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Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energieübertragungsstudie zur Ribosomenproteinsynthese

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DOI:

10.3791/62664

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6. Juli 2021

1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energietransfer ist eine Methode, die die tRNA-Dynamik während der ribosomalen Proteinsynthese verfolgt. Durch die Verfolgung einzelner Ribosomen werden inhomogene Populationen identifiziert, die Aufschluss über Mechanismen geben. Diese Methode kann verwendet werden, um biologische Konformationsänderungen im Allgemeinen zu verfolgen, um dynamische Funktionsbeziehungen in vielen anderen komplexen Biosystemen aufzudecken. Einzelmolekülmethoden können nicht-ratenlimitierende Schritte und dünn besiedelte Schlüsselzwischenprodukte beobachten, die mit herkömmlichen Ensemblemethoden aufgrund des durchschnittlichen Effekts nicht zugänglich sind.

Zusammenfassung

Das Ribosom ist ein großer Ribonukleoproteinkomplex, der Proteine prozessiv entlang von mRNA-Schablonen zusammensetzt. Der Durchmesser des Ribosoms beträgt etwa 20 nm, um große tRNA-Substrate an den A-, P- und E-Stellen aufzunehmen. Folglich wird die Ribosomendynamik auf natürliche Weise schnell dephasediert. Die Einzelmolekülmethode kann jedes Ribosom separat detektieren und inhomogene Populationen unterscheiden, was wesentlich ist, um die komplizierten Mechanismen von Mehrkomponentensystemen aufzudecken. Wir berichten über die Details einer smFRET-Methode auf Basis des Nikon Ti2 invertierten Mikroskops zur Untersuchung der Ribosomendynamik zwischen dem ribosomalen Protein L27 und tRNAs. Der L27 wird an seiner einzigartigen Cys 53-Position markiert und zu einem Ribosom rekonstituiert, das so konstruiert ist, dass L27 fehlt. Die tRNA ist an ihrer Ellenbogenregion markiert. Da sich die tRNA während des Dehnungszyklus an verschiedene Stellen innerhalb des Ribosoms bewegt, z. B. vor und nach der Translokation, weisen die FRET-Wirkungsgrade und -Dynamiken Unterschiede auf, die auf mehrere Subpopulationen hindeuteten. Diese Subpopulationen sind mit Ensemble-Methoden nicht nachweisbar. Das TIRF-basierte smFRET-Mikroskop basiert auf einem manuellen oder motorisierten invertierten Mikroskop mit selbstgebauter Laserbeleuchtung. Die Ribosomenproben werden durch Ultrazentrifugation gereinigt, in eine selbstgebaute Mehrkanal-Probenzelle geladen und dann über ein evaneszentes Laserfeld beleuchtet. Der Reflexionslaserspot kann verwendet werden, um eine Rückkopplungskontrolle mit perfektem Fokus zu erreichen. Die Fluoreszenzsignale werden durch einen motorisierten Filterrevolver getrennt und von zwei digitalen CMOS-Kameras gesammelt. Die Intensitäten werden über die NIS-Elements Software abgerufen.

Einleitung

Das Ribosom ist ein ø 20 nm großer Ribonukleoproteinkomplex aus einer großen (50S) und einer kleinen (30S) Untereinheit. Es setzt lange Peptide entlang der mRNA-Schablone prozessiv und kooperativ zusammen. Das Ribosom 30S bindet an die fMet-tRNAfMet und mRNA, um die Proteinsynthese zu starten, und das 50S verbindet sich dann zum 70S-Initiationskomplex. Die tRNAs bringen Aminosäuren an der A-Stelle (Aminoacyl-tRNA-Bindungsstelle) zum Ribosom, während die längliche Peptidylkette an der P-Stelle (Peptidyl-tRNA-Bindungsstelle) gehalten wird. Im Prätranslokationskomplex wird die Peptidylkette mit einer Aminosäure auf die tRNA an der A-Stelle übertragen. Währenddessen wird die P-Site tRNA deacyliert. Dann bewegen sich die A-, P-tRNAs zu den P-, E-Stellen, um den Post-Translokationskomplex zu bilden, in dem die E-Stelle die tRNA-Austrittsstelle darstellt. In diesem Zustand bewegt sich die Peptidyl-tRNA zurück zur P-Stelle. Der Dehnungszyklus setzt sich zwischen den Prä- und Postkonformationen fort, während das Ribosom auf der mRNA transloziert, ein Codon nach dem anderen1. Das Ribosom ist in hohem Maße koordinaliv von verschiedenen funktionellen Stellen, um diesen Prozess effizient und genau zu machen, wie z. B. Inter-Subunit-Ratschen2,tRNA-Hybridisierungsschwankungen3,GTPase-Aktivierungen4,L1-Stielöffnung und-schließung 5usw. Folglich entphasen ribosomen schnell, da sich jedes Molekül in seinem eigenen Tempo bewegt. Die herkömmlichen Methoden können nur scheinbare Durchschnittsparameter ableiten, aber dünn besiedelte oder kurzlebige Arten werden im durchschnittlichen Effekt maskiert6. Die Einzelmolekülmethode kann diese Einschränkung durchbrechen, indem jedes Ribosom einzeln nachgewiesen und dann verschiedene Spezies durch statistische Rekonstruktion identifiziert werden7. Verschiedene Markierungsstellen wurden implementiert, um die Ribosomendynamik zu untersuchen, wie z.B. die Wechselwirkungen zwischen tRNA-tRNA8, EF-G-L119, L1-tRNA10usw. Darüber hinaus werden durch die Markierung der großen bzw. kleinen Untereinheiten die Ratschenkinetik zwischen den Untereinheiten und die Koordination mit Faktoren beobachtet11,12. Inzwischen hat die smFRET-Methode breite Anwendungen in anderen zentralen biologischen Prozessen, und mehrfarbige FRET-Methoden entstehen13.

Zuvor wurde ein neuartiges Ribosomen-FRET-Paar entwickelt14,15. Das rekombinante ribosomale Protein L27 wurde exprimiert, gereinigt und markiert und wieder in das Ribosom eingebaut. Dieses Protein interagierte mit den tRNAs aus nächster Nähe und half bei der Stabilisierung der P-Site-tRNA im Posttranslokationskomplex. Wenn sich die tRNA von der A- zur P-Stelle bewegt, verkürzt sich der Abstand zwischen diesem Protein und der tRNA, was durch das smFRET-Signal unterschieden werden kann. Mehrere Ribosomen-Subpopulationen wurden mit statistischen Methoden und Mutagenese identifiziert, und der spontane Austausch dieser Populationen im Prä-, aber nicht Nachtranslokationskomplex deutet darauf hin, dass das Ribosom flexibler ist, bevor es sich auf der mRNA bewegt, und steifer während der Entschlüsselung16,17,18. Diese Variationen sind essentiell für die Ribosomenfunktion. Hier beschreibt das Protokoll die Details der Ribosom/tRNA-Markierung, deren Einbau in das Ribosom, smFRET-Probenvorbereitung und Datenerfassung/-analyse19.

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Protokoll

1. Herstellung von markiertem Ribosom und tRNA für den FRET-Nachweis

  1. Ribosom ohne L27 aus E. coli Stamm IW312 nach Standardprotokollen20,21 isolieren. Extrahieren Sie das normale Ribosom aus dem E. coli-Stamm MRE600.
  2. Klonen Sie das rpmA-Gen des L27 mit C-terminalen His-Tag in pET-21b (+) Plasmid, das in BL21(DE3)pLysS-Zellen15transformiert und exprimiert wird. Reinigen Sie das Protein über eine vorverpackte Sepharosesäule.
  3. Kennzeichnung von L27
    1. Inkubieren Sie 20-100 μM gereinigtes L27 in 100 μL mit 2-10-fachem Überschuss an TCEP (Tris-2-carboxyethyl-phosphin) bei Raumtemperatur (RT) für 30 min. Pufferaustausch der Lösung in PBS-Puffer (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl; 0,137 M NaCl), unter Verwendung einer Nap-5-Säule. Fügen Sie 10-fach überschüssigen Cy5-Maleimid-Monoreaktivfarbstoff in DMSO in die Lösung ein und inkubieren Sie bei RT im Dunkeln für 2 h.
    2. Laden Sie die oben erwähnte markierte Proteinlösung (500 μL) auf eine Nap-5-Säule, um den überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass das Protein im ersten farbigen Band eluiert, gefolgt von der freien Farbstoffelfälte im zweiten Band. Sammeln Sie das eluierte Protein in 1 ml TAM10-Puffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Mg (OAc)2,30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 0,5 mM EDTA und 7 mM BME (2-Mercaptoethanol)).
  4. Rekonstituieren Sie das Ribosom mit L27. Mischen Sie das markierte L27-Protein mit einer gleichen Menge IW312-Ribosom im TAM10-Puffer und inkubieren Sie es bei 37 °C für 1 h. Entfernen Sie das freie Protein durch Saccharosekissen-Ultrazentrifugation (100.000 x g,über Nacht), damit das Ribosom ein blau gefärbtes Pellet am Boden der Röhre bilden kann.
  5. Kennzeichnen Sie die tRNAPhe gemäß dem zuvor veröffentlichten Bericht22. Zuerst wird die tRNA (10 A260 in 1 ml Wasser) mit 100 μL NaBH4 (100 mM Stamm, Dropwise zugabe) bei 0 °C für 1 h inkubiert. Befreien Sie die tRNAs von nicht umgesetztem NaBH4 durch dreimalige Ethanolfällung durch Zugabe von 1/10 Volumen von 3 M KAc (pH 5,0) und 2,5x Volumen Ethanol. Die reduzierte tRNA wird mit 1 μL Cy3-NHS-Farbstofflösung (1 mg in 10 μL DMSO) in einem Mindestvolumen (~20 μL) von 0,1 M Natriumformiat (pH 3,7) inkubiert. Nach 2 h Inkubation bei 37 °C die tRNA über eine kleine G25 Sephadex-Säule vom nicht umgesetzten Farbstoff trennen und dann den freien Farbstoff durch zweimalige Ethanolfällung entfernen.

2. Herstellung der Ribosomenkomplexe

  1. Exprimieren und reinigen Sie die His-markierten Proteine von IF1, IF2, IF3, EF-G, EF-Tu, EF-Ts und tRNA-Synthetasen mit Standardmethoden15.
  2. Bereiten Sie die Initiationsmischung vor, indem Sie die folgenden Zutaten in TAM10-Puffer bei 37 °C für 15 min hinzufügen: 1 μM des markierten Ribosoms; je 1,5 μM if1, IF2 und IF3; 2 μM biotinylierte mRNA (kodieren MF für die ersten beiden Aminosäuren); 4 μM geladene fMet-tRNAfMet; und 1 mM GTP.
  3. Bereiten Sie die EF-Tu_G Mischung vor, indem Sie die folgenden Zutaten in TAM10-Puffer bei 37 °C für 15 min mischen: 4 μM EF-Tu, 0,4 μM EF-Ts, 2 μM EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP und 0,02 mg/ml Pyruvatkinase.
  4. Bereiten Sie die EF-Tu_NoG Mischung ähnlich wie schritt 2.3 ohne EF-G vor.
  5. Bereiten Sie die Phe-Mischung vor, indem Sie die folgenden Zutaten in nukleasefreiem Wasser bei 37 °C für 15 min mischen: 100 mM Tris (pH 7,5), 20 mM MgAc2, 1 mM EDTA, 4 mM ATP, 7 mM BME, 2 mM Phenylalanin-spezifische Synthetase, 2 A260/ml markierte tRNAPheund 50 μM Phenylalanin.
  6. Bereiten Sie den Pre-Translocation-Komplex (PRE) vor, indem Sie die Initiations-, EF-Tu_NoG- und Phe-Mischungen im Verhältnis 1:2:2 bei 37 °C für 2 min mischen. Nach der Inkubation das PRE durch 1,1 M Saccharosekissen-Ultrazentrifugation über Nacht bei 100.000 x greinigen.
  7. Bereiten Sie den Post-Translokationskomplex (POST) vor, indem Sie die Initiations-, EF-Tu_WG- und Phe-Mischungen im Verhältnis 1:2:2 bei 37 °C für 10 min mischen. Nach der Inkubation den POST durch 1,1 M Saccharosekissen-Ultrazentrifugation über Nacht bei 100.000 x greinigen.

3. Vorbereitung von Probenobjektträgern

  1. Reinigen Sie die Glasobjektträger des Mikroskops (75 mm x 25 mm) mit sechs Lochpaaren (Durchmesser 1 mm). Jedes Paar bildet einen Einlass-Auslass der Probenkammer. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen jedem Einlass-Auslassloch 13 mm und der Mittel-zu-Mitte-Abstand zwischen zwei Kanälen 6 mm beträgt. Legen Sie sechs Dias in einen Glastiegel.
  2. Füllen Sie den Tiegel mit Aceton und beschallen Sie ihn für 5 min. Dekantieren Sie das Aceton und spülen Sie die Rutschen dreimal mit Reinstwasser ab. Füllen Sie den Tiegel wieder mit Wasser und 1 ml 10 M KOH. 20 Min. beschallen.
  3. Spülen Sie die Rutschen dreimal mit Reinstwasser ab. Füllen Sie den Tiegel erneut mit Ethanol und beschallen Sie ihn für 5 min. Dekantieren Sie das Lösungsmittel vollständig. Lassen Sie die Rutschen im Abzug trocknen.
  4. Reinigen Sie die Glasabdeckungen des Mikroskops (#1,5 Dicke, 24 x 40 mm). Führen Sie die Reinigungsschritte wie in den Schritten 3.1-3.3 beschrieben aus.
  5. Die gereinigten Dias und Abdecklippen bei 300 °C für 3 h backen. Bewahren Sie sie über Nacht im Ofen auf, um sie abzukühlen.
  6. Beschichten Sie den Deckmantel mit Aminosilan. In den Tiegel, der Dieckel enthält, Methanolmischung (100 ml Methanol, 5 ml Wasser, 0,5 ml HAc und 1 ml Aminosilan) eingießen. Erwärmen Sie den Tiegel in einem Wasserbad für 10 min, beschallen Sie ihn für 10 min und erwärmen Sie dann den Tiegel im Wasserbad für weitere 10 min. Dekantieren Sie das Methanolgemisch, spülen Sie den Abdecksch gut in drei Tiegeln mit sauberem Wasser ab. Reinigen Sie die Oberflächen mit einem trockenen Stickstoffstrom durch eine Nadel.
  7. Beschichten Sie die Deckstücke mit Biotin-PEG in einer laminaren sauberen Kapuze.
    1. Um die PEG-Lösung herzustellen, verwenden Sie 98 mg PEG und 2-3 mg Biotin-PEG in 200 μL 100 mM NaHCO3-Lösung.
    2. Legen Sie einen Deckdeckel flach auf eine Oberfläche. Lassen Sie vorsichtig 60 μL PEG-Lösung auf die Oberkante fallen. Legen Sie dann einen weiteren Deckslip darauf, so dass der Kapillareffekt die Lösung zwischen den beiden Decklippen verteilt. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen bilden.
    3. Wiederholen Sie Schritt 3.7.2 für zwei weitere Paar Coverlips. Sechs Stücke Deckstücke mit Biotin beschichten. Wenn mehr Coverlips benötigt werden, passen Sie die Menge an PEG und Biotin PEG entsprechend an, um mehr PEG-Lösung herzustellen.
    4. Lagern Sie diese Coverlips in einer leeren Tip-Box, die mit Wasser gefüllt ist, und inkubieren Sie sie 3 h im Dunkeln.
    5. Nach 3 h die Abdeckungsrutsche trennen, in drei aufeinanderfolgenden Tiegeln mit Wasser abspülen und mit einem trockenen Stickstoffstrom reinigen. Legen Sie die beschichteten Deckschichten auf ein Keramikgestell. Markieren Sie die Oberfläche mit Beschichtung.
  8. Bauen Sie die Probenkammern19zusammen.
    1. Ziehen Sie scharfe Pipettenspitzen durch die Löcher auf den Glasschlitten, bis sie fest anliegen. Kratzen Sie die scharfen Enden ab, bis sie vollständig flach zur Glasoberfläche sind. Schneiden Sie das andere Ende der Spitze für die Probenbeladung auf ca. 5 mm ab.
    2. Schneiden Sie ein doppelseitiges Band mit dem Kanalmuster darauf (25 x 40 mm).
    3. Kleben Sie das doppelseitige Klebeband auf die Glasträger auf der flachen Seite.
    4. Kleben Sie den beschichteten Deckdeckel auf das doppelseitige Klebeband. Drücken Sie darauf, um die Probenkammer dicht zu versiegeln. Stellen Sie sicher, dass die beschichtete Seite nach innen zeigt.

4. Einzelmolekül-FRET-Bildgebung

  1. Schalten Sie den Computer ein.
  2. Schalten Sie den Mikroskopschalter ein.
  3. Starten Sie die Lasersteuerungsschnittstelle und schalten Sie den Laser ein. Drücken Sie die Aktivierungstaste an der Lasersteuerbox, um den Laser aufzuwärmen.
  4. Schalten Sie die Kameras ein.
  5. Starten Sie das mikroskopbezogene Softwareprogramm. Klicken Sie auf die obere Verschlussleuchte Aus und dann auf die Lampe Ein.
  6. Bereiten Sie den TAM10_WT Puffer vor, indem Sie 10 μL 5% Tween-20 in 1 ml TAM10 Puffer hinzufügen.
  7. Bereiten Sie die Desoxylösung vor, indem Sie 3 mg Glukoseoxidase in einem kleinen Mikrozentrifugenröhrchen wiegen. Fügen Sie 45 μL Katalase hinzu. Wirbel sanft, um den Feststoff aufzulösen. Bei 20.000 x g in einer Mikrozentrifuge für 1 min drehen. Nehmen Sie den Überstand.
  8. Bereiten Sie 30% ige Glukoselösung in Wasser und 200 mM Trolox-Lösung in DMSO vor.
  9. Bereiten Sie 0,5 mg / ml Streptavidinlösung in nukleasefreiem Wasser vor.
  10. Fügen Sie dem TIRF-Objektiv einen Tropfen Bildöl hinzu.
  11. Legen Sie die Probenkammern auf das Objektiv.
  12. Füllen Sie die Kammer mit 10 μL Streptavidinlösung. Warten Sie 1 min.
  13. Waschen Sie die Kammer mit 30 mL TAM10_WT Puffer und sammeln Sie die Durchlauflösung mit einem gefalteten Filterpapier. Warten Sie 1 min.
  14. Verdünnen Sie die Ribosomenkomplexe (PRE oder POST) auf 10-50 nM Konzentration mit TAM10_WT Puffer.
  15. Laden Sie 20 μL der Ribosomenprobe in den Kanal. Warten Sie 2 min.
  16. Machen Sie den Bildgebungspuffer (50 μL TAM10-Puffer plus jeweils 0,5 μL Desoxy-, Glukose- und Trolox-Lösungen). Mischen Sie den Puffer gut.
  17. Spülen Sie die Kammer mit 30 μL des Abbildungspuffers.
  18. Stellen Sie die Kamera so ein, dass sie 100 ms/Frame, 16 Bit, 4 x 4 Binning erfasst.
  19. Klicken Sie auf die obere Verschlussleuchte Ein und die Lampe Auf Aus.
  20. Starten Sie die Kameraerfassung. Verteilen Sie die Bilder in drei Fenster, die zwei einzelne Kameras und das Overlay darstellen.
  21. Klicken Sie auf Autofokus. Feinabstimmung, um den besten Fokus zu finden.
  22. Klicken Sie auf eine Methode. Legen Sie die Feldpunkte, den Dateispeicher und die Schleifennummer fest.
  23. Klicken Sie auf Ausführen.
    HINWEIS: Es erscheint ein neues Fenster mit Echtzeit-Imaging. Der Fortschritt der Zeitreihen und der Sichtfeldreihen wird oben im Fenster angezeigt.
  24. Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, schließen Sie das Popup-Fenster.
  25. Öffnen Sie die Datei ND (erworbene Datei).
  26. Klicken Sie auf ROI / einfacher ROI-Editor. Wählen Sie die Option Kreis.
  27. Wählen Sie den ROI auf dem Bild aus. Klicken Sie auf Fertig stellen, wenn es abgeschlossen ist.
  28. Klicken Sie auf Messung/ Zeitmessung, um die Daten entweder als Diagramm oder als Tabelle anzuzeigen.
  29. Öffnen Sie die Registerkarte Exportieren. Legen Sie die Exportparameter fest.
  30. Klicken Sie auf Exportieren, um die Dichten zu speichern.

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Ergebnisse

Das smFRET hatte das Ribosom an der mittleren Position des tRNA-Verkehrs markiert, um die tRNA-Translokation von der A- zur P-Stelle zu unterscheiden (Abbildung 1)15. Der Abstand vom L27-Markierungsrest zur A- oder P-Stelle tRNA beträgt 52 bzw. 61 Å, was einer FRET-Effizienz von 0,47 bzw. 0,65 entspricht. Nach der Bildaufnahme wurden Fluoreszenzdicken aus den Donor- und Akzeptorkanälen abgerufen und als Zeitraffer aufgezeichnet (Abbildung 1

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Diskussion

SmFRET reagiert empfindlich auf Hintergrundsignale. Zuerst ist es notwendig, die Probenkammer mit 0,05% Tween zu beschichten und dann gleichzeitig mit der Ribosomenlösung hinzugefügt zu werden, um eine unspezifische Bindung des Ribosoms an die Oberfläche zu blockieren. Um die Fluoreszenz der Cy5-Emission des Akzeptors zu sehen, ist der Sauerstofffängercocktail (Desoxy-, Glukose- und Trolox-Lösungen) unerlässlich. Ohne diese Lösung ist das Bleichen im Akzeptorkanal zu schnell, um nützliche Informationen zu erhalten. Ein w...

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Offenlegungen

Y. Wang erklärt keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wird von den US National Institutes of Health (R01GM111452) und der Welch Foundation (E-1721) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AminosilanLaysanbioMPEG-SIL-5000
Biotin-PEGLaysanbioBiotin-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS ZellenNovagen71403
KatalaseMillipore SigmaC3515
CS150FNX Micro Ultrazentrifugenuaire
Cy3/C5-maleimidApexBioA8138/A8140
ECLIPSE Ti2 inverses MikroskopNikon
EdgeGARD Laminar Flow HoodBaker
GlukoseoxidaseMillipore SigmaG2133
Histrap HP Säule (vorgepackte Sepharosesäule)Cytiva17524701
Mikroskop DeckglasVWR48393-230
Objektträger für MikroskopeVWR470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 KameraHamamatsu
PEG (5.000)LaysanbioMPEG-SVA-5000
pET-21b (+) PlasmidNovagen69741
UltraschallgerätVWRCPX-952-518R
TCEPApexbioB6055
TroloxMillipore Sigma238813

Referenzen

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Schlagwörter

Einmolekular FRETRibosomendynamiktRNA BewegungTIRF MikroskopieReinigung mittels UltrazentrifugationProtein L27 MarkierungAntibiotika InhibitionZeitrafferbildgebung

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