Makrophagendifferenzierung und Polarisation in einen M2-ähnlichen Phänotyp unter Verwendung einer humanen Monozyten-ähnlichen THP-1-Leukämie-Zelllinie

Zusammenfassung

M2-ähnliche tumorassoziierte Makrophagen (TAM) sind mit Tumorprogression und schlechter Prognose bei Krebs assoziiert. Dieses Protokoll dient als detaillierte Anleitung, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen innerhalb von 14 Tagen reproduzierbar in M2-ähnliche Makrophagen zu differenzieren und zu polarisieren. Dieses Modell ist die Grundlage, um die entzündungshemmende Wirkung von TAM in der Tumormikroumgebung zu untersuchen.

Zusammenfassung

Tumorassoziierte Makrophagen (TAM) können ihre Expression und ihr Zytokinprofil entsprechend äußerer Reize umschalten. Diese bemerkenswerte Plastizität ermöglicht es TAM, sich an laufende Veränderungen in der Mikroumgebung des Tumors anzupassen. Makrophagen können entweder primär entzündungsfördernd (M1-ähnlich) oder entzündungshemmend (M2-ähnlich) Eigenschaften aufweisen und können kontinuierlich zwischen diesen beiden Hauptzuständen wechseln. M2-ähnliche Makrophagen innerhalb der Tumorumgebung sind mit Krebsprogression und schlechter Prognose bei verschiedenen Krebsarten verbunden. Viele verschiedene Methoden zur Induktion der Differenzierung und Polarisation von THP-1-Zellen werden verwendet, um zelluläre und interzelluläre Mechanismen und die Auswirkungen von TAM in der Mikroumgebung von Tumoren zu untersuchen. Derzeit gibt es kein etabliertes Modell für die M2-ähnliche Makrophagenpolarisation mit der THP-1-Zelllinie, und die Ergebnisse von Expressions- und Zytokinprofilen von Makrophagen aufgrund bestimmter In-vitro-Reize variieren zwischen den Studien. Dieses Protokoll dient als detaillierte Anleitung, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen in M0-Makrophagen zu differenzieren und Zellen innerhalb von 14 Tagen weiter in einen M2-ähnlichen Phänotyp zu polarisieren. Wir zeigen die morphologischen Veränderungen von THP-1-Monozyten-ähnlichen Zellen, differenzierten Makrophagen und polarisierten M2-ähnlichen Makrophagen mittels Lichtmikroskopie. Dieses Modell ist die Grundlage für Zelllinienmodelle, die die entzündungshemmende Wirkung von TAM und deren Wechselwirkungen mit anderen Zellpopulationen der Tumormikroumgebung untersuchen.

Einleitung

Tumorassoziierte Makrophagen (TAM) und ihre Rolle bei chronischen Entzündungen, dem Auftreten von Krebs und der Tumorentwicklung sind wichtige Ziele in der neueren Forschung^1,2. Periphere Blutmonozyten, die in die Gewebemikroumgebung des sich entwickelnden Tumors rekrutiert werden, differenzieren sich zu Makrophagen und können in zwei Hauptsubtypen von Makrophagen polarisiert werden³. Der klassisch aktivierte Makrophage stellt den primär entzündungsfördernden M1-ähnlichen Phänotyp dar und der alternativ aktivierte M2-ähnliche Subtyp zeigt überwiegend entzündungshemmende Eigenschaften^4. Makrophagen können dynamisch zwischen diesen beiden Hauptphänotypen wechseln, abhängig von ihrem Zellstoffwechsel, wobei intermediäre Subtypen sowohl entzündliche als auch entzündungshemmende Eigenschaften^{aufweisen 5}. TAM stellt eine heterogene Population beider Phänotypen dar. Eine tumorfördernde Funktion und schlechte Prognose bei verschiedenen Krebsarten ist jedoch besonders mit M2-ähnlichen Makrophagen verbunden^6,7,8.

Die funktionellen Profile von Makrophagen und ihre Interaktion mit anderen Zellen innerhalb der Tumormikroumgebung sind komplex und schwierig in einer sich ständig verändernden Umgebung während der laufenden Tumorentwicklung zu erfassen. Zelllinien können eine homogene Zellpopulation mit stabiler Lebensfähigkeit in Kultur bieten, was den Prozess des Nachweises definierter zellulärer und interzellulärer Mechanismen erleichtern kann. Die monozytenartige THP-1-Zelllinie ist ein legitimes Modellsystem für primäre humane Monozyten⁹. Diese spontan verewigte Zelllinie wurde aus dem peripheren Blut eines einjährigen Säuglings mit akuter monozytärer Leukämie gewonnen^9,10. Die Differenzierung und Polarisation von THP-1-Zellen wurde in mehreren Studien berichtet und auf verschiedene Arten durchgeführt^11,12,13,14. Auf die Aktivierung und damit die Polarisation von Makrophagen in einen M1-ähnlichen Phänotyp folgt ein kompensatorischer entzündungshemmender Rebound-Mechanismus, der einen M2-ähnlichen Phänotyp durch Zytokine fördert, die von entzündlichen Makrophagen wie Interleukin 6 (IL-6) oder Itaconat^15,16produziert werden. Dies könnte als Bruchmechanismus dienen, um eine überschießende Entzündungsreaktion nach Zellaktivierung abzuschwächen¹⁷. Der Prozess der Differenzierung und Polarisierung von Monozyten und THP-1-monozytenähnlichen Zellen zu einem entzündungshemmenden M2-ähnlichen Phänotyp wird selbst auch von entzündungsfördernden Reizen begleitet, die überwunden werden müssen. Eine entzündliche Zytokinreaktion kann durch mechanischen Stress¹⁸verursacht werden, z. B. durch Den Wechsel von Medien, um die Zellen zu refetieren, oder durch Zugabe chemischer Verbindungen zur Differenzierung von THP-1-Zellen, wie Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA), und induzieren die Produktion von Tumornekrosefaktor α (TNFα), Interleukin 1β (IL-1β) oder IL-6¹⁹. Dieses veränderte Zytokinexpressionsprofil als Reaktion auf PMA kann die nachfolgende Makrophagenpolarisation beeinflussen und verhindern²⁰. Ausreichende Ruhezeiten, wie zuvor nach der PMA-Behandlung berichtet, ermöglichen es diesen Entzündungsreaktionen, die Zellpolarisation in einen ausgeprägten M2-ähnlichen Phänotyp²¹zu verringern und zu erleichtern.

Dieses Protokoll demonstriert eine Methode, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen innerhalb von 14 Tagen in einen M2-ähnlichen Phänotyp von Makrophagen zu differenzieren und zu polarisieren.

Protokoll

HINWEIS: Eine Übersicht über die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte finden Sie in Abbildung 1. Die humane monozytenähnliche Leukämiezelllinie THP-1 wurde gekauft. Zur Authentifizierung der THP-1-Zelllinie wurde eine kurze Tandem-Wiederholungsanalyse durchgeführt. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen durch. Die monozytäre Zelllinie THP-1 wächst in Suspension und haftet nicht an Zellkulturoberflächen. Die Adhärenz kann durch Differenzierung von Monozyten in makrophagenähnliche Zellen induziert werden, z.B. durch mechanische Belastung oder spezifische Behandlung mitPMA.

1. Kultivierung und Erhaltung von THP-1-Monozyten-ähnlichen Zellen

1. Stellen Sie einen Timer für 150 s ein. Die gefrorene Durchstechflasche mit der THP-1-Zelllinie ( Materialtabelle ) aus demflüssigenStickstoff entfernen und sofort in einem Reinwasserbad (37 °C) auftauen. Starten Sie den Timer, sobald die Durchstechflasche in das Wasserbad gelegt wird. Lösen Sie die Kappe, um den Druck freizusetzen, der sich aufgrund des Auftauvorgangs aufbaut, aber stellen Sie sicher, dass die Rohröffnung nicht mit dem Wasser in Kontakt kommt, um eine Kontamination zu vermeiden. Der optimale Zeitraum für das Auftauen der Zellen liegt zwischen 120-150 s. Fahren Sie mit dem Auftauen der Zellsuspension fort, bis ein Eischip von etwa 4 mm Größe in der Durchstechflasche verbleibt. Fahren Sie dann sofort mit dem nächsten Schritt fort.
2. Die flüssige Phase der Zellsuspension wird in ein 15 mL Röhrchen mit 9 mL warmem (37 °C) Wachstumsmedium überführen (Materialtabelle). Anschließend 1 ml der warmen mittelzelligen Suspension in die THP-1-Durchstechflasche und zurück in das 15-ml-Röhrchen geben, um den verbleibenden Eischip zu schmelzen und die Durchstechflasche zu spülen, um sicherzustellen, dass keine Zellen zurückbleiben.
3. Mischen Sie die Suspension vorsichtig durch Pipettieren auf und ab mit einer 1000 μL Pipette. Entfernen Sie eine kleine Probe (ca. 10 μL), um die Zellen auf Lebensfähigkeit zu zählen (mit Trypanblau zum Ausschluss), während sie gesponnen werden. Drehen Sie die warmzellige Suspension bei 200 x g für 7 min bei 37 °C herunter.
4. Entfernen Sie den Überstand vollständig und resuspendieren Sie mit einem bestimmten Volumen des warmen Wachstumsmediums, um eine Zelldichte von 5 x 10⁵/ml zu erreichen. Mischen Sie die Suspension vorsichtig und geben Sie 22 ml Volumen in T-75-Zellkulturkolben (Materialtabelle). Lagern Sie die Kolben aufrecht in einem Inkubator bei 37 °C mit 5% Kohlendioxid (CO₂) Konzentration. Tauschen Sie die Wachstumsmedien alle 3-4 Tage aus.

2. Aussaat von THP-1-Zellen und Differenzierung in M0-Makrophagen

1. Bereiten Sie die Zelle, die das Wachstumsmedium mit der jeweiligen Zelldichte enthält, um Zellen mit einer Dichte von 3 x 10⁵/ml/well in 24-Well-Zellkulturplatten zu säen (Materialtabelle). Mischen Sie das Medium vorsichtig und bereiten Sie Aliquoten von 26 ml vor, die jeweils in ein 50-ml-Röhrchen gegeben werden. Verwenden Sie jeweils 26 ml Aliquot, um die Zellen in eine entsprechende Platte zu säen.
2. 1 ml des zellhaltigen Mediums in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte geben. Mischen Sie das Medium vorsichtig, indem Sie zwischen den Übertragungen auf und ab pipettieren.
3. Bereiten Sie eine Stammlösung von PMA vor (lösen Sie 1 mg PMA in 100 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) = ~16 mM Lösung von PMA in DMSO) und verdünnen Sie sie mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 10 ng / μL kurz vor der Zellbehandlung (Materialtabelle). Halten Sie die Lösung auf Eis und verwenden Sie sie sofort. Nicht wieder einfrieren. Fügen Sie 100 ng PMA pro Vertiefung hinzu. Lassen Sie jede Zellplatte ohne weitere Behandlung für 72 h im Inkubator sitzen.
4. Nach 72 h das Wachstumsmedium entfernen und durch 1 ml frisches Wachstumsmedium ersetzen. Berühren Sie den Boden der Vertiefungen nicht mit Pipettenspitzen. Lassen Sie die Zellen weitere 96 h im Inkubator ruhen.
5. Wiederholen Sie nach 96 h Schritt 2.4 (Medienwechsel) und lassen Sie die Zellen weitere 24 h ruhen.
   HINWEIS: Die M0-Makrophagen sind jetzt bereit für Experimente (Abbildung 2). Unmittelbar vor der Behandlung der Zellen im Rahmen weiterer Experimente sollten Sie einen Medienwechsel nur mit RPMI (Materialtabelle) in Betracht ziehen, da Wachstumsmedienergänzungen Interferenzen mit Reagenzien verursachen können, die zur Zellbehandlung hinzugefügt werden. Falls M2-ähnliche Makrophagen benötigt werden, fahren Sie mit Abschnitt 3 fort.

3. Polarisation von M0-Makrophagen in M2-ähnliche Makrophagen

1. Bereiten Sie eine Stammlösung von IL-4 und IL-13 vor (lösen Sie 20 μg IL-4 oder IL-13 in 200 μL nukleasefreiem Wasser auf) und verdünnen Sie sie unmittelbar vor der Zellbehandlung mit PBS auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 2 ng / μL. Halten Sie die Lösung auf Eis und verwenden Sie sie sofort. Nicht wieder einfrieren.
2. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und ersetzen Sie es durch 1 ml frisches Wachstumsmedium. Fügen Sie 20 ng Interleukin 4 (IL-4) und 20 ng Interleukin 13 (IL-13) pro Vertiefung hinzu. Lassen Sie die Zellen 48 h im Inkubator ruhen.
3. Wiederholen Sie nach 48 h Schritt 3.2. Lassen Sie die Zellen weitere 48 h im Inkubator ruhen.
4. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und ersetzen Sie es durch 1 ml frisches Wachstumsmedium. Lassen Sie die Zellen 48 h im Inkubator ruhen.
   HINWEIS: M2-ähnliche Makrophagen sind jetzt bereit für Experimente (Abbildung 2). Unmittelbar vor der Behandlung der Zellen im Rahmen weiterer Experimente sollten Sie einen Medienwechsel nur mit RPMI (Table of Materials) in Betracht ziehen, da Wachstumsmedienergänzungen Interferenzen verursachen können.

4. Ablösen und Entnehmen von Makrophagen für die Durchflusszytometrie

HINWEIS: Verwenden Sie eine mechanische Methode, die Kälteschälte und Zellabkratzen kombiniert, um die polarisierten Makrophagen von Platten für die Durchflusszytometrie zu lösen und zu ernten.

1. Entfernen Sie das warme Zellmedium und ersetzen Sie es durch eine Mischung aus eiskaltem PBS (ohne Kalzium und Magnesium) und 5% fetalem Rinderserum (FBS), 1 ml pro Vertiefung. Unmittelbar danach legen Sie die Zellplatte für 45 Minuten auf Eis. Legen Sie die Zellplatte nicht auf Eis, bevor das warme Zellmedium entfernt wird, da dies die Zelllebensfähigkeit erheblich verringert. Halten Sie die Zellen erst auf Eis, nachdem Sie einen Kälteschock mit eiskaltem PBS / 5% FBS-Gemisch induziert haben.
2. Nach 45 Minuten auf Eis die Zellen mit Mini-Zellschabern abkratzen (Materialtabelle). Die abgelösten Makrophagen in kaltem PBS/5% FBS vorsichtig in ein 15 mL Rohr geben. Halten Sie das Röhrchen immer auf Eis, bis die Zellen gefärbt sind.
   HINWEIS: Poolen Sie acht Zellschächte, um eine ausreichende Zellzahl für die Färbung zu erreichen.

Ergebnisse

M2-ähnliche Makrophagen wurden charakterisiert und die M2-Polarisation wurde mittels Durchflusszytometrie für Cluster of Differentiation Marker (CD) CD14, CD11b, CD80 (M1-like Marker) und CD206 (M2-like marker) validiert. Die Durchflusszytometrie-Färbung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Makrophagen wurden mit PBS/5% FBS gewaschen und mit Fcγ-Rezeptorblock inkubiert, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden. Die Zellen wurden dann mit FITC-konjugierten Maus-Anti-Human-CD14- und CD80-Antikörpern,...

Diskussion

Dieses Protokoll zur Differenzierung und Polarisierung von THP-1-Monozyten-ähnlichen Zellen innerhalb von 14 Tagen bietet eine Methode, um Makrophagen mit einem ausgeprägten M2-ähnlichen Phänotyp aufgrund einer langen Behandlungsinkubation von Zellen mit ausreichenden Ruhezeiten zwischen den Schritten zu erhalten.

Bestimmte Schritte sind für dieses Protokoll von entscheidender Bedeutung. Die Verdopplungszeit der THP-1-Monozyten beträgt ca. 26 h. Zellen können mit einer Zelldichte von 9 x 10

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,4 % Trypanblau	VWR, Radnor, USA	152-5061
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	USA Scientific, Ocala, USA	1615-5510
10 mL serologische Pipette	VWR, Radnor, USA	89130-898
1000 μ L TipOne Pipettenspitzen	USA Scientific, Ocala, USA	1111-2821
15 mL  Zentrifugenröhrchen	VWR, Radnor, USA	89039-664
20 μ L TipOne Pipettenspitzen	USA Scientific, Ocala, USA	1120-1810
200 μ L TipOne Pipettenspitzen	USA Scientific, Ocala, USA	1120-8810
25 mL serologische Pipette	VWR, Radnor, USA	89130-900
5 mL serologische Pipette	VWR, Radnor, USA	89130-896
50 mL Zentrifugenröhrchen	VWR, Radnor, USA	89039-662
Accutase Lösung 500	mL Sigma, St. Louis, USA	A6964
Antibiotische Antimykotische Lösung (100x), stabilisiert	Sigma, St. Louis, USA	A5955-100 mL	mit 10.000 Einheiten Penicillin, 10 mg Streptomycin und 25 & mu; g Amphotericin B pro ml, steril filtriert, BioReagenz, geeignet für Zellkulturen
Binder CO2 Inkubator	VWR, Radnor, USA	C170-ULE3
CytoOne T-75cm Kolben mit Filterkappe	USA Scientific, Ocala, USA	CC7682-4875
Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma, St. Louis, USA	D8537-500 mL	PBS ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid sollte verwendet werden, da beide die Makrophagenpolarisation verändern können
Eppendorf Centrifuge 5804 R (gekühlt)	Eppendorf, Enfield,	USA-Ethylalkohol
(70%)	-
-FACSCalibur Durchflusszytometer	BD Biosciences, San Diego, USA-		Das Durchflusszytometer arbeitet mit der CellQuest-Software (BD Biosciences)
Falcon 24-Well-Platte	VWR, Radnor, USA	353504
Fetales Rinderserum (FBS)	ATCC, Manassas, USA	30-2020
FITC Maus Anti-Human CD14	BD Biosciences, San Diego, USA	555397	Durchflusszytometrie, myeloischer Zellmarker (100 Tests)
FITC Maus Anti-Human CD80	BD Pharmingen, San Diego, USA	557226	Durchflusszytometrie, M1-Marker (100 Tests)
FITC Maus IgG1 & kappa; Isotypkontrolle	BD Pharmingen, San Diego, USA	555748	Durchflusszytometrie, Isotypkontrolle für CD80 (100 Tests)
FITC Maus IgG2a, κ Isotypkontrolle	BD Biosciences, San Diego, USA	553456	Durchflusszytometrie, Isotypkontrolle für CD14 (100 Tests)
Human BD Fc Block	BD Biosciences, San Diego, USA	564220	Durchflusszytometrie, Fc-Block (0,25 mg)
Humanes Interleukin 13 (IL-13)	R& D, Minneapolis, USA	IL-771-10 μ g
Humanes Interleukin 4 (IL-4)	R& D, Minneapolis, USA	SRP3093-20 μ g
Labconco Biosicherheitswerkbank (Delta Series 36212/36213)	Labconco, Kansas City,
Solution, 200 mM	ATCC, Manassas, USA	30-2214
Lipopolysaccharid (LPS) aus E. coli 0111:B4	Sigma, St. Louis, USA	L2630-100 mg
Mini Cell Scrapers	Biotium, Fremont, USA	22003
Neubauer Hämozytometer	Fisher Scientific, Waltham, USA	02-671-5
Nikon Eclipse inverses Mikroskop TS100	Nikon, Melville,	USA-Nukleasefreies
Wasser	Invitrogen, Carlsbad, USA	AM9937
Olympus Lichtmikroskop RH-2	Microscope Central, Feasterville, USA	40888
P10 variable Pipette - Gilson	VWR, Radnor, USA	76180-014
P1000 variable Pipette - Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-990 P200
variable Pipette - Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-988
PE Maus Anti-Human-CD11b	BD Biosciences, San Diego, USA	555388	Durchflusszytometrie, myeloischer Zellmarker (100 Tests)
PE Maus IgG1, & kappa; Isotypkontrolle	BD Biosciences, San Diego, USA	555749	Durchflusszytometrie, Isotypkontrolle für CD11b (100 Tests)
PE-Cy 5 Maus Anti-Human CD206	BD Pharmingen, San Diego, USA	551136	Durchflusszytometrie, M2-Marker (100 Tests)
PE-Cy 5 Maus IgG1 & kappa; Isotypkontrolle	BD Pharmingen, San Diego, USA	555750	Durchflusszytometrie, Isotypkontrolle für CD206 (100 Tests)
Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA)	Sigma, St. Louis, USA	P8139
Powerpette Plus Pipettier	VWR, Radnor, USA	75856-448
Präzisionswasserbad (Modell 183)	Precision Scientific, Chicago, USA	66551
RPMI-1640 Medium	ATCC, Manassas, USA	30-2001
THP-1 Zelllinie, American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC, Manassas, USA	TIB-202