Speicheldrüsen wurden als Gewebezielstelle für die Gentherapie vorgeschlagen, insbesondere im Bereich der Impfung durch Gentransfer. Wir demonstrieren die Genabgabe in einem nicht-menschlichen Primatenmodell mit retrograder Ohrspeicheldrüseninfusion.
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Methodenartikel
Retrograde Ohrspeicheldrüseninfusion durch Stensen-Kanal in einem nicht-menschlichen Primaten für vektorierte Genabgabe
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Speicheldrüsen sind ein attraktives Gewebeziel für die Gentherapie mit vielversprechenden Ergebnissen, die bereits zu Studien am Menschen führen. Sie sind von Natur aus in der Lage, Proteine in den Blutkreislauf zu sezernieren und sind leicht zugänglich, was sie potenziell überlegene Gewebestellen für die Ersatzhormonproduktion oder Impfung durch Gentransfer macht. Vorgeschlagene Methoden für die Genabgabe umfassen die transkutane Injektion und die retrograde Infusion durch Speichelgänge. Wir zeigen, wie retrograde Speicheldrüseninfusion (RSGI) bei nicht-menschlichen Primaten durchgeführt wird. Wir beschreiben die wichtigen anatomischen Orientierungspunkte, einschließlich der Identifizierung der Ohrspeicheldrüsenpapille, einer atraumatischen Methode zum Kanülieren und Versiegeln des Stensen-Kanals unter Verwendung grundlegender zahnärztlicher Werkzeuge, Polyethylenschläuche und Cyanacrylat sowie der entsprechenden Infusionsrate. Während dies die am wenigsten traumatische Methode der Entbindung ist, ist die Methode immer noch durch das Volumen begrenzt, das abgegeben werden kann (<0,5 ml) und das Potenzial für ein Trauma des Kanals und der Drüse. Wir zeigen mit Hilfe der Fluoroskopie, dass ein Infusat vollständig in die Drüse abgegeben werden kann, und zeigen durch Immunhistochemie die Transduktion eines typischen Vektors und die Expression des gelieferten Gens.
Einleitung
Während Speicheldrüsen für ihre exokrine Speichelproduktion bekannt sind, haben Forscher seit langem ihre Fähigkeit erkannt, Proteine direkt in den Blutkreislauf 1 abzusondern, was sie zueinempotenziellen Ziel für die Gentherapie zur systemischen Verabreichung macht, wie Ersatzhormone oder Antikörperproduktion. Tatsächlich bieten Speicheldrüsen mehrere Vorteile gegenüber anderen Gewebezielen, wie die inhärente Fähigkeit, Proteine für die Sekretion zu produzieren (eine Eigenschaft, die Muskeln fehlt), eine starke Verkapselung, die die Vektordiffusion begrenzen kann, und gut differenziertes Gewebe, das Stabilität für nicht integrierende Vektoren bietet. Darüber hinaus sind Speicheldrüsen im Falle eines schwerwiegenden unerwünschten Ereignisses nicht lebenskritisch und können operativ entfernt werden. Obwohl nicht sofort intuitiv, sind Ohrspeicheldrüsen auch leicht vom Mund durch ihren Hauptausscheidungsgang, Stensens Duct2,zugänglich.
Angesichts der Vorteile von Speichelgewebe für die Gentherapie steigt das Interesse an der Erforschung dieses Gewebeziels. Zahlreiche Studien wurden bereits in Nagetier-, Hunde- und nicht-menschlichen Primatenmodellen durchgeführt, und mindestens eine klinische Studie am Menschen ist im Gange3,4,5. Um den Nutzen dieses Gewebeziels für Gentherapiezwecke weiter zu erforschen und zu entwickeln, müssen weitere nicht-menschliche Primatenstudien durchgeführt werden. Dieser Artikel beschreibt eine Methode für den Zugang zu den Ohrspeicheldrüsen durch Stensens Kanal, um ein vektoriertes Gen für die Transduktion im nicht-menschlichen Primatenmodell zu liefern. Um die Abgabe des Infusats und die Anatomie des Kanals beim Eintritt in die Drüse sichtbar zu demonstrieren, wurde eine Durchleuchtung mit Radiokontrast durchgeführt. Um eine erfolgreiche Transduktion eines Vektors nachzuweisen, wurde ein Adenovirus-Serotyp 5 (Ad5) vektorisiertes egfp-Gen verwendet. Ad5 ist ein gut beschriebener Vektor, der in der Lage ist, Speichelgewebe zu transduzieren. Obwohl es für den endgültigen klinischen Einsatz zu immunogen ist, wurde für diese Demonstrationsstudie ein Ad5-Vektor ausgewählt, um eine effiziente Transduktion zu gewährleisten. Die Evaluierung der Produktion von Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) ist eine gut beschriebene Methode zum Nachweis der erfolgreichen Transkription und Translation eines vektorisierten Gens nach der Transduktion und wurde hier durchgeführt.
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Protokoll
Alle Verfahren wurden an der Wake Forest School of Medicine Clarkson Campus für Tierversuche durchgeführt. Das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) wurde aus ethischen Gründen konsultiert und Details der Verfahren wurden zur Überprüfung vorgelegt. Wake Forest IACUC genehmigte unser Studienprotokoll und alle Verfahren wurden unter dem von der IACUC genehmigten Protokoll #A17-147 durchgeführt.
1. Vorbereitung der Infusionsvorrichtung
- Größe 10 Polyethylenrohr (PET10) mit einer Schere in 25 cm Länge schneiden.
- Markieren Sie PET10 bei 1 cm und 2 cm von einem Ende mit einem schwarzen Marker.
- 0,5 ml Ad5-EGFP-Lösung (109 Viruspartikel/ml) in eine 1 ml (Tuberkulin) Spritze vorfüllen.
- Schieben Sie das nicht markierte Ende des PET10-Röhrchens über eine 29-31 G Nadel, die an einer Spritze befestigt ist. Es ist im Allgemeinen einfacher, diese Aufgabe unter Vergrößerung auszuführen.
- Die Lösung in das PET10 geben, bis das Röhrchen vollständig voll ist (sichtbarer Tropfen am freien Ende).
- Verwenden Sie vollständige Standard-PSA, einschließlich chirurgischer Peelings, langärmeliger Kleider, undurchlässiger Handschuhe, chirurgischer Maske, Gesichtsschutz, Haarhaube und Schuhüberzüge.
2. Vorbereitung des Tieres
HINWEIS: Cynomolgus-Makaken wurden für die Videodemonstration verwendet. Die Anatomie anderer nichtmenschlicher und menschlicher Primaten ist sehr ähnlich, und das Protokoll sollte auf andere Arten übertragbar sein.
- Injizieren Sie 15 Minuten vor dem Eingriff subkutan 0,05 mg/kg Atropin, um Speichlsekrete zu minimieren und die Verteilung und Retention des Infusats zu optimieren.
- Anästhesie mit 5 ml Spritzen mit intramuskulärem Ketamin/Midazolam (10-15 mg/kg Ketamin und 0,01-0,05 mg/kg Midazolam) bereitstellen. Bestätigen Sie die richtige Anästhesie, wenn das sedierte Tier bewusstlos wird und nicht in der Lage ist, auf Reize zu reagieren.
3. Durchführung des Verfahrens
- Verwenden Sie orale Retraktoren, um den offenen Mund zu stützen.
- Legen Sie das Gummipolster eines Endes des Retraktors auf den harten Gaumen hinter die oberen Zähne auf der Seite des Mundes gegenüber der Drüse, die infundiert wird. Legen Sie das Gummipad des anderen Endes auf den unteren Hund auf der gleichen Seite wie den oberen Retraktor. Lassen Sie die Federwirkung des Retraktors vorsichtig ausdehnen und den Mund öffnen.
- Identifizieren Sie die Ohrspeicheldrüsenpapille, die Öffnung des Stensen-Kanals, auf der hinteren Wange, neben dem oberen2. Backenzahn. Dies wird am besten mit Zahnschleifen zur Vergrößerung visualisiert.
- Erweitern Sie vorsichtig die Ohrspeicheldrüsenpapille mit der Spitze des konischen Dilatators. Es ist am besten, den Punkt des Dilatators in die Mitte oder Öffnung der Papille zu legen und dann vorsichtig hin und her zu drehen. Der Punkt sollte langsam in die Papille eindringen und sie über ca. 20 - 30 s sanftes Drehen erweitern.
- Führen Sie den PET10-Schlauch in die erweiterte Ohrspille ein. Dies wird am besten erreicht, indem das markierte Ende des PET10-Röhrchens mit einer Pinzette etwa 0,5 cm vom distalen Ende entfernt gehalten und die Spitze des Röhrchens vorsichtig in die erweiterte Papille eingefügt wird.
- Bewegen Sie das Rohr vorsichtig vor, was oft durch kleine Drehbewegungen erleichtert wird, um das Röhrengleiten zu unterstützen, gefolgt von einer Nachjustierung der Pinzette um 0,5 cm proximal zum vorherigen Griff. Wiederholen Sie dies, bis die 2-cm-Markierung die Ohrspeichelpapille erreicht.
- Tragen Sie Cyanacrylat auf die Wange um die Papille und den eingeführten Schlauch auf und warten Sie, bis es getrocknet ist (keine bestimmte Menge aufgezeichnet, gerade genug, um den Eingang der Stensen-Gangpapille zu versiegeln). Dies dauert in der Regel weniger als eine Minute und hilft, die Ohrspeicheldrüsenpapille zu versiegeln und das Verschütten von Infusat in der Mundhöhle zu reduzieren.
- Drücken Sie den Spritzeninhalt langsam über 5 min mit einer Geschwindigkeit von 100 μL/min. Diese langsame Infusionsrate minimiert das Risiko einer Gangverletzung aufgrund eines plötzlichen Anstiegs des intraduktalen Drucks.
- Lassen Sie PET10 mindestens 5 Minuten nach Abschluss der Infusion an Ort und Stelle. Halten Sie den Kanal verschlossen und lassen Sie das Infusat in der Ohrspeicheldrüse verbleiben.
- Pet10 mit sanfter Traktion entfernen. Das Cyanacrylat zieht mit dem Röhrchen frei.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.8 auf der gegenüberliegenden Seite.
- Lösen Sie langsam orale Retraktoren, nachdem beide Ohrspeicheldrüsen infundiert und beide PET10-Röhrchen entfernt wurden.
HINWEIS: Der gesamte Vorgang für beide Seiten sollte weniger als 30 Minuten dauern.
4. Nachsorge
- Nachdem die Infusion abgeschlossen und der Stensen-Gang dekantiert wurde, beobachten Sie die Tiere, bis die Anästhesiewirkung nachlässt (normalerweise zwischen 20-30 Minuten nach dem Eingriff).
- Bieten Sie dem Tier Getränke und dann Essen an, nachdem sie vollständig wach sind und die Routinepflege wieder aufnehmen.
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Ergebnisse
Erfolgreiches Verfahren, Transduktion und Transkription
Abbildung 1 zeigt die Ohrspeicheldrüsenpapille neben dem2. Backenzahn auf der hinteren oberen Wange. Das Bild zeigt auch die korrekte Platzierung der Mundorthese, ein Gummiende am harten Gaumen und das andere Gummiende am ipsilateralen Hund. Abbildung 2 zeigt ein Bild, das nach erfolgreicher Kanulation der Ohrspeicheldrüsenpapille an der 2-cm-Markierung auf dem PET10 aufgenomm...
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Diskussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll der retrograden Infusion in die Ohrspeicheldrüse durch Stensens Gang. Die beschriebene Methodik bietet eine Anleitung, die möglicherweise von Forschern verwendet werden kann, die den Nutzen von Speichelgewebe als Ort für Gentherapie und andere Anwendungen untersuchen.
Es gibt mehrere kritische Schritte, um den Erfolg des Verfahrens sicherzustellen. In erster Linie sollten alle Verfahrensschritte schonend abgeschlossen werden. Eine kräftige Versteifung des Mun...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Die Autoren danken Herrn Cagney Gentry für seine audiovisuelle Unterstützung bei den Dreharbeiten. Wir möchten auch das Hefner VA Medical Center für die akademische Unterstützung bei der Verfolgung dieses Projekts anerkennen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 500 & Mikro; L U100 Spritzen mit 30-Gauge-Nadeln | Becton Dickinson | 328466 | feste Nadel für weniger Abfall |
| Klebstoff (z. B. Ethicon Dermabond) | Verschiedene | Cyanacrylat-Klebstoffe zum Abdichten und Halten des Schlauchs im Kanal während der Infusion. | |
| Atropin injizierbare Lösung | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropin inj. 0,54 mg/mL |
| BD Ultrafeine Insulinspritzen 30G | Walmart | N/A | Erhältlich in den Größen 0,5 mL und 1,0 mL. |
| Cyanoacrylat (medizinischer Kleber) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topischer Hautkleber |
| Zahnschlaufen mit Licht | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Wird verwendet, um die Visualisierung der Stensen-Gangpapille |
| zu verbessern Säuglingstränendilatator | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamin-Injektionslösung | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/ml |
| Lacrimaler Dilatator | Surgipro | SPOI-132 | Wird verwendet, um den Stensen-Kanal zu dialatieren. |
| Midazolam injizierbare Lösung | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Paar Schere | Amazon (DDP) | N/A | Wird zum Schneiden von PET10-Röhrchen |
| Polyethylenschlauch (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Schlauch, der die 30G-Spritze verbindet und in den Kanal eingeführt wird. |
| Q-Tips | Walmart | N/A | Wird verwendet, um Cyanacrylat auf die Wange zu verteilen |
| Polyethylenrohr Größe 10 (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | Polyethylenschlauch niedriger Dichte |
| Maulöffner für kleine Tiere | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Wird verwendet, um das Maul des Tieres offen zu halten. |
| Pinzette | Amazon (DDP) | N/A | Wird verwendet, um ein PET10-Röhrchen in den Stenson-Kanal |
| Zinkchlorid | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | In Plasmid-DNA-Infusaten enthalten |
Referenzen
- Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
- Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
- Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
- Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4(2017).
- Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
- Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
- Niedzinski, E. J., et al. Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation. Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).
- Niedzinski, E. J., et al. Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection. Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).
- Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).
- Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).
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Nachdrucke und Genehmigungen
