenzellen bei 500 x g für 3 min und entfernen Sie den Überstand bestehend aus der Ladelösung.
  7. Das Zellpellet durch Pipettieren in 1 ml des Kulturmediums wieder aufregen und bei 500 x g zentrifugieren, um 3 min zu waschen.
  8. Das Zellpellet wird durch Pipettieren im Kulturmedium in einer Konzentration von 2 x 106 Zellen/ml (mindestens 50 μL) wieder aufgebraucht. Vor Licht schützen.

2. Optofluidische Systemvorbereitung, Zellbeladung und Zellmisting

  1. Bereiten Sie einen Chip mit der Benetzungslösung vor, der das Zellpfing erleichtert.
    1. Laden Sie dazu Zentrifugenröhrchen mit 2 mL Benetzungslösung und 50 mL DI-Wasser mit einem neuen optofluidischen Chip auf das Instrument und führen Sie die Wet-Chip-Funktion aus. Diese Funktion flutt den Chip automatisch mit der Benetzungslösung durch die Systemfluidik, inkubiert den Chip bei 50° C und spült den Chip 3 mal mit Wasser.
    2. Sobald die Wasserspülung abgeschlossen ist, spülen Sie den Chip mit 3 Zyklen von 250 μL Nährmedien.
  2. Ergänzen Sie die Zellsuspension aus Schritt 1.8 mit 1:100 F-127 Reinigungsmittel gelöstem Reinigungsmittel vor der Beladung, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass Zellen an den Chipkanälen haften.
  3. Verwenden Sie die Instrumentenexportnadel, um Zellen aus einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit dem Load-Vorgang und dem Small Volume Import für ein 5 μL-Zellpaketvolumen zu importieren.
  4. Stiftzellen mit einer optimierten optoelektronischen Positionierspannung (OEP) von 4,3 V und 5 μm/s Käfiggeschwindigkeit. Penning erfolgt mit OEP. Führen Sie das Schreiben mit der Autopen-Funktion durch, die einzelne Zellen automatisch erkennt, sie mit einem OEP-Käfig umgibt und sie in einen nahe gelegenen Stift bewegt. Wenn nach dem automatischen Schreiben noch interessante Zellen übrig bleiben, verwenden Sie die Funktion Manueller Stift, um Zielzellen (mit einem Mausklick) und einen Zielstift (mit einem anschließenden Mausklick) auszuwählen.
  5. Sobald das Penning abgeschlossen ist (entweder wenn die Autopen-Funktion abgeschlossen ist oder wenn die gewünschte Anzahl von gepferchten Zellen erreicht wurde), spülen Sie den Chip mit 3 Zyklen von 250 μL Nährmedien, um alle verbleibenden nicht gepennten Zellen vom Chip zu befreien.

3. Einzelzellinfektion und funktionelle Bildgebung

  1. Nach dem Penning von Zellen erhalten Sie fluoreszierende Bilder von Zellen in FITC-, Texas Red- und DAPI-Kanälen, um die Ausgangswerte Fluo-4, mCherry und Autofluoreszenz zu messen.
  2. Infundieren Sie HIV-1 in einer Konzentration von 13 ng HIV-1 NL-CI pro 2 x 106 Zellen in den Mikrochip, indem Sie die Suspension langsam durch die Exportnadel in den Chip pipettieren.
  3. Unmittelbar nach der HIV-1-Zugabe erhalten Sie wiederholt Bilder in den FITC- und DAPI-Kanälen über einen 10-minütigen Zeitverlauf.
  4. Erhalten Sie Bilder in den Texas Red- und DAPI-Kanälen 1-, 2-, 3- und 4-Tage-Post-Infektion (DPI).

4. Analyse von einzelligen funktionellen Bildgebungsdaten mit der FIJI-Software

  1. Verwenden Sie zu jedem Zeitpunkt in jedem interessierenden Bildgebungskanal das FIJI Point Selection-Tool und die Measure-Funktion, um die Fluo-4-, mCherry- und Autofluoreszenzsignale jeder Zelle zu messen. Messen Sie gleichzeitig die Hintergrundfluoreszenz, indem Sie die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) des Pens und Chips berechnen, der jede Zelle enthält.
  2. Steuern Sie die Hintergrundfluoreszenz und Autofluoreszenz, indem Sie die Measure-Funktion verwenden, um das MFI in einer Regionsauswahl zu finden und diesen Wert vom Zellfluoreszenzwert zu subtrahieren.
  3. Normalisieren Sie die Hintergrundfluoreszenz jedes Chipbildes: Messen Sie die MFI des Chips in jedem Feld. Subtrahieren Sie dann das MFI des Chips mit der geringsten Hintergrundfluoreszenz von allen anderen Chip-MFI-Messungen.
  4. Normalisieren Sie die Hintergrundfluoreszenz jedes zellhaltigen Stifts: Messen Sie die MFI des Stifts jeder Zelle in jedem Sichtfeld. Subtrahieren Sie dann diesen Wert vom rohen MFI der Zelle für jedes Feld.
  5. Kontrolle für die Zellautofluoreszenz: Subtrahieren Sie den Tag 0 und Tag 4 DAPI MFI jeder Zelle von den Tag 0 und Tag 4 mCherry MFIs.

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Ergebnisse

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Abbildung 1 zeigt das Format des Chips und die mit dem Fluoreszenzmikroskop erfassten Rohdaten. Die Identifizierung und Clusterung von nicht infizierten und infizierten Zellen mittels mCherry-Messung ist in Abbildung 2 dargestellt. Diese Cluster werden in Abbildung 3auf Kalziumzuflusskinetik analysiert, die einen frühen Kalziumzustrom in HIV-infizierten Zellen zeigt. Abbildung 4 zeigt eine signifikante ...

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Diskussion

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Die beschriebene Methodik zur Untersuchung der Beziehung zwischen Kalziumzustrom und HIV-1-produktiver Infektion in einzelnen Zellen kann angepasst werden, um die intrazelluläre Kalziumkinetik als Reaktion auf andere Agonisten oder Antagonisten von Interesse zu untersuchen. Die Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung ist einfach, minimal zeitintensiv und Reagenzien sind in praktischen Kits von weit verbreiteten Herstellern erhältlich. Die Calciummessung auf Fluo-4-Basis ist in der Literatur gut beschrieben, und HIV-1 ...

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Offenlegungen

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R.P.S. ist Mitarbeiter von Sema4. Die anderen Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Wir sind dankbar für die wissenschaftlichen Gespräche mit Dr. Benjamin Chen. Diese Arbeit wurde von K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS und KB) und R21AI152833 (THS und KB) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
  Leuchtfeuer Optofluidisches SystemBerkeley Leuchten
  Fötales RinderserumGibco
  FidschiOpen-Source-SoftwarePMID: 22743772, 22930834
  Fluo-4 Calcium Imaging KitThermo Fisher  F10489
  HIV-1 NLCINL4-3Labor von Benjamin ChenPMID: 28148796
  Hyclone Pennecillin Streptomycin-LösungGE Healthcare Life Sciences  SV30010
  MT-4-ZellenNIH AIDS Reagenz  ARP-120
  OptoSelect 3500 ChipBerkeley Leuchten
  PipettierspitzenDenville Scientific P3020-CPS
  Prism 9.0.0GraphPad
  RPMI-1640 MediumSigma-Aldbsp; R8758
Serologische Pipettender Marke Fishernbsp; 13-678-11E
GewebekulturhaubeVerschiedene Modelle
T75 KolbenCorning3073
&

Referenzen

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EinzelzellanalyseLive Cell ImagingFluoreszenzmikroskopienanofluidisches BauteilMT 4 ZellenReporterviruszellul re Signaltransduktion

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