Method Article

AAV-Einsatz von Enhancer-basierten Expressionskonstrukten in vivo im Gehirn von Mäusen

DOI:

10.3791/62650

⸱

March 31st, 2022

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1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt einen neuartigen rAAV-basierten transienten Enhancer-Reporter-Assay. Dieser Assay kann verwendet werden, um eine enhancergesteuerte Expression in vivo im Gehirn der Maus zu induzieren.

Abstract

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Enhancer sind Bindungsplattformen für eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren, die spezifische Expressionsmuster von gewebe- und zelltypspezifischen Genen steuern. Mehrere Methoden zur Beurteilung nicht-kodierender DNA und verschiedener Chromatinzustände haben sich bei der Vorhersage des Vorhandenseins von Enhancer-Sequenzen im Genom als nützlich erwiesen, aber die Validierung der Aktivität dieser Sequenzen und das Finden der Organe und Entwicklungsstadien, in denen sie aktiv sind, ist ein arbeitsintensiver Prozess. Jüngste Fortschritte bei Adeno-assoziierten Virusvektoren (AAV) haben die weit verbreitete Abgabe von Transgenen an Mausgewebe ermöglicht, was In-vivo-Enhancer-Tests ermöglicht, ohne dass ein transgenes Tier erforderlich ist. Dieses Protokoll zeigt, wie ein Reporterkonstrukt, das EGFP unter der Kontrolle eines minimalen Promotors exprimiert, der selbst keine signifikante Expression antreibt, verwendet werden kann, um die Aktivitätsmuster von Kandidaten-Enhancer-Sequenzen im Mausgehirn zu untersuchen. Ein AAV-verpacktes Reporterkonstrukt wird an das Mausgehirn abgegeben und für 1-4 Wochen inkubiert, danach wird das Tier geopfert und Gehirnabschnitte werden unter einem Mikroskop beobachtet. EGFP tritt in Zellen auf, in denen der getestete Enhancer ausreicht, um die Genexpression zu initiieren und den Ort und das Entwicklungsstadium zu bestimmen, in dem der Enhancer im Gehirn aktiv ist. Standard-Klonierungsmethoden, kostengünstige AAV-Verpackungen und expandierende AAV-Serotypen und Methoden für die In-vivo-Verabreichung und Standard-Bildgebungsauslesung machen dies zu einem zugänglichen Ansatz für die Untersuchung, wie die Genexpression im Gehirn reguliert wird.

Introduction

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Enhancer sind genomische cis-regulatorische Elemente, die als Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen dienen und die Expression eines Zielgens räumlich spezifisch vorantreiben können 1,2. Sie sind in verschiedenen Zelltypen, Geweben und Entwicklungsstadien unterschiedlich aktiv und können Substrate krankheitsrisikobedingter genomischer Variation sein 3,4. Daher ist die Notwendigkeit, die Dynamik der Enhancer-Funktion zu verstehen, entscheidend für den Fortschritt sowohl in translationalen als auch in grundlagenwissenschaftlichen Anwendungen innerhalb der Genomik. In-silico-Vorhersagen der Enhancer-Aktivität können als hervorragende Ressourcen für die Erstellung von Hypothesen über die Enhancer-Fähigkeitdienen 5,6. Eine solche vorhergesagte Enhancer-Aktivität kann eine zusätzliche Validierung und Abfrage erfordern, um die funktionelle Aktivität vollständig zu verstehen. Enhancer-Reporter-Assays haben sich für diesen Zweck in einer Vielzahl von Systemen als wertvoll erwiesen, von Zellen bis hin zu Tieren 7,8,9. Um diese Studien in einem flexiblen und kostengünstigen transienten In-vivo-Kontext zu erweitern, beschreibt dieses Protokoll die Verwendung von in vivo AAV-basierten Methoden, um mutmaßliche Enhancer-Sequenzen auf ihre Fähigkeit zu testen, die Expression eines ektopischen Reportergens im postnatalen Mausgehirn zu steuern. Diese Methodenfamilie eignet sich für die Abfrage einzelner Kandidatensequenzen oder das parallele Bibliotheksscreening und ist für die Grundlagen- und translationale Forschung relevant.

Diese Methode kombiniert in einem einzigen Plasmid eine mutmaßliche Enhancer-Kandidaten-DNA-Sequenz mit einem Reportergen (hier EGFP), unter der Kontrolle eines minimalen Promotors, der allein keine signifikante Expression antreibt. Das Plasmid wird in rekombinante AAV (rAAV) verpackt und in ein Tiermodell injiziert. Während die Anwendung hier auf das Gehirn gerichtet ist, ermöglichen verschiedene rAAV-Serotypen eine Infektion über verschiedene Gewebetypen hinweg, so dass dieser Ansatz auf andere Systeme ausgedehnt werden kann10. Nach einiger Zeit kann das Gehirn gesammelt und auf die Expression des Reportergens untersucht werden. Die starke Expression im Vergleich zu Kontrollen deutet darauf hin, dass die getestete Kandidatensequenz die Expression des Gens "verstärken" konnte (Abbildung 1). Dieses einfache Design bietet einen einfachen und klaren Ansatz, um eine Sequenz für die Enhancer-Aktivität in vivo im Gehirn zu testen.

Zusätzlich zum Testen der Enhancer-Fähigkeit einer Sequenz kann diese Methode mit Techniken zur Bestimmung der Zelltyp-Enhancer-Aktivität kombiniert werden. In sequenzbasierten Ansätzen zur Bestimmung der differentiellen Enhancer-Aktivität kann die Sortierung von Zellen nach zelltypspezifischen Markern vor der DNA- und RNA-Sequenzierung es Forschern ermöglichen, festzustellen, ob verschiedene Zelltypen differentielle Enhancer-Aktivität zeigen, wie in Gisselbrecht et al.11 beschrieben. In bildgebenden Ansätzen ermöglicht die Co-Markierung von Bildern mit zelltypspezifischen Markern die Untersuchung, ob Zellen mit Enhancer-getriebener Fluoreszenz auch Zelltypmarker von Interesse aufweisen 12,13,14,15,16. Enhancer-Reporter-Assays ermöglichen das direkte Testen der risikoassoziierten allelischen Variation von Enhancern auf Auswirkungen auf die Enhancer-Fähigkeit. Die überwiegende Mehrheit der in genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) identifizierten Risikoorte liegt in nicht-kodierenden Regionen des Genoms17. Funktionelle Annotationsstudien dieser Risikoorte deuten darauf hin, dass ein großer Teil wahrscheinlich als Verstärker wirkt18,19,20. Der MPRA-Einsatz in vivo kann es ermöglichen, diese risikoassoziierten Varianten auf Enhancer-Aktivität im Gehirnzu testen 12,21. Schließlich können Lieferung und Abholung zu unterschiedlichen Zeitpunkten Einblicke in die Entwicklungsphasen geben, in denen ein Enhancer aktiv ist.

Enhancer-Reporter-Plasmid-Designs sind vielfältig und können an experimentelle Ziele angepasst werden. Es gibt mehrere Optionen für minimale Promotoren, die in der Enhancer-Forschung verwendet wurden, wie der humane β-Globin-Minimalpromotor22 und der Maus-Hsp68-Minimalpromotor23. Es ist bekannt, dass diese Promotoren niedrige Expressionsniveaus antreiben, es sei denn, sie werden mit einem Enhancer-Element gekoppelt, um sie zu aktivieren. Im Gegensatz dazu treiben konstitutive Promotorelemente eine starke Expression des Transgens an, die für die Positivkontrolle oder zum Testen der Enhancer-Funktion vor dem Hintergrund einer robusten Expression nützlich ist. Übliche Optionen für konstitutive Promotoren sind CAG, ein Hybridpromotor, der aus dem Hühner-β-Aktin-Promotor und dem Cytomegalovirus-Immediate-Early Enhancer24 gewonnen wird, oder humanes EF1α25. Da bekannt ist, dass Enhancer bidirektional arbeiten26, sind die Ausrichtung und Position des Enhancers relativ zum minimalen Promotor flexibel (Abbildung 2A). Traditionelle Enhancer-Reporter-Assays platzieren den Enhancer vor dem Promotor und enthalten bei Bibliothekslieferungen eine Barcode-Sequenz stromabwärts des Reportergens, um Sequenzierungslesevorgänge mit dem getesteten Enhancer27 zu verknüpfen. Enhancer können aber auch im offenen Leserahmen des Reportergens platziert werden und als eigene Barcode-Sequenz dienen, wie es in STARR-seq28 der Fall ist. Das hier beschriebene Protokoll verwendet das STARR-seq-Assay-Design, wobei die Kandidaten-Enhancer-Sequenz in die 3'-UTR des Reportergens platziert wird. Während die STARR-seq-Orientierung den Vorteil einer schlankeren Klonierung bietet, ist sie weniger gut verstanden als der herkömmliche Ansatz und kann eine variable RNA-Stabilität zwischen Konstrukten induzieren. Die beschriebenen Methoden können leicht entweder an die STARR-seq oder die konventionelle Orientierung angepasst werden, mit geringfügigen Änderungen des Klonierungsprozesses, die an anderer Stelle27,29 beschrieben wurden.

Verschiedene Methoden der AAV-Verabreichung können verwendet werden, um diese Technik weiter an experimentelle Ziele anzupassen (Abbildung 2B). Direkte intrakranielle Injektionen, die in diesem Protokoll näher beschrieben werden, liefern eine hohe Viruskonzentration direkt an das Gehirn30. Dies ergibt eine hohe Transduktionseffizienz, die sich auf die Injektionsstelle konzentriert, was dies zu einer ausgezeichneten Technik für Experimente macht, die die Dichte transduzierter Zellen über einen Gewebebereich maximieren wollen. Stereotaktische Injektion kann dazu beitragen, die Injektionsstelle über Tiere hinweg zu standardisieren, um eine reproduzierbare lokalisierte Transduktion zu ermöglichen. Intrakranielle Injektionen sind bei frühen postnatalen Tieren am einfachsten. Als alternative Technik können systemische Injektionen Transgene unter Verwendung von AAVs mit Serotypen liefern, die in der Lage sind, die Blut-Hirn-Schrankezu überwinden 31. Schwanzveneninjektionen ermöglichen es dem Virus, im ganzen Körper zu zirkulieren, was eine generalisierte Abgabe über viele Gewebe hinweg ermöglicht10. Retroorbitale Injektionen sind eine weitere systemische Injektionstechnik, die das Virus hinter dem Auge in den retroorbitalen Sinus32 liefert. Dies bietet einen direkteren Weg für das AAV vom Venensystem zum Gehirn, was zu einer höheren Konzentration von transduzierten Zellen im Gehirn führt als Injektionen in peripherere Blutgefäße33.

Ein weiterer flexibler Aspekt dieser Technik ist die Methode des Auslesens. Im Großen und Ganzen können Optionen als reporterbasiert oder sequenzierungsbasiert beschrieben werden (Abbildung 2C). Die Integration eines fluoreszierenden Reporters wie GFP in den offenen Leserahmen des Konstrukts führt zur Expression des fluoreszierenden Proteins in allen transduzierten Zellen, in denen der Kandidatenverstärker die Expression antreibt. Markierungs- und Bildgebungsverfahren wie die Immunhistochemie ermöglichen die Signalverstärkung. Sequenzierungsbasierte Auslesetechniken beinhalten die Identifizierung von Sequenzen aus dem gelieferten Konstrukt in RNA, die aus dem Gewebe gesammelt wurde. Durch die Quantifizierung der Menge an viraler DNA, die ursprünglich abgegeben wurde, kann der Vergleich der exprimierten RNA mit der gelieferten DNA verwendet werden, um zu bestimmen, inwieweit eine getestete Enhancer-Sequenz in der Lage war, eine erhöhte Expression des Transgens zu bewirken, beispielsweise im Rahmen eines massively parallel reporter assay (MPRA). MPRAs bieten eine leistungsstarke Erweiterung dieser Techniken, um bis zu Tausende von Kandidaten-Enhancern gleichzeitig auf Aktivität zu testen und wurden in der Genomforschungausführlich beschrieben 12,27,34,35,36. Ein höheres Durchsatz-Screening wird durch die Ausführung von Klonierungs-, Verpackungs-, Liefer- und Sequenzierungsschritten für Kandidatenverstärker im Batch und nicht einzeln erreicht.

Die Auswahl von Kandidatenverstärkern bietet eine weitere Möglichkeit zur Flexibilität (Abbildung 2D). Mit diesem Assay können beispielsweise Enhancer eines bestimmten Gens identifiziert, die Funktion nicht-kodierender DNA-Regionen von Interesse ermittelt oder bestimmte Zelltypen oder Entwicklungsstadien bestimmt werden, in denen ein Enhancer aktiv ist - all dies dient Zielen sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der Krankheitsforschung. Im Allgemeinen wird die Auswahl von Kandidatenverstärkern durch In-silico-Vorhersagen der Enhancer-Aktivität bestimmt. Im Allgemeinen beinhalten In-silico-Vorhersagen ChIP-seq für Histonmodifikationen, die auf wahrscheinliche Enhancer hinweisen, wie H3K27ac37 und Chromatin-Zugänglichkeitskartierung38. Schließlich ist ein wachsendes Forschungsgebiet das funktionsbasierte Screening synthetisch gestalteter Enhancer-Elemente, das Studien darüber ermöglicht, wie die Enhancer-Sequenz die Funktion39 steuert, und das Design von Enhancern mit spezifischen Eigenschaften40.

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Protocol

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Dieses Protokoll wurde vom UC Davis Institutional Animal Care and Use Committee (Protokoll #22339) und dem UC Davis Institutional Biosafety Committee (BUA-R1903) genehmigt. Dieses Protokoll wurde an C57BL/6J-Mäusen beiderlei Geschlechts am postnatalen Tag 0-1 getestet.

1. Klonen Sie die Enhancer-Kandidatensequenz in das AAV-Vektorplasmid.

HINWEIS: Die repräsentativen Protokolle sind angegeben, aber die Klonstrategie hat ein hohes Maß an Flexibilität.

  1. Wählen Sie ein Reporterkonstrukt aus, oder entwerfen Sie es. Hier wird der Enhancer-Kandidat in die 3' untranslatierte Region (UTR) des EGFP-Reportergens eingefügt, die unter der Kontrolle des Hsp68-Minimalpromotors exprimiert wird.
    HINWEIS: Viele MPRA-Plasmidkonstrukte, die für diesen Assay geeignet sind, wurden auf Addgene41 abgeschieden und stehen für Forschungszwecke zur Verfügung.
  2. Entwerfen Sie PCR-Primer, um eine Sequenz von Interesse zu amplifizieren. Fügen Sie dem 5'-Ende der Primer den entsprechenden Homologiearm für die Gibson-Klonierung hinzu (~ 35 bp entsprechend der Sequenz 5' stromaufwärts der Einfügestelle, oberer Strang für den vorderen Primer und unterer Strang für den umgekehrten Primer).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Basisprimersequenz ~18-24 bp lang und ~50%-60% GC-Gehalt bei einer Schmelztemperatur von ca. 57-59 °C ist.
  3. Führen Sie eine PCR aus einer DNA-Probe mit den entwickelten Primern durch.
    1. Die PCR-Reaktionsmischung wird wie in Tabelle 1 beschrieben in 0,2-ml-PCR-Röhrchen zusammengebaut.
    2. Die PCR-Reaktionsmischung(en) werden auf einen Thermocycler gegeben und gemäß dem in Tabelle 1 genannten Programm zykliert.
    3. Bestätigen Sie den Erfolg der PCR, indem Sie 5 μL PCR-Produkt auf ein 0,7%-1% Agarosegel bei 100 V für 30-60 min laufen lassen. Suchen Sie nach dem Fragment der vorhergesagten Länge.
    4. Aufreinigung des PCR-Produkts mit einem kommerziellen Säuberungskit für enzymatische Reaktionsaufreinigung. Das letzte Eluat ist der Kloneinsatz.
  4. Führen Sie einen Restriktionsaufschluss durch, um den AAV-Vektor an der eindeutigen Klonstelle zu linearisieren, um den Enhancer in den Vektor einzufügen.
    1. Die Klonstelle in der 3' UTR des hier verwendeten Enhancer-Reporter-Konstrukts ist durch eindeutige PacI- und AscI-Restriktionsstellen begrenzt. Führen Sie einen Digest durch, um das Plasmid an dieser Stelle gemäß den folgenden Parametern zu linearisieren (Schritte 1.4.2-1.4.4).
    2. Verdauen Sie 1-10 μg Vektor-DNA mit PacI und AscI, je nachdem, wie viele Klonierungsreaktionen benötigt werden. Bereiten Sie die Reaktionen mit dem mitgelieferten Puffer gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
    3. Bei 37 °C für 1-2 h inkubieren, um die Vektor-DNA zu verdauen. (Wenn mehr als 5 μg in einer 50 μL-Reaktion verdaut werden, kann eine längere Inkubation erforderlich sein.)
    4. Nach 1-2 h Inkubation inaktivieren Sie das Enzym durch Inkubation bei 65 °C für 20 min.
    5. Die Restriktionsverdauungsfragmente werden durch Gelelektrophorese mit einem 0,7%-1% Agarosegel getrennt, das bei 100 V für 30-60 min laufen wird.
    6. Entfernen Sie das Band für den linearisierten Vektor und reinigen Sie es mit einem handelsüblichen Gelextraktionskit.
  5. Gibson-Klonreaktionen durchführen und transformieren
    1. Bestimmen Sie die Konzentration des gereinigten Vektors und des Kloneinsatzes mit einem Spektralphotometer.
      HINWEIS: DNA absorbiert Licht bei 260 nm, während Verunreinigungen Licht bei 230 nm und 280 nm absorbieren. Hohe Verhältnisse (>1,8) von 260/230 und 260/280 weisen auf hochgereinigte DNA hin.
    2. Zusammensetzen von Gibson-Klonierungsreaktionen in 0,2 mL PCR-Röhrchen: 5 μL 2x Gibson-Master-Mix, 0,02-0,5 pmol DNA-Fragmente im Verhältnis 3:1 Insert to Vector (optimale DNA-Konzentration für die Reaktion sollte empirisch bestimmt werden) und Nuklease-freies Wasser (das Volumen auf 10 μL erhöhen).
    3. Gibson-Reaktionen bei 50 °C für 20 min in einem Thermocycler inkubieren.
  6. Transform rekombinationsdefizient (recA-) kompetent Escherichia coli (E. coli).
    1. Stellen Sie ein Wasserbad auf 42 °C ein und tauen Sie die handelsüblichen kompetenten Zellen auf Eis auf.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann vor Schritt 1.4 durchgeführt werden, und die Zellen können während der Vorbereitung und Inkubation der Gibson-Reaktion auftauen.
    2. Aliquot 30-50 μL Zellen in 2,0 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 2 μL Gibson-Reaktion zu einem Aliquot hinzu und kennzeichnen Sie das Röhrchen mit der Identität des Gibson. Inkubieren Sie die Zellen auf Eis für 30 min.
      HINWEIS: Verwenden Sie 5-10 ng unverdauten leeren Vektor als Positivkontrolle und Wasser als Negativkontrolle.
    3. Die Zellen im 42 °C warmen Wasserbad für 30-45 s hitzeschocken, die Röhrchen sofort wieder auf Eis legen und 5 min erholen lassen.
    4. Während Sie auf Eis sind, fügen Sie 400-950 μL des handelsüblichen Wiederherstellungsmediums hinzu.
      HINWEIS: Die in diesen Experimenten verwendeten Erholungsmedien enthalten 2% pflanzlichen Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mMMgSO4 und 20 mM Glucose.
    5. Nach der Erholung auf Eis die Zellen vollständig wiederherstellen, indem Sie bei 37 °C mit sanftem Rühren von 250 U/min für 30-60 min inkubieren.
    6. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 x g für 5 min und entfernen Sie 400 μL des Überstands, wobei ~ 50 μL Bakterien auf der Platte bleiben.
    7. Auf selektiven Medien aufprügeln und bei 37 °C über Nacht inkubieren.
      HINWEIS: Die in diesen Experimenten verwendeten selektiven Medien enthalten 1,0% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1,0% Natriumchlorid, 1-2% Agar, 96-97% Wasser und Carbenicillin in einer Konzentration von 100 μg / ml. Verwenden Sie immer rekombinationsarme Bakterienstämme zum Klonieren viraler Plasmide, da die viralen invertierten terminalen Wiederholungen (ITRs) übereinstimmende Sequenzen aufweisen und eine homologe Rekombination durchlaufen können. RecA-Bakterienstämme durchlaufen jedoch noch eine geringe Rekombination. Das hier verwendete Reporterplasmid ist ein selbstkomplementäres AAV, bei dem die Sequenz eines der ITRs verändert wurde und nicht mehr perfekt mit dem anderen ITR übereinstimmt. Es wird auch empfohlen, die Bakterien bei 30 °C zu züchten, um die Rate der homologen Rekombination weiter zu verlangsamen.
  7. Verifizierung von Klonen und Wiederherstellung von Plasmiden.
    1. Bereiten Sie eine PCR-Mastermischung unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern (Table of Materials) vor, die zum Vektor glühen und die Insertposition flankieren. Aliquot 10 μL Volumen in 0,2 mL PCR-Streifenröhrchen.
    2. Bereiten Sie in 14-ml-Rundbodenröhrchen 5 ml aliquots antibiotikaselektiver LB-Brühe vor, eines für jede Kolonie, die mittels PCR und Negativkontrolle getestet wird.
    3. Verwenden Sie einen sterilen Zahnstocher oder eine Pipettenspitze, um eine einzelne Kolonie auszuwählen und die Kolonie grob in den Boden eines PCR-Röhrchens zu kratzen.
    4. Wenn sich die Kolonie in die PCR-Mastermischung aufgelöst hat, lassen Sie den Zahnstocher oder die Zahnspitze in eines der LB-Aliquots fallen und beschriften Sie das 14-ml-Röhrchen mit der Gibson-Reaktion und der PCR-Röhrchennummer.
    5. Legen Sie die Kolonie-PCR-Reaktionen auf einen Thermocycler und führen Sie den Zyklus mit dem in Tabelle 2 beschriebenen Programm durch.
    6. Die mit Zahnstochern oder Pipettenspitzen inokulierten 5-ml-Flüssigkulturen in einem auf 37 °C und 180 U/min eingestellten Schüttelbrutschrank inkubieren.
    7. Führen Sie die Kolonie-PCR-Reaktionen auf einem 0,7%-1% Agarosegel bei 100 V für 30-60 min durch und visualisieren Sie die Banden in einem Gel-Doc-Bildgebungssystem.
    8. Verwerfen Sie die 5-ml-Kulturen, die nicht die vorhergesagte PCR-Bande anzeigen.
    9. Lassen Sie für jeden erfolgreich integrierten Klon die 5-ml-Kulturen über Nacht wachsen und führen Sie dann eine Plasmid-Mini-Vorbereitung aus 4,5 ml mit einem kommerziellen Kit durch. 0,5 mL der Flüssigkultur reservieren und bei -80 °C als Glycerinvorrat speichern.
    10. Bestätigen Sie, dass die in den Plasmiden enthaltenen Transgene frei von unerwünschten Mutationen sind, indem Sie die Sanger-Sequenzierung42 verwenden.
    11. Nachdem bestätigt wurde, dass das Reporterkonstrukt erfolgreich geklont wurde, verwenden Sie den gespeicherten Glycerinvorrat, um eine 5-ml-Starterkultur zu impfen und 8-16 h in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C und 180 U/min zu wachsen.
    12. Sobald die Brühe trüb ist, verdünnen Sie die Starterkultur 1.000x in 250-300 ml frischer selektiver LB-Brühe und inkubieren Sie mindestens über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C und 180 U/min. Dann reinigen Sie das Plasmid mit einem handelsüblichen Plasmid-Maxi-Kit.
      HINWEIS: Bakterien wachsen bei 30 ° C langsamer als bei 37 ° C, aber dies ist die beste Temperatur, um die Rate der spontanen Rekombination beim Anbau großer Kulturen zu verlangsamen.
    13. Führen Sie einen XmaI-Digest durch, um die Rekombination der ITRs mit den Schritten 1.4.2-1.4.5 zu testen, wobei Sie XmaI anstelle von PacI und AscI ersetzen. Visualisieren Sie die Bänder auf einem Gel-Doc-Bildgebungssystem.
      HINWEIS: Ein rAAV-Plasmid, bei dem beide ITRs vorhanden sind, ergibt nach diesem Aufschluss zwei Banden auf einem Gel: eine die Länge des rAAV-Genoms und die andere die Länge des restlichen Plasmidrückgrats. Wenn es nur eine Bande gibt, dann haben die ITRs eine homologe Rekombination durchlaufen, und das rAAV-Plasmid wird nicht in der Lage sein, virale Partikel zu verpacken. Das hier beschriebene rAAV-Plasmid-Backbone ist so konzipiert, dass XmaI-Stellen nur in den ITRs vorkommen. Wenn das Enhancer-Kandidaten-Insert auch XmaI-Stellen enthält, aktualisieren Sie die vorhergesagten Bandenergebnisse und die Analyse entsprechend.

2. Besorgen Sie sich verpacktes rAAV.

  1. Verwenden Sie verpacktes rAAV (professionell oder intern) für die Experimente in dieser Studie.
    HINWEIS: Es gibt viele Optionen zum Verpacken eines rAAV. Ein rAAV kann professionell in einem Unternehmen oder einer universitären Kerneinrichtung verpackt werden. Das rAAV kann auch intern unter Verwendung verschiedener Techniken verpackt werden, die in Komplexität variieren und spezielle Ausrüstungerfordern 43,44. Das Hauptanliegen besteht darin, einen Vektor zu erhalten, der von hoher Qualität ist und dass der infektiöse Titer mit hoher Sicherheit bestimmt wurde. Sowohl professionell verpackte als auch intern verpackte rAAVs wurden für verschiedene in dieser Studie beschriebene Experimente verwendet.

3. Intrakranielle Injektion von rAAV-verpacktem Plasmid in neonatale Mäuse.

  1. Bereiten Sie die rAAV-Mischung für die Lieferung vor.
    1. Wenn die Absicht darin besteht, die Expressionsmuster zwischen verschiedenen Enhancer-Reporterviren zu vergleichen, gleichen Sie die Titer aller zu vergleichenden Viren aus, indem Sie alle verdünnen, um dem am wenigsten konzentrierten Virus zu entsprechen.
    2. Mischen Sie ein Verhältnis von 2: 1 oder 3: 1 von Enhancer-Reportervirus und konstitutiv exprimiertem Kontrollreportervirus und fügen Sie eine kleine Menge (0,06% Endkonzentration) Fast Green-Farbstoff hinzu.
      HINWEIS: Fast Green ist ein Farbstoff, der häufig in Injektionen von Versuchstieren, einschließlich AAV, verwendet wird, um die Injektionsstelle während und unmittelbar nach dem Eingriff zu visualisieren45,46,47,48. Obwohl dies ein wichtiger Schritt zur Qualitätssicherung ist, ist es möglich, dass die Zugabe von Farbstoff die Transduktion beeinträchtigen könnte. Die Verwendung von Injektionsfarbstoff zu überdenken, kann in bestimmten Fällen für die Protokolloptimierung wichtig sein. Das konstitutiv angetriebene Kontrollvirus ist absolut entscheidend für den Vergleich unabhängiger Injektionen. Virusinjektionen variieren in Ort und Ausmaß der Übertragung von Tier zu Tier. Die konstitutive Kontrolle wird es ermöglichen, fehlgeschlagene Injektionen von der Analyse auszuschließen und einen Standard für die Normalisierung der Variation in der Virusabgabe bereitzustellen.
    3. Brechen Sie die Spitze einer sterilen gezogenen Glaspipette aus einem μL-graduierten Kapillarrohr, indem Sie sie vorsichtig durch ein empfindliches Tuch stechen, das sterilisiert wird, indem Sie es in 70% Ethanol einweichen und vollständig trocknen lassen. Führen Sie dann die gezogene Glaspipette in die Absaugeinheit ein, die aus einer Vorrichtung zum Anlegen von Druck besteht, die mit einem 15 Zoll langen Gummischlauch verbunden ist, der mit einer Gummidichtung zur Aufnahme einer Mikrokapillarpipette endet.
      HINWEIS: Die "Vorrichtung zum Ausüben von Druck" kann eine Spritze oder ein Mundstück sein. Wenn eine Spritze verwendet werden soll, muss eine zweite Person Druck durch die Spritze ausüben, während der Experimentator die Pipette in der einen Hand und das Tier in der anderen Hand manipuliert. Bei Verwendung eines Mundstücks, das es dem Experimentator ermöglicht, sowohl die Positionen des Tieres und der Pipette als auch den Druck auf die Spritze genau zu kontrollieren, ist besondere Sorgfalt erforderlich, um eine Viruskontamination zu vermeiden.
    4. Legen Sie Unterdruck durch die Absaugeinheit an, um ein kleines Volumen (~ 0,2-0,5 μL) Mineralöl in die Glaspipette zu ziehen.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist sehr wichtig, um eine Barriere bereitzustellen, die verhindert, dass aerosolisierte Viruspartikel die Absaugeinheit kontaminieren.
    5. Stellen Sie die vorbereitete Absaugeinheit beiseite und halten Sie das Virus auf Eis, bis es zur Injektion bereit ist.
  2. Kryo-Betäubung der neonatalen Mäuse in einer trockenen Plastikschale, die teilweise in Eis getaucht ist, bis der Pedalentzugsreflex aufhört (~ 5 min). Stellen Sie sicher, dass die Mäuse nicht in direktem Kontakt mit dem Eis stehen.
  3. Verwenden Sie Unterdruck durch die Absaugeinheit, um das Virusgemisch in die gezogene Glaspipette zu ziehen, bis der Meniskus die 2-μL-Häkungsmarke passiert.
  4. Nehmen Sie die Maus aus der Kältekammer und positionieren Sie sie auf dem Tisch. Lokalisieren Sie die bilateralen Injektionsstellen auf halbem Weg zwischen Lambda und Bregma und auf halbem Weg zwischen der sagittalen Naht und jedem Auge. Desinfizieren Sie beide Bereiche mit einem Alkoholtuch.
  5. Verwenden Sie die gezogene Glaspipette, um den Schädel der neonatalen Mäuse zu durchbohren und sanft positiven Druck durch die Absaugeinheit auszuüben, wenn die Nadel in das Gehirn eindringt. Beobachten Sie den Meniskus der Virusmischung. Der Widerstand gegen den ausgeübten Druck nimmt ab, wenn die Spitze der Pipette den lateralen Ventrikel erreicht. Geben Sie 1 μL des Virus ab, ziehen Sie die Pipette heraus und wiederholen Sie den Vorgang für den anderen lateralen Ventrikel.
  6. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen oder eine Wärmekammer, um sich zu erholen. Sobald Sie wach und aktiv sind, bringen Sie das Tier in seinen Heimatkäfig zurück.

4. Sammeln Sie Gewebe und führen Sie Immunhistochemie durch.

  1. Nach ausreichender Zeit nach der Virustransduktion die Mäuse betäuben und durch transkardiale Perfusion opfern.
    HINWEIS: Viele Experimente, einschließlich der hier gezeigten repräsentativen Ergebnisse, erlauben einen Zeitraum von 4 Wochen oder länger, bis das Virus transduziert werden kann. Selbstkomplementäre AAVs können jedoch bereits nach 7 Tagen12 eine starke Expression zeigen. Die gewünschte Inkubationszeit muss möglicherweise in Abhängigkeit von spezifischen experimentellen Techniken und Zielen optimiert werden.
    1. Bereiten Sie eine Schlauchpumpe mit intravenösem Infusionsschlauch und einer 25-G-Nadel vor.
    2. 1x PBS und 4% Paraformaldehyd (PFA) zubereiten und auf Eis legen.
    3. Legen Sie das Ansaugende des Schlauches in das eiskalte 1x PBS. Stellen Sie die Durchflussrate ein (2,5 ml/min für P7-Mäuse, 3,5 ml/min für P28-Mäuse) und lassen Sie die Pumpe laufen, bis der Puffer vollständig durch den Schlauch gezogen und von Blasen befreit ist. Legen Sie die Nadel beiseite, bis sie für die Durchblutung bereit ist.
    4. Pipettieren Sie in einem Abzug eine kleine Menge Isofluran auf ein Papiertuch im Boden einer Fallgefäßkammer. Legen Sie die zuvor injizierte Maus auf einen Rost über dem Papiertuch und stellen Sie sicher, dass sie nicht in direkten Kontakt mit dem Isofluran kommt. Verschließen Sie die Kammer, um die Maus zu betäuben. Warten Sie ~5 min und öffnen Sie dann die Kammer und prüfen Sie auf einen Pedalrückzugsreflex. Fahren Sie fort, sobald das Tier bewusstlos ist.
      HINWEIS: Während der gesamten Durchblutung sollte die Maus mit einem Nasenkegel auf Isofluran gehalten werden, um eine Wiedererlangung des Bewusstseins zu verhindern.
    5. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um den Bauch und die Brust der Maus zu öffnen, den Brustkorb zu entfernen und das Herz freizulegen.
    6. Verwenden Sie eine Iris-Mikroschere, um einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof der Maus zu machen, führen Sie die IV-Nadel in den linken Ventrikel ein und aktivieren Sie die Peristaltikpumpe.
    7. Durchbluten Sie das Tier mit eiskaltem 1x PBS, bis das aus dem Schnitt im rechten Vorhof ausgespülte Blut klar ist. Die Reinigung des Blutgewebes ist sehr wichtig, da rote Blutkörperchen Autofluoreszenz haben und Blutgefäße die Fähigkeit beeinträchtigen können, Reporter-exprimierende Zellen abzubilden.
    8. Pausieren Sie die Schlauchpumpe und bewegen Sie den Ansaugschlauch vom PBS auf die 4% PFA. Reaktivieren Sie die Pumpe und perfusionieren Sie 1 ml / g Körpergewicht, ~ 25 ml für eine erwachsene Maus.
      HINWEIS: Fixationstremoren sollten beobachtbar sein und der Körper der Maus sollte sich versteifen.
  2. Sezieren und reparieren Sie das Gehirn.
    1. Entfernen Sie den Kopf der Maus mit einer chirurgischen Schere.
    2. Beginnen Sie mit einer kleinen chirurgischen Schere an der Schädelbasis und machen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie des Kopfes und ziehen Sie die Haut und das darunter liegende Gewebe zurück, um den Schädel freizulegen.
    3. Schneiden Sie mit der Irisschere vorsichtig die Rückseite des Schädels ab, beginnend am Foramen magnum und weiter in Richtung und entlang der sagittalen Naht, bis die Riechkolben passiert sind.
    4. Führen Sie die Schere in den Schädel über den Riechkolben ein und machen Sie zwei horizontale Schnitte in den Schädel. Machen Sie ein ähnliches Paar horizontaler Schnitte im Hinterhauptsknochen. Die horizontalen und mittleren Schnitte erzeugen ein Paar türartige Klappen in der Oberseite des Schädels.
    5. Ziehen Sie die Schädellappen zurück, um das Gehirn vollständig freizulegen. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Riechkolben vom Schädel zu trennen und die Hirnnerven zu schneiden, wodurch das Gehirn vom Schädel befreit wird.
    6. Lassen Sie das Gehirn in eine 15 ml konische Röhre mit 3-5 ml 4% PFA in PBS fallen. Post-Fix 6 h bis über Nacht. Überfixieren Sie das Gewebe nicht.
  3. Bereiten Sie das Gehirn auf die Kryosektion vor.
    1. Übertragen Sie das fixierte Gehirn in eine neue 15 ml konische Röhre mit 12-14 ml 30% Saccharose in PBS zur Dehydratisierung. Bei 4 °C inkubieren, bis das Gehirn auf den Boden der Röhre sinkt (2-3 Tage).
    2. Tauchen Sie das feste und dehydrierte Gehirn in eine optimale Schnitttemperatur (OCT) in eine 15 mm x 15 mm x 5 mm große Kryoform. Fügen Sie OCT hinzu, bis das Gehirn vollständig bedeckt ist.
    3. Kryomold auf einen Trockeneisblock legen und die Probe in einem festen OCT-Block einfrieren (~ 5 min).
      HINWEIS: OCT-Blöcke können monate- bis jahrelang bei -80 °C gelagert werden.
    4. Beschriften Sie das Kryomold mit dem Probennamen und der Ausrichtung des Gehirns.
  4. Erhalten Sie koronale Schnitte mit einem Kryostat-Mikrotom.
    1. Markieren Sie die Ausrichtung des Gehirns auf dem OCT-Block mit Bleistift und entfernen Sie den Block aus dem Kryofell im Kryostaten.
    2. Positionieren Sie den OCT-Block so, dass das Gehirn mit den Riechkolben ausgerichtet ist, die der Klinge des Kryostaten zugewandt sind, und kleben Sie den Block mit etwas frischem OCT am Objekthalter des Kryostaten.
    3. Nach dem Einfrieren beginnen Sie mit dem Schneiden von 50 μm-Abschnitten durch den Block gemäß den Schritten 4.4.4-4.4.6.
    4. Verwenden Sie nicht die Stabilisatorplatte. Die Abschnitte rollen sich beim Schneiden zu engen Rollen zusammen und sammeln sich entweder auf dem Block oder fallen in eine Auffangschale.
    5. Beobachten Sie die Form des Blocks in den ersten Schnitten, die gemacht werden. Machen Sie vertikale Schnitte durch den Block und erzeugen Sie eine gleichmäßige Fläche, wenn Sie mit dem Schneiden beginnen. Passen Sie den Winkel bei Bedarf mit den Probeneinstellarmen an.
    6. Wenn die Riechkolben sichtbar sind, achten Sie genau auf die Form der Abschnitte. Wenn einer größer erscheint als der andere, sind die Schnitte in einem Winkel relativ zum Gehirn, und es ist notwendig, die Ausrichtung des Gehirns gegen die Klinge mit den Probeneinstellarmen zu begradigen.
      HINWEIS: Wenn Sie gerade schneiden, sollte der Kortex gleichzeitig über jedem Riechkolben erscheinen.
    7. Sobald der Riechkolben geschnitten wurde und rostrales Hirngewebe sichtbar ist, reduzieren Sie die Schnittdicke auf 30-35 μm und beginnen Sie, die schwimmenden Abschnitte zu sammeln. Führen Sie die Schritte 4.4.8-4.4.13 aus, um das Gehirn zu schneiden.
    8. Bürsten Sie alle vorherigen Abschnitte vom Block und Objekthalter ab, so dass sie in die Auffangschale fallen. Bürsten Sie sie auf einer Seite des Fachs ab und halten Sie sie getrennt. Wenn der Stapel zu groß ist, leeren Sie das Fach.
    9. Geben Sie 1 ml PBS in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Beschriften Sie 1 Zeile für jedes Gehirn.
    10. Schneiden Sie 6 koronale Abschnitte. Holen Sie die Abschnitte mit einer kalten Pinzette und ordnen Sie sie auf der Kryostatbühne an. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 oder 3 Mal, wobei die Gruppen von 6 Abschnitten getrennt bleiben.
    11. Befeuchten Sie einen Pinsel der Größe 000 mit PBS und tupfen Sie überschüssige Flüssigkeit auf einem fusselfreien Taschentuch oder Papiertuch ab. Verwenden Sie den Pinsel, um jeden Abschnitt vorsichtig einzeln aufzunehmen und in die entsprechenden Vertiefungen der 24-Well-Platte zu legen.
    12. Legen Sie einen der 6 Abschnitte aus der Gruppe der Scheiben in jede der 6 Vertiefungen in einer Reihe der 24 Vertiefungsplatten. Dies stellt sicher, dass jeder Brunnen repräsentative Abschnitte enthält, die den geschnittenen Bereich des Gehirns überspannen.
    13. Fahren Sie mit der Sektion in Gruppen von 6 Personen fort, bis das kaudale Ende der Großhirnrinde geschnitten ist.
    14. Zur Lagerung die 24-Well-Platte mit Parafilm verschließen und bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Die Abschnitte sind 1-2 Monate bei 4 °C stabil. Eine PBS-Lösung mit 0,1% Natriumazid kann verwendet werden, um das Bakterienwachstum zu hemmen und die Haltbarkeit der Abschnitte zu verlängern. Wenn die Abschnitte jedoch länger als 2 Monate gelagert werden sollen, sollten sie in Kryoschutzlösung gelegt und bei -20 °C eingefroren werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
  5. Führen Sie Immunhistochemie zur Signalverstärkung von Reportergen durch.
    HINWEIS: Alle Schritte außer der Antigengewinnung sollten mit sanftem bis mäßigem Rühren (~ 100 U/min) auf einem Orbitalschüttler durchgeführt werden. Um die native Fluoreszenz des Kontrollreporters (mRuby3) zu erhalten, sollten alle Schritte so gut wie möglich vor Licht geschützt werden.
    1. Bereiten Sie die erforderlichen Puffer wie in Tabelle 3 beschrieben vor.
    2. Bereiten Sie eine neue 24-Well-Platte mit einer Reihe für jedes gefärbte Gehirn vor. Fügen Sie in der ersten Spalte der Vertiefungen 1 ml PBS zu jedem Bohrloch hinzu.
    3. Übertragen Sie mit einem Pinsel der Größe 000 vorsichtig 1 Vertiefung von Abschnitten aus der ursprünglichen Sammlungsmulde in die frische PBS in der neuen 24-Well-Platte, um eine schnelle Spülung durchzuführen, um die restliche OCT-Verbindung zu entfernen.
    4. Geben Sie 1 ml ARB in die nächste Vertiefung in der 24-Well-Platte und Transferabschnitte in diese Well. In einem Ofen bei 60 °C für 1 h bebrüten.
    5. Lassen Sie die Platte 20 min bei Raumtemperatur (RT) abkühlen.
    6. Geben Sie 1 ml PB in die nächste Vertiefung und übertragen Sie die Abschnitte in diese Vertiefung. Inkubieren bei RT für 20 min.
    7. Geben Sie 500 μL BB in die nächste Vertiefung und geben Sie die Abschnitte in diese Vertiefung. Inkubieren bei RT für 1 h.
    8. Fügen Sie 2 ml WB zum BB hinzu und pipetten Sie dann ~ 2 ml Lösung heraus und verwerfen Sie, wobei eine verdünnte BB-Lösung in der Vertiefung verbleibt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Abschnitte deutlich sichtbar sind.
    9. Verdünnen Sie den primären Antikörper (Chicken IgY Anti-GFP, 1:1000) in BB. Geben Sie 350-500 μL primäre Antikörperlösung in die nächste Vertiefung und übertragen Sie die Abschnitte in diese Vertiefung. Die Platte mit Parafilm verschließen und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    10. Verdünnen Sie BB wie zuvor mit WB, bis die Abschnitte deutlich sichtbar sind.
    11. Geben Sie 1 ml WB in die nächste Vertiefung und übertragen Sie die Abschnitte in diese Vertiefung. Inkubieren bei RT für 20 min.
    12. Entfernen Sie ~ 800-900 μL Puffer und verwerfen Sie. 1 ml frisches WB hinzufügen und 20 min inkubieren. Ersetzen Sie 1 ml WB 4 weitere Male für insgesamt 5 Wäschen à 20 Minuten.
    13. Verdünnen Sie den sekundären Antikörper (Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 konjugiert, 1:500) in BB. Geben Sie 350-500 μL der sekundären Antikörperlösung in eine neue Vertiefung. Inkubieren bei RT für 45 min bis 1 h.
      HINWEIS: Dies ist die siebte Vertiefung, wenn also Abschnitte von mehr als 2 Gehirnen gefärbt werden, wird an dieser Stelle eine neue Platte benötigt.
    14. Verdünnen Sie BB wie zuvor mit WB und geben Sie die Abschnitte in eine neue Vertiefung, die mit 1 ml WB gefüllt ist. Waschen Sie die Abschnitte wie zuvor für 20 min 3 mal.
    15. Bereiten Sie eine Arbeitslösung von DAPI in PBS (Endkonzentration 0,04-0,8 μg/ml) vor. Lösung vor Licht schützen.
    16. Geben Sie 1 ml DAPI-Lösung in die nächste Vertiefung und übertragen Sie die Abschnitte in diese Vertiefung. Inkubieren bei RT für ~5 min.
    17. Übertragen Sie die Schnitte zurück zu WB und montieren Sie sie vorsichtig mit einem Pinsel der Größe 000 auf Objektträger. Lassen Sie die Objektträger an der Luft trocknen.
    18. Deckgläser mit einem geeigneten Montagemedium auftragen. Lassen Sie Dias bei RT im Dunkeln über Nacht aushärten.

5. Bilder und analysieren Sie Hirngewebeschnitte für die Enhancer-Aktivität.

  1. Verwenden Sie ein Objektiv mit geringer Vergrößerung (5x), um Fluoreszenzbilder aufzunehmen, die sich über den Gehirnabschnitt erstrecken.
  2. Lokalisieren Sie die Injektionsstelle und bewerten Sie das Ausmaß der Virustransduktion basierend auf der Dichte und Intensität der rot fluoreszierenden Zellen. Achten Sie darauf, Tiere zu vergleichen, die ähnlich übertragen wurden.
  3. Nehmen Sie bei Bedarf detaillierte fluoreszierende Bilder mit einem Objektiv mit höherer Vergrößerung (≥25x) auf.
    HINWEIS: Achten Sie immer darauf, die gleichen Einstellungen für Erfassungsparameter wie Anregungslichtintensität, Filter und Belichtungszeit zwischen den zu vergleichenden Proben zu verwenden.
  4. Verarbeiten Sie die Bilder mit einer Bildanalysesoftware.
    HINWEIS: Die Verarbeitung kann in jedem Bildanalyse-Softwarepaket erfolgen. Die folgenden Schritte sind Vorschläge zum Bestimmen, ob eine Sequenz als Enhancer im Reporterkonstruktkontext fungiert (eine Ja- oder Nein-Frage) mithilfe der Open-Source-FIJI-Distribution von ImageJ. Eine tiefergehende Photometrie kann beim Vergleich von Aktivitätsgraden zwischen Enhancer-Varianten angebracht sein. Bilder aus verschiedenen Proben sollten immer konsistent verarbeitet werden, um verglichen zu werden.
    1. Wenden Sie Filter an, um Rauschen zu reduzieren. Wählen Sie in Fidschi die Option Flecken entfernen im Menü Verarbeitung > Rauschen .
      HINWEIS: Dies ist ein 3 x 3 Medianfilter.
    2. Subtrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenz gemäß den Schritten 5.4.3-5.4.6.
    3. Trennen Sie die Kanäle eines Mehrkanalbildes. Wählen Sie in Fidschi im Menü Bild > Farbe die Option Kanäle teilen.
    4. Verwenden Sie das Rechteck- oder Kreisauswahlwerkzeug, um eine kleine Form in einem Bereich des Bildes zu zeichnen, der keine fluoreszierenden Zellen aufweist, und messen Sie die durchschnittliche Pixelintensität des Hintergrunds mit "Analysieren > Messen". Wiederholen Sie diesen Vorgang, um mehrere Bereiche zu testen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass im Menü "Analysieren > Messungen festlegen" die Option "Mittlerer Grauwert" ausgewählt ist.
    5. Mittelwert des mittleren Grauwerts aus 5-8 Hintergrundbereichen, und lassen Sie das Dezimalzeichen weg. Subtrahieren Sie diesen Wert von jedem Pixel im Bild mit Prozess > Mathematik > Subtrahieren.
      HINWEIS: Eine Rundung auf die nächste ganze Zahl könnte den zu subtrahierenden Hintergrund überschätzen. Es ist konservativer, das Komma einfach wegzulassen. Zum Beispiel würde 6,4 auf 6 abgerundet werden, aber 6,5 sollte auch auf 6 abgerundet werden, um das Risiko zu vermeiden, 0,5 Einheiten des realen Signals von jedem Pixel abzuziehen.
    6. Falls gewünscht, führen Sie die Kanäle wieder zu einem Mehrkanalbild zusammen. Verwenden Sie in Fidschi Bild- > Farb- > Kanäle zusammenführen.
    7. Fügen Sie alle überlappenden Bilder zusammen. Verwenden Sie in Fidschi Plugins > Stitching > Grid/Collection Stitching.
    8. Passen Sie Helligkeit und Kontrast an. Verwenden Sie in Fidschi Image > Adjust > Brightness/Contrast.
      HINWEIS: Verwenden Sie für jedes zu vergleichende Bild immer die gleichen Mindest- und Maximalwerte.
    9. Zählen Sie die Anzahl der grün fluoreszierenden Zellen gemäß den Schritten 5.4.10-5.4.12. Dies sind die Zellen, in denen die Kandidaten-Enhancer-Sequenz die Reporterexpression steuern konnte.
    10. Beginnen Sie damit, den grünen Kanal auszublenden, und verwenden Sie das Freiform-Auswahlwerkzeug, um eine Form um die Region des Gehirns zu zeichnen, die rote Fluoreszenz ausdrückt. Messen Sie mit der Measure-Funktion in Fidschi die Fläche, die integrierte Dichte und den mittleren Grauwert des roten Kanals in dieser Zone.
    11. Zählen Sie mit dem Mehrpunktauswahlwerkzeug die Anzahl der grünen Zellen in dieser Zone.
    12. Normalisieren Sie die Anzahl der grünen Zellen durch die integrierte Dichte des roten Kanals. Die lokale Rotkanalhelligkeit ist ein Proxy-Maß für das Ausmaß der Virusexposition und ermöglicht den Vergleich der Enhancer-Aktivität zwischen verschiedenen transduzierten Tieren.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mit diesen Methoden wurde eine 915 bp-Sequenz im psychiatrischen risikoassoziierten dritten Intron des Gens CACNA1C19,49,50 auf Enhancer-Aktivität im postnatalen Mausgehirn getestet. Diese Sequenz wurde in einer MPRA von 345 Kandidaten-Enhancer-Sequenzen entdeckt, die sich auf psychiatrische und neurologische Risiko-SNPs12 konzentrieren, und Charakterisierungsexperimente werden hier als allgemein...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine rAAV-basierte Methode für den Einsatz von Enhancer-getriebenen Transgenen im postnatalen Mausgehirn. In diesem verallgemeinerten Protokoll werden ein Kandidatenverstärker, ein minimaler Promotor, ein Reportergen und eine optionale Barcode-Sequenz in ein AAV-Plasmid-Rückgrat kloniert. Diese Experimente können mit einer einzelnen Kandidaten-Enhancer-Sequenz oder mit vielen parallelen Sequenzen durchgeführt werden. Das Plasmid wird in ein rAAV verpackt und an das postnatale Mausgehirn abgege...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Sequenzierung wurde am UC Davis DNA Technologies Core durchgeführt. Wir danken dem Labor von Lin Tian an der UC Davis für die Schulung zu rAAV-Verpackungen und die großzügige Schenkung von AAV-Helfer- und Rep/Cap-Plasmiden. Diese Arbeit wurde von NIH/NIGMS R35GM119831 unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x Citrat BufferSigma-AldrichC9999-1000ML
5'-gatcactcggcatggac-3'IntegratedDNATechnologies N/A: Speziell entwickelterForward Primer zur Verifizierung von Klonen nach der Transformation. Diese Primer sind spezifisch für den verwendeten Vektor und wurden für den spezifischen Vektor entwickelt, der in unseren Experimenten verwendet wurde.
5'-gatggctggcaactagaagg-3'IntegratedDNATechnologies N/A: Speziell entwickelterReverse-Primer zur Verifizierung von Klonen nach der Transformation. Diese Primer sind spezifisch für den verwendeten Vektor und wurden für den spezifischen Vektor entwickelt, der in unseren Experimenten verwendet wurde.
AgaroseVWRVWRVN605-500G
Aspirator-SchlauchbaugruppenSigma-AldrichA5177-5EAfür die mundgesteuerte Abgabe von rAAV
Bakteriologische PetrischalenThermo Fisher Scientific08-757-100D
CarbenicillinSigma-AldrichC1389-5G
Chicken IgY Anti-GFPThermo Fisher ScientificA10262
KonfokalmikroskopZeissLSM900Die Bilder wurden mit dem Modell LSM800 aufgenommen, aber Zeiss hat in den letzten Jahren das Modell LSM900 auf den Markt gebracht, um das LSM800 zu ersetzen.
Konische Zentrifugenröhrchen 15 mLThermo Fisher Scientific12-565-269
KryoformenThermo Fisher ScientificNC9806558Diese Formen sind für P28 Mäusegehirn geeignet. Andere Größen können für größere oder kleinere Gewebe besser geeignet sein.
DAPISigma-AldrichD9542-10MG
Präparierschere, 4,5"VWR82027-578
Esel Anti-Huhn AlexaFlour-488Jackson ImmunoResearch703-545-155
Dulbecco's PBS 1xThermo Fisher ScientificMT21031CV
Eppendorf Mikrozentrifugenröhrchen 2,0 mLThermo Fisher Scientific
Falcon Röhrchen mit rundem Boden 14 mLThermo Fisher Scientific352059
Fast Green FarbstoffGraingerF0099-1G
Pinselset mit feinen DetailsArtbrush TowerB014GWCLFO
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S
Kapillarröhrchen aus GlasDrummond Scientific Company5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi KitQIAGEN12663Kommerzielles Plasmid Maxi-Vorbereitungsset
HyClone HyPure Molekularbiologie WasserVWRSH30538.03
IV Schmetterlingsinfusionsset mit 12" Schlauch und 25G NadelThermo Fisher Scientific26708
KimwipesKimberly Clark34155Fusselfreies Tuch
LB AgarThermo Fisher ScientificBP1425-500LB Agar-Vormischung für selektive Medien
McPherson Vannas IrisschereIntegra LifeSciences360-215
MineralölSigma Life Science69794-500ML
NEB Stabil Kompetent E. coliNEBC3040I
NucleoSpin Gel und PCR Clean-UpTakara740609.5Kit für enzymatische Reaktionen Reinigung und Gelextraktion
OCT-MediumVWR25608-930
OrbitalschüttlerCole Parmer60-100
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127-500G
PCR-Streifenröhrchen 0,2 mLVWR490003-692
Peristaltische PumpeGilsonF155005
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 10xThermo Fisher Scientific70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA-PolymeraseThermo Fisher ScientificF549L
MilchpulverSunny Select
ProLong Gold Antifading EindeckmittelThermo Fisher ScientificP36934
QIAquick PCR-AufreinigungskitQIAGEN28106
rCutSmart PufferNEBB6004SPuffer für den Restriktionsverdau mit PacI-, AscI- und XmaI-Restriktionsenzymen
: AscINEBR0558L
Restriktionsenzym: PacINEBR0547L
Restriktionsenzym: XmaINEBR0180L
SOC-AuswuchsmediumNEBB0920SRückgewinnungsmedium nach Transformation
Saccharose ( RNase/DNase frei)Millipore Sigma033522.5KG
TAE-PufferApex20-194
TransferschlauchGilsonF1179941Für Peristaltikpumpe
Triton X100Sigma-AldrichX100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA-AufreinigungssystemThermo Fisher ScientificA1460Plasmid Mini-Vorbereitungskit
22431048

References

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