Methodenartikel

Eine erschwingliche und effiziente "hausgemachte" Plattform für Drosophila-Verhaltensstudien und ein begleitendes Protokoll für die mitochondriale Respirometrie von Larven

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DOI:

10.3791/62669

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24. September 2021

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1Departamento de Tecnologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Biomedicina, Universidade do Oeste Paulista

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir stellen Protokolle für jeden mit einer "Maker-Kultur" zur Verfügung, um mit dem Aufbau eines Flylabs für die quantitative Analyse einer Vielzahl von Verhaltensparametern bei Drosophila melanogaster zu beginnen, indem viele der notwendigen Geräte in 3D gedruckt werden. Wir beschreiben auch ein hochauflösendes Respirometrieprotokoll mit Larven, um Verhaltens- und mitochondriale Stoffwechseldaten zu kombinieren.

Zusammenfassung

Die Nützlichkeit von Drosophila als Modellorganismus für die Erforschung menschlicher Krankheiten, Verhaltensweisen und grundlegender Biologie ist unbestreitbar. Obwohl die Drosophila-Forschung praktisch ist, ist sie in Entwicklungsländern nicht beliebt, möglicherweise aufgrund der falsch informierten Vorstellung, dass die Einrichtung eines Labors und die Durchführung relevanter Experimente mit solch winzigen Insekten schwierig ist und teure, spezialisierte Geräte erfordert. Hier beschreiben wir, wie man ein erschwingliches Flylab baut, um eine Vielzahl von Verhaltensparametern in D. melanogaster quantitativ zu analysieren, indem viele der notwendigen Geräte in 3D gedruckt werden. Wir bieten Protokolle für den Bau von hauseigenen Fläschchengestellen, Balzarenen, Apparaturen für Bewegungstests usw. an, die für die allgemeine Fliegenpflege und für die Durchführung von Verhaltensexperimenten mit adulten Fliegen und Larven verwendet werden. Wir stellen auch Protokolle zur Verfügung, wie ausgefeiltere Systeme, wie z. B. ein hochauflösendes Oxygraph, zur Messung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs in Larvenproben verwendet werden können, und zeigen seinen Zusammenhang mit Verhaltensänderungen in den Larven bei der xenotopischen Expression der mitochondrialen alternativen Oxidase (AOX). AOX erhöht die Larvenaktivität und die Atmung des mitochondrialen Lecks und beschleunigt die Entwicklung bei niedrigen Temperaturen, was mit einer thermogenen Rolle des Enzyms vereinbar ist. Wir hoffen, dass diese Protokolle Forscher, insbesondere aus Entwicklungsländern, dazu inspirieren werden, Drosophila zu verwenden, um Verhaltens- und Mitochondrienstoffwechseldaten einfach zu kombinieren, was zu Informationen über Gene und/oder Umweltbedingungen führen kann, die auch die menschliche Physiologie und Krankheitszustände regulieren können.

Einleitung

Drosophila melanogaster wurde vor mehr als 100 Jahren als potentiell leistungsfähiger Modellorganismus in die wissenschaftliche Gemeinschaft eingeführt. Dieses Potenzial wurde in mehreren Bereichen der biologischen und biomedizinischen Wissenschaften wie Genetik, Evolution, Entwicklungsbiologie, Neurobiologie sowie Molekular- und Zellbiologie fest bestätigt. Infolgedessen wurden sechs Nobelpreise für Medizin oder Physiologie an zehn Drosophila-Forscher verliehen, die wesentlich zu unserem Verständnis von Vererbung, Mutagenese, angeborener Immunität, zirkadianen Rhythmen, Geruchssinn und Entwicklung beigetragen haben1. Vielleicht noch wichtiger ist, dass D. melanogaster nicht aufgehört hat, uns neue Modelle der menschlichen Biologie und Krankheiten zu liefern, denn eine schnelle Suche auf PubMed zeigt fast 600 Veröffentlichungen in den letzten 5 Jahren unter Verwendung des Suchbegriffs "Drosophila-Modell" (2, Stand Februar 2021). In den USA, wo Drosophila ein weit verbreiteter Modellorganismus in der biomedizinischen Gemeinschaft ist, wurden etwa 2,2 % aller R01-Forschungspreise, die 2015 von den NIH vergeben wurden, an Drosophila-Forscher vergeben3. In Brasilien hingegen ergab eine Suche nach aktuell geförderten Projekten auf der Website der Sao Paulo Research Foundation (FAPESP), der wichtigsten Förderagentur für Forschung in allen Wissenschaftsbereichen im Bundesstaat Sao Paulo, nur 24 Grants und Fellowships mit Drosophila als Hauptfach der Studie4. Unter Berücksichtigung aller 13205 Projekte, die derzeit von FAPESP finanziert werden (5, Stand Februar 2021), stellen diese 24 Drosophila-Projekte einen Anteil von weniger als 0,2 % der Gesamtprojekte dar, was fast 12-mal niedriger ist als der der NIH. Wenn wir die geförderten Projekte, die darauf abzielen, Drosophila aus ökologischer und/oder evolutionärer Sicht zu untersuchen, herausnehmen und davon ausgehen, dass die restlichen Projekte diesen Organismus als Modell für das Verständnis menschlicher biologischer Prozesse bei Gesundheit und Krankheit verwenden, sinkt dieses Verhältnis auf schockierende ~0,1%.

In der Tat ist eine gründliche Untersuchung gerechtfertigt, um die Gründe aufzudecken, warum die Drosophila-Forschung in Brasilien/São Paulo bei der Anzahl der geförderten Projekte nicht so bedeutend zu sein scheint. Die Kultivierung von Drosophila ist nicht teuer 6,7,8 und relativ einfach, da im Gegensatz zu Wirbeltieren für Versuche keine Genehmigung einer bioethischen Kommission erforderlich ist 9,10. In Brasilien ist jedoch eine Genehmigung für die Arbeit mit gentechnisch veränderten Fliegenschnüren erforderlich11, was eine zusätzliche Bürokratie mit sich bringt, die allen Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen eigen ist. Dies dürfte interessierte Forschende aber nicht davon abhalten, ein Flylab zu initiieren. Wir spekulieren, dass Fehlinformationen über die Leistungsfähigkeit des Modells und über die zu erwartenden hohen Kosten, die mit der Einrichtung eines Flylabs und der Durchführung aussagekräftiger Experimente verbunden sind, wichtige Faktoren bei dieser Entscheidung sind. Wie bei den meisten wissenschaftlichen Geräten und Verbrauchsmaterialien müssen die entsprechenden Geräte zur Durchführung allgemeiner Fliegenwartungs- und Verhaltensanalysen aus Nordamerika, Europa und/oder anderen Ländern nach Brasilien importiert werden, was ein teurer und extrem zeitaufwändiger Prozess ist12,13.

In jüngster Zeit hat sich eine Alternative zum Import von Spezialgeräten herausgebildet, da 3D-Drucker erschwinglicher und für jedermann zugänglicher geworden sind, auch für Drosophila-Forscher in Entwicklungsländern. Die 3D-Drucktechnologie wurde in den letzten 10 Jahren von Mitgliedern der "Maker-Kultur" weit verbreitet eingesetzt, die auf der Idee der Autarkie basiert, anstatt sich ausschließlich auf selbst hergestellte Produkte zu verlassen14. Eine solche Idee war schon immer in akademischen Forschungslabors rund um den Globus präsent, so dass es nicht verwunderlich ist, dass 3D-Drucker vielerorts zur Standardausrüstung von Labors geworden sind15,16. Seit einigen Jahren drucken wir unter anderem Fliegenfläschchengestelle, Gegenkampfarenen, Klettergeräte und andere Geräte in 3D, und das zu einem Bruchteil der Kosten von Markenäquivalenten. Die reduzierten Kosten für den Druck und die Montage von selbstgemachten Laborgeräten wird klassisch durch das FlyPi repräsentiert, das für weniger als 100,00 € gebaut werden kann und als Licht- und Fluoreszenzmikroskop in der Lage ist, eine ausgeklügelte opto- und thermogenetische Stimulation des genetisch manipulierbaren Zebrafisches, Drosophila und Nematoden zu nutzen15. Hier stellen wir eine Reihe von Protokollen für alle zur Verfügung, die daran interessiert sind, Drosophila-Forscher zu werden (oder ihr eigenes bestehendes Flylab zu erweitern), um viele der notwendigen Materialien in 3D zu drucken. Wenn der Leser Zeit investiert und ein wenig Fachwissen entwickelt, wird er sogar in der Lage sein, die hier vorgestellten Protokolle zu optimieren, um Geräte zu drucken, die besser an seine eigenen Forschungsbedürfnisse angepasst sind.

Ein Flylab ist jedoch nicht nur ein Ort für "billige" Geräte, insbesondere wenn man beabsichtigt, Verhaltensanalysen mit zugrunde liegenden Stoffwechselphänomenen in Verbindung zu bringen. Wir haben uns auch für die Rolle der Mitochondrien bei der Modulation von Drosophila-Verhaltensmustern interessiert, da diese Organellen für die Massenproduktion von ATP in den meisten Geweben über mehrere Stoffwechselwege verantwortlich sind, deren Produkte zur oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) konvergieren. Die Analyse des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs als eine Möglichkeit, den mitochondrialen Stoffwechsel zu verstehen, erfordert einen Oxygraphen, bei dem es sich um ein anspruchsvolleres Gerät handelt, das leider noch nicht in 3D gedruckt werden kann. Da OXPHOS praktisch alle zellulären Prozesse beeinflusst, da es von einer Reihe exergonischer Redoxreaktionen abhängt, die in der Zelle ablaufen17,18, können Sauerstoffverbrauchsraten, die auf dem oxidierbaren Substrat basieren, das den Mitochondrien zur Verfügung gestellt wird, dazu beitragen, zu zeigen, ob die Funktion der Organelle Ursache oder Folge eines bestimmten Verhaltens ist. Daher stellen wir hier auch ein Protokoll zur Messung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs in Larvenproben zur Verfügung, da wir feststellen, dass sich die überwiegende Mehrheit der veröffentlichten Protokolle auf die Analyse adulter Proben konzentriert. Wir zeigen, dass Veränderungen der mitochondrialen Atmung, induziert durch die transgene Expression der Ciona intestinalis Alternative Oxidase (AOX), zu einer erhöhten Beweglichkeit der Larven unter Kältestress führen. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die Thermogenese zurückzuführen, da AOX eine nicht-protonenpumpende terminale Oxidase ist, die die Aktivität der OXPHOS-Komplexe III und IV (CIII und CIV) umgehen kann, ohne zum mitochondrialen Membranpotential (ΔΨm) und zur ATP-Produktion beizutragen 19,20,21. Kein Insekt, einschließlich Drosophila, oder Wirbeltier besitzt von Natur aus AOX 21,22,23, aber seine Expression in einer Vielzahl von Modellsystemen 24,25,26,27,28,29 hat erfolgreich sein therapeutisches Potenzial für Zustände mit allgemeinem mitochondrialem Atemstress gezeigt, insbesondere wenn sie durch CIII und/oder CIV verursacht werden überlasten. AOX verleiht Resistenz gegen toxische Konzentrationen von Antimycin A24 und Cyanid24,25 und mildert verschiedene Phänotypen im Zusammenhang mit mitochondrialen Funktionsstörungen 24,25,30,31,32. Die Tatsache, dass die AOX-Expression das Verhalten der Larven und die mitochondriale Funktion verändert, rechtfertigt eingehendere Studien über die Rolle dieses Enzyms im Stoffwechsel und in der Physiologie von Metazoenzellen und -geweben33,34.

Wir hoffen, dass wir mit diesem Artikel dazu beitragen können, das Bewusstsein in der wissenschaftlichen Gemeinschaft von Entwicklungsländern wie Brasilien zu schärfen, dass die Verwendung des hervorragenden genetischen Instrumentariums, das D. melanogaster präsentiert, in Kombination mit effizienten und erschwinglichen selbstgemachten Geräten für Verhaltensanalysen relativ schnell grundlegende Forschungsdaten über interessante biologische Prozesse mit signifikanter translationaler Wirkung generieren kann. Unterstützung künftiger therapeutischer Studien in der klinischen Forschung. Die Entwicklung solcher gemeinschaftlichen Ideale wäre für Drosophilisten, medizinische Forscher sowie die biologischen und biomedizinischen Wissenschaften von großem Nutzen. Vor allem aber würde es der Gesellschaft im Allgemeinen zugute kommen, da öffentliche Mittel translationaler eingesetzt werden könnten, um menschliche Krankheiten zu verstehen und zu behandeln.

Die Protokolle, die wir hier für den 3D-Druck der Geräte für ein Flylab zur Verfügung stellen, wurden für die Verwendung mit dem RepRap 3D-Drucker entwickelt, basierend auf dem Prusa I3 DIY-Modell, das in35 Jahren erhältlich ist. Wir verwenden das 1,75 mm große weiße Polymilchsäure (PLA)-Filament (SUNLU) als Rohmaterial für den Druck, die Tinkercad-Plattform36 für die Modellkonstruktion und die Repetier-Host-Software37 für die Umwandlung von STL in G-Code, ein notwendiger Schritt, um dem Drucker Koordinaten zur Verfügung zu stellen. Eine weitere Optimierung der Protokolle ist erforderlich, wenn das Lesegerät alternative Geräte, Materialien und Software verwenden möchte.

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Protokoll

1. 3D Modelldesign

HINWEIS: Der Arbeitsablauf für den 3D-Druck besteht aus drei grundlegenden Schritten: (1) 3D-Modellierung; (2) Importieren des Modells in die Slicing-Software; und (3) Auswahl des richtigen Filaments, Konfiguration des Druckers und schließlich Drucken. Ein grundlegendes Protokoll für die Modellierung eines kleinen Racks/Tabletts für Fläschchen ist unten dargestellt. Dieses Gestell ist für die Verwendung mit Standard-Fliegenfläschchen geeignet, die einen Durchmesser von ca. 2,5 cm und eine Höhe von 9,8 cm haben. Für neue Modellkonstruktionen ermöglichen die von der Tinkercad-Software bereitgestellten Werkzeuge die einfache Handhabung dreidimensionaler Strukturen, indem Teile mit unterschiedlichen Formen, Größen und Dicken erstellt werden, je nach den eigenen Bedürfnissen. Für Drosophilisten, die sich zum ersten Mal in den Bereich des 3D-Drucks wagen, kann es immer noch eine Herausforderung sein, die folgenden Protokolle zu befolgen, selbst mit all ihren Details, daher empfehlen wir dringend, sich mit der Software vertraut zu machen, um die besten Ergebnisse zu erzielen.

  1. Melden Sie sich bei Tinkercad online38 an (Abbildung 1A). Für den kostenlosen Zugang zur Plattform ist eine vorherige Registrierung mit persönlichen Daten erforderlich.
  2. Klicken Sie auf Neues Projekt erstellen , um ein neues Design zu beginnen, und benennen Sie das Projekt in der oberen rechten Ecke des Fensters entsprechend um. Drücken Sie die Eingabetaste , um zur Arbeitsebene des Projekts weitergeleitet zu werden (Abbildung 1B).
  3. Überprüfen Sie, ob die Arbeitsebene die korrekten Abmessungen von 200 mm x 200 mm hat, indem Sie mit der linken Maustaste auf Raster bearbeiten in der unteren rechten Ecke klicken (rotes Quadrat in Abbildung 1B). Stellen Sie im Popup-Fenster (Abbildung 1C) sicher, dass die "Einheiten" Millimeter und die "Voreinstellungen" die Standardeinstellungen sind. Geben Sie 200,00 in die Felder "Breite" und "Länge" ein und klicken Sie auf "Raster aktualisieren ", um die Änderungen zu speichern.
  4. Vergewissern Sie sich, dass das Fangraster auf 1,0 mm eingestellt ist (rotes Quadrat in Abbildung 1B). Ist dies nicht der Fall, klicken Sie auf das Dropdown-Menü und wählen Sie 1,0 mm.
  5. Wählen Sie im Menü Grundformen auf der rechten Seite (blaues Quadrat 2 in Abbildung 1B) einen Volumenkörper aus, und ziehen Sie ihn in die Mitte der Arbeitsebene.
  6. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf eine beliebige Stelle des Felds in der Arbeitsebene, um die Kanten und Eckpunkte anzuzeigen. Klicken Sie auf einen beliebigen Scheitelpunkt (der dann rot wird), um die Abmessungen des Quaders anzuzeigen (rote Quadrate in Abbildung 1D). Klicken Sie mit der linken Maustaste auf jede Dimension und geben Sie 130 mm für die Länge (L), 130 mm für die Breite (B) und 40 mm für die Höhe (H) ein. Zentrieren Sie den Quader neu, indem Sie ihn in die Mitte der Arbeitsebene ziehen.
  7. Klicken Sie auf das Werkzeuglineal in der oberen rechten Ecke des Bildschirms (rotes Quadrat 1 in Abbildung 1E). Klicken Sie sofort auf den unteren linken Eckpunkt des Feldes, wie in Abbildung 1E (rotes Quadrat 2) gezeigt, um den Anfangspunkt (x = 0, y = 0, z = 0) eines dreidimensionalen kartesischen Koordinatensystems festzulegen. Beachten Sie, dass der Abstand zwischen dem ausgewählten Scheitelpunkt und dem Anfangspunkt der Koordinate nun angezeigt wird (rote Quadrate in Abbildung 1F), wobei "A", "B" und "C" den Abstand zur x-, y- und z-Achse darstellen (die in diesem Fall jeweils Null sein sollte).
  8. Wählen Sie als Nächstes ein leeres Feld (Loch) aus dem Menü Grundformen auf der rechten Seite aus (blaues Quadrat 2 in Abbildung 1B) und ziehen Sie es auf die Arbeitsebene. Legen Sie die Abmessungen auf 30 (L) x 30 (B) x 40 (H) mm fest und heben Sie sie um 2 mm von der Arbeitsebene ab, indem Sie "2,00" in das Textfeld neben der grünen Pfeilspitze in der unteren rechten Ecke des leeren Feldes eingeben (rotes Quadrat in Abbildung 1G). Positionieren Sie das leere Feld innerhalb des Volumenkörpers 2 mm vom Anfangspunkt der XY-Koordinate entfernt, indem Sie "2,00" in die Textfelder neben den grünen Pfeilen in der unteren linken Ecke des Feldes eingeben (rote Quadrate in Abbildung 1H; vergleichen Sie mit Abbildung 1G).
  9. Wenn das leere Feld noch ausgewählt ist, drücken Sie die Tasten Strg+D auf der Tastatur, um den Befehl "Duplizieren" auszuführen und ein neues leeres Feld mit genau denselben Abmessungen zu erstellen. Positionieren Sie das neue leere Feld innerhalb des ausgefüllten Feldes neben dem ersten leeren Feld, indem Sie "34.00" in das Textfeld neben dem grünen Pfeil entlang der y-Achse und "2.00" in die Textfelder neben den beiden verbleibenden grünen Pfeilen eingeben (rote Quadrate in Abbildung 1I).
  10. Wiederholen Sie diesen Schritt, und stellen Sie die korrekten Abstände vom Anfangspunkt der Koordinate ein, bis der gesamte Volumenkörper mit leeren Kästen gefüllt ist, die 2 mm voneinander entfernt sind (Abbildung 1J).
  11. Wählen Sie alle Felder (durchgehende und leere) aus, indem Sie mit der linken Maustaste klicken und auf den gesamten Bereich ziehen. Drücken Sie die Tasten Strg+G auf der Tastatur, um den Befehl "group" zu verwenden und ein einzelnes Feld mit 16 leeren Plätzen für Fliegenfläschchen zu erstellen (Abbildung 1K). Dies ist das endgültige Design des Fläschchengesstells.
  12. Klicken Sie auf Exportieren in der oberen rechten Ecke des Tinkercad-Fensters. Wählen Sie im angezeigten Fensterfeld (Abbildung 1L) die Option Alles im Design neben Einschließen aus, und . STL unter Für 3D-Druck als Dateityp. Wählen Sie einen Eigennamen für die Designdatei und speichern Sie sie an einem geeigneten Ort auf dem Computer.

2. 3D Druck

HINWEIS: In diesem Abschnitt geben wir Anweisungen, wie Sie die in Schritt 1 erstellte STL-Datei verwenden und in die G-Code-Datei konvertieren, die die Druckanweisungen für den 3D-Drucker enthält. Dies ist der Slicing-Prozess, für den wir die Repetier-Host-Software verwenden.

  1. Laden Sie die Zusatzdatei 1 herunter und speichern Sie sie an einem geeigneten Ort auf dem Computer. Hierbei handelt es sich um eine .rcp-Datei, die die unten zu verwendenden Druckerkonfigurationen enthält. Weitere Informationen zum Dateityp .rcp finden Sie unter39.
  2. Öffnen Sie die Repetier-Host-Software, die bereits auf dem Computer installiert sein sollte, und befolgen Sie die Anweisungen von37. Drücken Sie die Tasten Strg+O auf der Tastatur, um die STL-Datei auf dem Computer zu öffnen, der in Protokoll 1 erstellt wurde.
  3. Klicken Sie nach dem Öffnen auf das entworfene Fläschchengestell und drücken Sie die R-Taste auf der Tastatur, um das Bearbeitungsmenü auf der rechten Seite des Bildschirms zu öffnen (rotes Quadrat 1 in Abbildung 2A). Zentralisieren Sie das Objekt auf dem Drucktisch, indem Sie auf der Registerkarte Objektplatzierung auf die Schaltfläche Objekt zentrieren klicken, die in Abbildung 2A mit dem roten Quadrat 2 gekennzeichnet ist.
  4. Klicken Sie auf die Registerkarte Slicer (rotes Quadrat 1 in Abbildung 2B) neben der Registerkarte Objektplatzierung , und klicken Sie dann unten auf die Schaltfläche Konfiguration (rotes Quadrat 2 in Abbildung 2B). Beachten Sie, dass sich auf der linken Seite ein neues Fenster öffnet, in dem die Druckerparameter wie Geschwindigkeit, Schichtdicke und Halter definiert werden können (weitere Details finden Sie in der Diskussion unten).
  5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Importieren (rotes Quadrat 3 in Abbildung 2E), wählen Sie Ergänzende Datei 1 aus den Dateien aus und drücken Sie die Eingabetaste. Beachten Sie, dass diese .rcp-Datei (heruntergeladen in Schritt 2.1) die Parameter für die automatische Konfiguration des Druckers enthält, den wir für dieses Fläschchengestell optimiert haben.
  6. Um die Konfiguration der Druckparameter abzuschließen, wählen Sie im Menü auf der rechten Seite die Option Keine für Lagertyp (rotes Quadrat 4 in Abbildung 2E), da für den Druck dieses Teils kein Lager erforderlich ist, um Biegungen oder andere Verformungen zu verhindern. Wählen Sie unter Fülldichte (rotes Quadrat 5 in Abbildung 2E) die Option 20 % aus, um eine Volumenstruktur zu erstellen (weitere Informationen zu diesen Parametern finden Sie in der Diskussion unten).
  7. Klicken Sie auf Slice with CuraEngine in der oberen rechten Ecke des Bildschirms, um das Slicing-Programm auszuführen und den G-Code zu generieren, der die Informationen enthält, die der Drucker zum Drucken des Stücks benötigt. Beachten Sie, dass auf der Registerkarte "Druckvorschau " im Menü auf der rechten Seite (neben der Registerkarte "Slicer ") Informationen über die Zeit und die Menge an Material angezeigt werden, die für die Fertigstellung des Druckauftrags erforderlich sind (rotes Quadrat 1 in Abbildung 2F).
  8. Klicken Sie auf Für SD-Druck speichern , um die G-Code-Datei auf einer SD-Karte zu speichern (rotes Quadrat 2 in Abbildung 2F). Beachten Sie, dass der G-Code die 3D-Koordinaten des entworfenen Teils enthält, die in Schichten geschnitten sind, um die ordnungsgemäße Funktion des Druckers zu gewährleisten.
  9. Legen Sie die SD-Karte in den RepRap 3D-Drucker ein und befolgen Sie dann die auf dem Druckerbildschirm angezeigten Informationen, um den Druck von der SD-Karte auszuwählen.
  10. Wählen Sie die G-Code-Datei des Fläschchenracks aus. Beachten Sie, dass sich der Drucker automatisch aufwärmt und mit dem Drucken des entworfenen Teils beginnt, was mehrere Stunden dauern sollte. Das Gestell (Abbildung 3A) sollte sofort nach Abschluss des Druckauftrags einsatzbereit sein.

3. Geräte zur Verhaltensanalyse

HINWEIS: Die in den Protokollen 1 und 2 beschriebenen Schritte können mit entsprechenden Anpassungen wiederholt werden, um mehrere der benötigten Laborgeräte zu drucken. Wir sind uns jedoch bewusst, dass das Entwerfen neuer Teile für Anfänger von Tinkercad eine Herausforderung und zeitaufwändig sein kann, daher stellen wir anstelle von Schritt-für-Schritt-Protokollen zum Entwerfen aller Modelle mehrere Designmodelle zum Download zur Verfügung, die wir als STL-Dateien erstellt haben (siehe Ergänzende Dateien 2-11).

  1. Laden Sie die ergänzende Datei 2 herunter, um ein Modell eines kleinen Trichters (Abbildung 3B) zu erhalten, der routinemäßig in Flylabs verwendet wird, um erwachsene Fliegen in neue Fläschchen oder Flaschen zu bringen, indem verhindert wird, dass Fliegen an den Innenwänden dieser Behälter hochkriechen, um zu entkommen.
  2. Laden Sie die ergänzende Datei 3 für eine Klopfmattenhalterung (Abbildung 3C) herunter, die einen Ethylen-Vinylacetat-Schaum oder eine dicke Baumwollmatte aufnehmen kann, auf die Glasfläschchen oder -flaschen geklopft werden können, wenn Fliegen in neue Behälter mit frisch zubereiteten Lebensmitteln gekippt werden.
  3. Laden Sie die ergänzende Datei 4 und die ergänzende Datei 5 für das Modell eines Kamerastativs herunter, das wir Stalker genannt haben (Abbildung 3D).
    HINWEIS: Mit dem Gerät kann jede Kamera (professionell, Webcams, Mobiltelefone usw.) auf einer Basis positioniert werden, auf der eine Petrischale mit Larven oder erwachsenen Fliegen abgebildet oder auf Video aufgezeichnet werden kann. Stalker ermöglicht die Abbildung des Verhaltens von Tieren, die horizontal stattfindet, immer im gleichen Abstand zur Petrischale, wodurch vermieden wird, dass Variabilität in die experimentellen Messungen eingeführt wird, wenn die Aufnahmen z.B. an verschiedenen Tagen gemacht werden müssen oder wenn die Kamera zwischen den Aufnahmen für einen anderen Zweck verwendet werden muss. Das Gerät ist praktisch modular aufgebaut und kann nach dem Drucken der Basis und der Oberseite aus der Zusatzdatei 4 und der Seiten aus der Zusatzdatei 5 einfach zusammengebaut werden. Die 1 cm2 großen Quadrate an der Basis, die mit einem Permanentmarker hervorgehoben werden können, helfen dabei, die von den einzelnen Tieren zurückgelegte Strecke zu verfolgen. Drucken Sie das Gerät (zumindest die Basis) mit weißem Filament, so dass genügend Kontrast zwischen dem Hintergrund und den Tieren vorhanden ist, damit die Tracking-Software jede Fliege identifizieren kann.
  4. Laden Sie die ergänzende Datei 6 für das druckbare Design des Fly Motels herunter (Abbildung 3E), das über zehn Balz- und Paarungsarenen (Räume) verfügt, die so organisiert sind, dass Videoaufzeichnungen von jeweils zehn einzelnen Paarungspaaren möglich sind. Beachten Sie, dass das Fly Motel auf dem in40 veröffentlichten Gerät basiert, in dem eine detaillierte Erklärung für seine Verwendung in Verhaltensstudien zu finden ist. Zusätzlich zu den 3D-gedruckten Teilen benötigt das Gerät 12 Schrauben (3 x 8 mm) zur Befestigung des oberen Teils am unteren zur Stabilisierung des zusammengebauten Geräts, eine Acrylplatte (60 x 60 x 3 mm) und einen festen Reißverschluss. Da der Aufbau des Fly Motels komplexer ist, stellen wir auch ein Anleitungsvideo (Supplemental File 7) zur Verfügung, in dem erklärt wird, wie man es richtig zusammenbaut, vorausgesetzt, dass alle benötigten Teile und ein Schraubendreher vorhanden sind.
  5. Laden Sie die ergänzende Datei 8 für das Modell eines T-Labyrinths herunter (Abbildung 3F), das für Gedächtnis-Assays mit adulten Fliegen verwendet wird. Eine detaillierte Erklärung, wie das T-Labyrinth verwendet wird, um Fliegen dazu zu bringen, abstoßende Geruchsreize mit ihrem phototropen Verhalten in Verbindung zu bringen, findet sich in der Originalpublikation41. Das Gerät verwendet auch zwei durchscheinende konische 15-ml-Röhrchen, die üblicherweise in jedem Labor zu finden sind und an den 2 cm breiten kreisförmigen Öffnungen auf jeder Seite des Mittelstücks befestigt sind. Beachten Sie, dass für den Druck des T-Maze eine Stütze erforderlich ist (siehe weitere Details in der Legende zu Abbildung 2). Wählen Sie "Überall" für Stütztyp (rotes Quadrat 4 in Abbildung 2E), nachdem Sie die Schritte 2.1-2.6 oben ausgeführt haben.
  6. Laden Sie die ergänzende Datei 9 und die ergänzende Datei 10 herunter, um die druckbaren Teile unserer Version der Apparatur für schnelle iterative negative Geotaxis-Assays (RING) (Abbildung 3G) zu entwerfen, die zur Durchführung von Kletter-Assays mit erwachsenen Fliegen mehrerer Genotypen oder Umweltbedingungen gleichzeitig verwendet werden, um Ergebnisse in einer standardisierteren und höheren Durchsatzweise zu erzielen42. Das RING-Gerät ist ebenfalls modular aufgebaut und benötigt neben den 3D-gedruckten Teilen weitere Teile, die einfach online oder in einem Baumarkt zu geringen Kosten gekauft werden können: zwei rektifizierte Wellen Φ8 x 300 mm, vier Φ8 mm Linearlager, Gummibänder (oder Stücke einer Schnur), ein 240 x 60 x 20 mm großes Stück Holz für die Basis, und acht Holzschrauben (8 mm), um die gedruckten Teile auf dem Holzsockel zu befestigen. Laden Sie die Zusatzdatei 11 herunter, um Anweisungen zum Zusammenbau des Geräts zu erhalten, sobald alle Teile gedruckt oder gekauft wurden. Eine ausführliche Erläuterung der Verwendung des RING-Geräts findet sich in der Originalveröffentlichung42.

4. Assay zur Beweglichkeit der Larven

HINWEIS: Wir haben dieses Protokoll, das ursprünglich auf Nichols et al.42 basierte, optimiert, um die Auswirkungen der AOX-Expression auf die Entwicklung von Drosophila unter Kältestress zu untersuchen. Die Linien 3xtubAOX25 und w1118, die als Beispiele für AOX-exprimierende bzw. Kontrolllarven verwendet wurden, wurden nach Saari et al.34 auf Standarddiät24 bei 12 °C kultiviert. Wir empfehlen dieses Protokoll, um die Mobilität von Larvenproben jeder genetischen Erkrankung zu analysieren, die unter einer beliebigen Umweltbedingung von Interesse kultiviert wurden.

  1. Bereiten Sie 2%ige Agarplatten vor, indem Sie die entsprechende Menge Agar in entionisiertem Wasser kochen, in φ90 x 15 mm große Petrischalen gießen und sie bei Raumtemperatur erstarren lassen. Für Platten mit einem Endvolumen von je 20 ml verwenden Sie 0,4 g Agar.
  2. Sammeln Sie vorsichtig wandernde L3-Larven von der Seite der Kulturfläschchen/-kolben mit einer Rundzange oder einer Bürste und legen Sie die Individuen weniger als 10 Sekunden lang in eine φ90 x 15 mm große Petrischale mit deionisiertem Wasser, um die an ihrem Körper anhaftenden Speisereste abzuspülen.
  3. Setzen Sie einzelne Larven in Schalen mit Agarose um und warten Sie 5 Minuten, bis sich die Tiere akklimatisiert haben.
  4. Positionieren Sie die Schalen mit der einzelnen Larve auf einem Millimeterpapier (0,2 cm2 Raster) und zählen Sie 1 Minute lang die Anzahl der Linien, die das Tier überquert hat, während es sich auf dem Agar bewegt. Jede gekreuzte Linie stellt einen Abstand von 2 mm dar. Wiederholen Sie den Vorgang mit derselben Person 10-15 Mal, um technische Repliken zu erhalten.
  5. Wiederholen Sie Schritt 4.4 mit mindestens 8-10 Individuen aus verschiedenen Röhrchen/Kolben, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten kultiviert wurden, um biologische Replikate derselben Linie zu erhalten.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 4.4 und 4.5, um Daten für die andere Fliegenschnur zu erhalten (oder für so viele Schnüre, wie Sie analysieren möchten).
  7. Dieselben einzelnen Larven, die in den Schritten 4.4 bis 4.6 verwendet wurden, können verwendet werden, um zusätzliche Daten über Körperbewegungen zu erhalten, indem die Agarschalen mit einer einzelnen Larve unter ein Stereomikroskop gelegt und die Anzahl der peristaltischen Kontraktionen der Körperwand 1 Minute lang gezählt wird. Erhalten Sie technische und biologische Replikate für eine Schätzung der durchschnittlichen Mobilität zwischen den analysierten Fliegenschnüren.
  8. Wenden Sie den statistischen Test an, um die Wahrscheinlichkeit zu berechnen, dass die Werte dieser Parameter der Larvenmobilität zwischen den interessierenden Linien unterschiedlich sind. Da wir hier Daten aus nur zwei Zeilen vergleichen, kann ein Student's t-Test angewendet werden.

5. Mitochondriale Respirometrie mit Larvenhomogenaten

HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde optimiert, um den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch aus Larvenhomogenaten der AOX-exprimierenden Linie 3xtubAOX und der Kontrolle w1118 zu messen, die bei 12 °C kultiviert wurden, aber wir empfehlen es auch für Larvenproben aller genetischen und Umweltbedingungen. Wir sind uns bewusst, dass die Durchführung solcher Experimente im Gegensatz zu allen anderen Protokollen, die wir in diesem Artikel vorstellen, nicht als "erschwingliches" Ziel für ein "selbstgemachtes" Flylab angesehen werden sollte, da eine beträchtliche Anfangsinvestition für ein Labor getätigt werden muss, um ein hochauflösendes Oxygraph zu erwerben. Das Protokoll soll mit dem Oxygraph-2k (O2k) und der DatLab-Software von Oroboros Instruments verwendet werden, so dass eine weitere Optimierung erforderlich ist, falls das Lesegerät ein alternatives Gerät verwenden möchte.

  1. Schalten Sie das O2k ein und starten Sie die DatLab-Software auf dem Computer, der mit dem Oxygraphen verbunden ist. Die Magnetstäbe in den Assay-Kammern sollten automatisch zu rühren beginnen. Entfernen Sie die Ethanol-Lagerlösung aus den Kammern.
  2. Waschen Sie die Kammern mindestens 3 Mal mit 100% Ethanol und 3 Mal mit Reinstwasser.
  3. In DatLab öffnet sich automatisch das Fenster O2k Control . Geben Sie unter Blocktemperatur [°C] 12 °C (oder die bevorzugte Temperatur im Bereich von 2-47 °C) ein und drücken Sie OK.
  4. Ein zweites Fenster, Experiment bearbeiten, wird dann automatisch geöffnet. Geben Sie in den Beispielfeldern Probennamen ein, je nachdem, was in den Kammern A und B hinzugefügt wird, und drücken Sie Speichern.
  5. In jede Kammer werden 1800 μl des Assay-Puffers (120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 3 mM Hepes, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 2% BSA, pH 7,4) gegeben und teilweise verschlossen, wobei der Sauerstoffaustausch mit der Außenluft möglich bleibt. Lassen Sie die Signale für die Sauerstoffkonzentration und den Sauerstofffluss stabilisieren und zeigen Sie minimale Schwankungen für mindestens 10 Minuten. Dieser Schritt ermöglicht die Kalibrierung des Geräts mit der Außenluft am Tag des Experiments (siehe Schritte 6.3 und 6.4 unten für weitere Einzelheiten zu experimentellen Kalibrierungen).
  6. Während des Schritts der Luftkalibrierung ist die Probenvorbereitung einzuleiten, indem mit einer Pinzette oder einem kleinen Pinsel vorsichtig 20 wandernde Larven des entsprechenden Genotyps aus den Kulturröhrchen/-kolben entnommen werden.
  7. Spülen Sie jede Larve schnell, aber gründlich mit deionisiertem Wasser oder 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 und 2 mM KH2PO4) ab und geben Sie sie in einen 1 mL Glashomogenisator auf Eis, der 500 μL eiskalten Isolationspuffer (250 mM Saccharose, 5 mM Tris HCl, 2 mM EGTA, pH 7,4)
  8. Homogenisieren Sie die ganzen Larven mit 5 Hüben und gießen Sie das Homogenat in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
  9. Geben Sie 300 μl Isolationspuffer in den Glashomogenisator, mazerieren Sie das verbleibende Larvengewebe mit 3 Hüben weiter und gießen Sie das Homogenat erneut in dasselbe Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
  10. Geben Sie 200 μl Isolationspuffer in den Glashomogenisator, mazerieren Sie das verbleibende Larvengewebe mit 2 Hüben weiter und gießen Sie das Homogenat erneut in dasselbe Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
  11. Mischen Sie das endgültige Homogenat (~1 ml), indem Sie das Röhrchen zweimal vorsichtig umdrehen und auf Eis halten, bis die zweite Probe verarbeitet wird.
  12. Die Schritte 5.6 bis 5.11 werden wiederholt, um das Larvenhomogenat des anderen Genotyps zu erhalten.
  13. Öffnen Sie die Oxygraph-Kammern A und B und überführen Sie 200 μl jedes Homogenats in den Assay-Puffer in jeder Kammer, der zu diesem Zeitpunkt genau bei 12 °C liegen muss. Schließen Sie die Kammern vollständig und lassen Sie die Sauerstoffkonzentration und die Sauerstoffflusssignale ca. 10 Minuten lang stabilisieren.
  14. Die Messung des Sauerstoffverbrauchs wird eingeleitet, indem in jede Kammer 5 μl einer Lösung von 2 M Pyruvat, 2 M Prolin (Endkonzentration in den Kammern = je 5 mM) und 7,5 μl einer Lösung von 0,4 M Malat (1,5 mM) gegeben werden. Planen Sie mindestens 5 Minuten für die Signalstabilisierung ein. Beachten Sie, dass die Mitochondrien zu diesem Zeitpunkt mit oxidierbaren Substraten aufgeladen werden, um die Reaktionen des Tricarbonsäure (TCA)-Zyklus zu initiieren. Ein Anstieg des Sauerstoffverbrauchssignals kann auf die Funktionen der Entkopplungsproteine (oder auf andere Entkopplungsphänomene) zurückzuführen sein und kann zur Berechnung der allgemeinen entkoppelten Atmung verwendet werden (auch als Leckatmung in Abwesenheit von Adenylaten bezeichnet, LN- siehe Repräsentative Ergebnisse für Details).
  15. In jede Kammer werden 4 μl einer Lösung von 0,5 M ADP (1 mM) gegeben und mindestens 5 Minuten zur Signalstabilisierung gelassen. In der Regel wird sofort ein signifikanter Anstieg des Sauerstoffverbrauchssignals beobachtet, der die oxidative phosphorylative (OXPHOS) Atmung darstellt. Der überwiegende Teil dieser OXPHOS-Atmung wird durch den Komplex I (CI) angetrieben.
  16. In jede Kammer werden 2 μl einer Lösung von 0,05 M Antimycin A (0,05 mM) gegeben, um CIII zu hemmen, und mindestens 5 Minuten zur Signalstabilisierung gelassen. Eine Abnahme des Sauerstoffverbrauchssignals auf die Basalwerte vor der Zugabe von Pyruvat, Prolin und Malat sollte für die Kontrollprobe w1118 beobachtet werden. Die mitochondriale Atmung von AOX-exprimierenden Larven wird teilweise resistent gegen Antimycin-A sein, da die Elektronen nun zu AOX geleitet werden können. Etwa 40 % der gesamten OXPHOS-Atmung sollten nach der CIII-Hemmung verbleiben, wobei alle ausschließlich durch AOX unterstützt werden sollten.
  17. In jede Kammer werden 4 μl einer Lösung von 0,1 M Propylgallat (0,2 mM) gegeben, um AOX zu hemmen, und mindestens 15 Minuten für die Signalstabilisierung eingehalten. Der Sauerstoffverbrauch in den AOX-exprimierenden Larvenproben sollte nun auf die Basalwerte vor der Zugabe von Pyruvat, Prolin und Malat sinken. Diese Abnahme beweist, dass die beobachtete Antimycin-A-resistente Atmung auf die AOX-Funktion zurückzuführen ist.
  18. Geben Sie in jede Kammer 1 μl 0,01 M Rotenon (0,005 mM), um das CI zu hemmen, und warten Sie mindestens 5 Minuten für die Signalstabilisierung, um das Sauerstoffverbrauchssignal der Probe unabhängig von der mitochondrialen Atmung zu erhalten. Dieses Signal ist in der Regel so gering wie das, das vor der Zugabe von Pyruvat, Prolin und Malat beobachtet wurde.
  19. Speichern Sie das Experiment und schließen Sie die DatLab-Software.

6. Datenverarbeitung der mitochondrialen Respirometrie

HINWEIS: Die Sauerstoffverbrauchswerte werden als Durchschnitt der Sauerstoffflusssignale in einem bestimmten Zeitraum ermittelt und als pmol O2 pro Sekunde pro mg Gesamtprotein in der Probe ausgedrückt. Die Werte werden zunächst mit der am Tag des Versuchs verfügbaren maximalen Sauerstoffkonzentration im Assay-Puffer verglichen, basierend auf der Versuchstemperatur (als Luftsättigung bezeichnet), und der minimalen Sauerstoffkonzentration, die zuvor in jeder Kammer durch Zugabe von Na2S2O4 zum Assay-Puffer bestimmt wird (siehe 43 für die Richtlinien des Herstellers zur Erlangung einer Null-Sauerstoff-Kalibrierung). Die Werte werden auch durch die Menge an Gesamtprotein in den Larvenhomogenaten normalisiert, die dem Assay-Puffer jeder Kammer zugesetzt werden.

  1. Die Gesamtproteinkonzentration jeder Probe wird nach der Bradford-Methode44 bestimmt. Öffnen Sie das gespeicherte Experiment in der DatLab-Software erneut, drücken Sie im oberen Menü auf Experiment und dann auf Bearbeiten. Wählen Sie im geöffneten Fenster im Abschnitt Einheit die Option mg aus und geben Sie im Abschnitt Menge die Proteinmenge ein, die in den 200 μl der Probe enthalten ist, die in jeder Kammer hinzugefügt wurden. Die Konzentration wird automatisch von der Software unter Berücksichtigung des Gesamtkammervolumens von 2 mL berechnet. Drücken Sie die Schaltfläche Speichern .
  2. Drücken Sie im oberen Menü auf Diagramm und dann auf Diagramme auswählen. Wählen Sie im geöffneten Fenster für beide Diagramme die Option Flussmittel pro Masse aus (1 und 2, die sich auf die Kammern A bzw. B beziehen). Drücken Sie OK. Das experimentelle Ergebnis wird nun durch die Proteinkonzentration der Proben (pmol O2/s/mg Gesamtprotein) normalisiert.
  3. Klicken Sie in der oberen rechten Ecke jedes Diagramms (1 und 2) der Hauptseite mit den experimentellen Ergebnissen auf O2 Konzentration. Identifizieren Sie entlang der x-Achse einen Zeitbereich vor der Zugabe der Proben in die Kammern, in dem die Sauerstoffkonzentrations- und Flusssignale sehr stabil sind.
    1. Halten Sie die Umschalttaste auf der Tastatur des Computers gedrückt, klicken Sie mit der linken Maustaste auf die ursprünglich ausgewählte Zeit, ziehen Sie den Cursor entlang der Zeitachse, um den gewünschten Bereich auszuwählen, und lassen Sie die Maustaste los. Führen Sie dieses Verfahren für jedes der Diagramme einzeln aus.
    2. Doppelklicken Sie auf die blauen Balken der ausgewählten Bereiche am unteren Rand der Diagramme und geben Sie "Luft" ein, um anzugeben, dass dies die ausgewählten Bereiche sind, die zur Berechnung der Sauerstoff-Luft-Sättigung verwendet werden.
  4. Klicken Sie in der oberen Menüleiste auf Kalibrierung und wählen Sie A: Sauerstoff, O2 , um Kammer A zu kalibrieren. Vergewissern Sie sich, dass im geöffneten Fenster O2 Calib ausgewählt ist (gelbe Farbe).
    1. Für die Nullkalibrierung klicken Sie auf Aus Datei kopieren und wählen Sie die Datei mit der zuvor durchgeführten Null-Sauerstoff-Kalibrierung aus (siehe 43 für die Herstellerrichtlinien).
    2. Wählen Sie für die Luftkalibrierung die Option Luft in der Spalte Markierung auswählen aus. Klicken Sie auf Kalibrieren und in die Zwischenablage kopieren.
  5. Klicken Sie in der oberen Menüleiste auf Kalibrierung , wählen Sie B: Sauerstoff, O2 und wiederholen Sie Schritt 6.4, um Kammer B zu kalibrieren.
  6. Klicken Sie in der oberen rechten Ecke jedes Diagramms (1 und 2) der Hauptseite mit den experimentellen Ergebnissen auf O2 flux per masse. Wählen Sie die gewünschten stabilen Bereiche des Sauerstoffverbrauchssignals aus, indem Sie die Umschalttaste auf der Tastatur gedrückt halten, mit der linken Maustaste klicken und den Cursor entlang der Zeitachse ziehen. Die stabilen Regionen, die zwischen den Zusätzen von Pyruvat/Prolin/Malat und ADP ausgewählt wurden, stellen das LN dar; zwischen ADP und Antimycin A, OXPHOS; zwischen Antimycin A und Propylgallat (bei CIII Hemmung), Antimycin A-resistente Atmung; zwischen Propylgallat und Rotenon (bei CIII+AOX-Hemmung), Restatmung; nach Rotenon (nach CI+CIII+AOX-Hemmung), verbleibende nicht-mitochondriale Atmung. Doppelklicken Sie auf die roten Balken der markierten Bereiche am unteren Rand der Diagramme und geben Sie die entsprechenden Beschriftungen ein.
  7. Klicken Sie in der oberen Menüleiste auf Markierungen und dann auf Statistiken. Deaktivieren Sie auf der Registerkarte Anzeigen des geöffneten Fensters alle Optionen außer Ø2 Flussmittel pro Masse. Wählen Sie auf der Registerkarte Auswählen desselben Fensters die Option Kammer A aus, um die Atmungsdaten für die erste Probe zu erhalten. Klicken Sie auf In Zwischenablage kopieren und fügen Sie die Daten in eine Tabelle ein. Wiederholen Sie den Vorgang, um die Daten für die zweite Probe in Kammer B zu erhalten.
  8. Subtrahieren Sie in einer Tabelle alle Atmungswerte von der verbleibenden nicht-mitochondrialen Atmung (die Daten nach Rotenonzugabe). Berechnen Sie Durchschnittswerte aus mehreren experimentellen Replikationen, und stellen Sie die Daten nach Belieben dar.

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Ergebnisse

Wenn man die Schritte in den Protokollen 1 und 2 befolgt, sollte man in der Lage sein, ein einfaches Fliegenfläschchengestell zu entwerfen und die STL-Modelldatei durch das Slicing-Programm laufen zu lassen, um Koordinaten für den 3D-Drucker zu generieren. Abbildung 3A zeigt eine gedruckte Einheit des Modells neben seinem Design. Wir hoffen auch, dass Schritt 1 die grundlegenden Fähigkeiten vermitteln kann, um die in der Tinkercad-Plattform verfügbaren Grundformen zu verwenden, um nützliche ...

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Diskussion

Die hier zur Verfügung gestellten 3D-Druckprotokolle und STL-Dateien sollen den Aufbau eines neuen Flylabs erleichtern oder das Repertoire an Geräten in einer bestehenden Drosophila-Verhaltenseinrichtung mit "selbstgebauten" Geräten erweitern. Die 3D-Druckstrategie kann besonders in Entwicklungsländern wie Brasilien nützlich sein, wo die Forschung mit Drosophila als Modellorganismus für die Erforschung der Humanbiologie unterrepräsentiert zu sein scheint und Spezialausr...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Wir danken Emily A. McKinney für die englische Bearbeitung des Manuskripts. G.S.G. wurde durch ein Stipendium des Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Förderkennzeichen 141001/2019-4) unterstützt. M.T.O. bedankt sich bei der Finanzierung durch die Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, Fördernummern 2014/02253-6 und 2017/04372-0) und die CNPq (Fördernummern 424562/2018-9 und 306974/2017-7). C.A.C.-L. möchte sich bei der internen finanziellen Unterstützung durch die Universidade do Oeste Paulista bedanken. Die Arbeit mit genetisch veränderten Drosophila-Linien wurde vom Lokalen Ausschuss für biologische Sicherheit (CIBio) der Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal gemäß den Protokollen 001/2014 und 006/2014 und vom Nationalen Technischen Ausschuss für biologische Sicherheit (CTNBio) gemäß den Protokollen 36343/2017/SEI-MCTIC, 01200.706019/2016-45 und 5488/2017 genehmigt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3D-Drucker RapRepEin beliebter 3D-Drucker basierend auf dem Prusa I3 DIY-Modus, Anleitung verfügbar in https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisited/
3xtubAOX FliegenschnurHowy Jacobs´ s Labor, UniversitätDrosophila-Linie, die das AOX-Gen von C. intestinalis unter der Kontrolle des konstitutiven α-Tubulin-Promotors exprimiert. 5 bzw. 6 Kopien dieses Konstrukts sind bei Männern bzw. Frauen in Homo/Hemizigotie vorhanden, jeweils eine in den Chromosomen X, 2 und 3.
Acrylplatte60 x 60 x 3 mm
ADPSigma-AldrichA2754Adenosin-5&prime-diphosphat-Natrium sal (CAS-Nummer 20398-34-9); ≥ 95%; Molekulargewicht = 427,20 g/mol; Löslichkeit in Wasser bei 50 mg/ml
Antimycin-ASigma-AldrichA8674Antimycin A aus Streptomyces sp. (CAS-Nummer 1397-94-0); Molekulargewicht ~ 548,63 g/mol; Löslichkeit in 95% Ethanol bei 50 mg/ml
AgarKasvK25-611001Für bakteriologische Anwendungen; Pulver; Verfestigungsmittel (12-20 g/L)
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-AldrichA7030Hitzeschockfraktion, proteasefrei, fettsäurefrei, im Wesentlichen globulinfrei (CAS-Nummer 9048-46-8); pH-Wert 7; ≥ 98%; Löslichkeit in Wasser 40 g/ml
Deionisiertes Wasser
EGTASigma-AldrichE4378Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (CAS-Nummer 67-42-5); ≥ 97%; Molekulargewicht = 380,35 g/mol
Ethanol 99,5 %
Ethylen-Vinylacetat-SchaumKann durch dicke Baumwollstücke ersetzt werden
Millimeterpapier0,2 cm2 Gitter
HepesSigma-AldrichH40344-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure (CAS-Nummer 7365-45-9), BioPerformance-zertifiziert; ≥ 99,5% (Titration), zellkultiviert getestet; Molekulargewicht = 238,30 g/mol
HomogenisatorSartoriusHandglas-Homogenisator (S), 1 mL; bestehend aus einem Zylinder aus Borosilikatglas plus Kolben S; wird häufig für die einfache Probenvorbereitung verwendet, z. B. zum Zerkleinern von Gewebeproben.
KClAmresco0395-2Kaliumchlorid (CAS-Nummer 7447-40-7); ≥ 99,0%; Molekulargewicht = 74,55 g/mol
KH2PO4Sigma-AldrichP5379Kaliumphophat einbasisch (CAS-Nummer 7778-77-0); ReagentPlus; Molekulargewicht = 136,09 g/mol
Linearlager (LM8UU)8 mm, beliebige Marken
MalatSigma-AldrichM1000L-(-)-Apfelsäure (CAS-Nummer 97-67-6); ≥ 95-100%; Molekulargewicht = 134,09 g/mol), Löslichkeit in Wasser: 100 mg/ml. Eine Lösung wird auf einen pH-Wert von ca. 7,0 eingestellt.
MgCl2Amresco0288-1KGMagnesiumchlorid, Hexahydrat (CAS-Nummer 7791-18-6); 99%-102%; Molekulargewicht = 203,3 g/mol
Mikrozentrifugenröhrchen1,5 ml; Abschluss alle 100µ L, autoklavierbar
Na2HPO4Amresco0348-1KGNatriumphosphat, zweibasisch, Heptahydrat (CAS-Nummer 7782-85-6); 98-102%; Molekulargewicht = 268,07 g/mol
NaClHoneywell31434-1KGNatriumchlorid (CAS-Nummer 7647-14-5); ≥ 99,5%; Molekulargewicht 58,44 g/mol. Nur für Laborzwecke.
Oxigraph-O2kOroboros10000-02Serie D-G; O2k-Core: bestehend aus O2k-Haupteinheit mit Edelstahlgehäuse, O2k-Assembly Kit, zwei OroboPOS (polarographische Sauerstoffsensoren) und OroboPOS-Service Kit, DatLab Software, das ISS-Integrated Suction System und das O2k-Titration Set.
PermanentmarkerVorzugsweise schwarze
Petrischalen90 x 15 mm Schale; häufig für bakteriologische Kulturen verwendet
PLA 3D-Druck-FilamentQuantum3D-Druckhttp://quantum3dprinting.com/Hochwertiges Polylasäure-Filament (PLA), dringend empfohlen, (1,0 kg Rolle), jede Marke
ProlineSigma-AldrichP0380L-Prolin (CAS-Nummer 147-85-3); Pulver; 99%; Molekulargewicht = 115,13 g/mol
PropylgallatSigma-AldrichP3130Propylgallat (CAS-Nummer 121-79-9); Pulver; ≥ 98%; Molekulargewicht = 212,2 0 g/mol; Löslichkeit in Ethanol bei 50 mg/ml
PyruvatSigma-AldrichP2256Natriumpyruvat (CAS-Nummer 113-24-6), ≥ 99%; Molekulargewicht = 110,04 g/mol; Löslichkeit in Wasser bei 100 mg/mL
Gleichgerichtete Wellen8 x 300 mm, alle Marken
RotenonSigma-AldrichR8875Roteton (CAS-Nummer 83-79-4); ≥ 95%, Molekulargewicht 394,42 g/mol
GummibänderKann durch Stücke einer Schnur ersetzt werden
SchraubendreherZum Zusammenbau einiger der 3D-gedruckten Geräte
ScreewsM3 x 8 mm
SD-KarteMindestens 32Mb groß; in der Regel mit 3D-Druckern versehen
Software Repetier HostHot-World GmbH & Co. KGhttps://www.repetier.com/Ausgezeichnete Slicing-Software, kostenlos erhältlich
Software TinkercadAutodeskhttps://www.tinkercad.com3D-Modelldesign-Software, kostenlos erhältlich
StereomikroskopLeicaM-80Stereomikroskop, Zoom 7,5-60X + Leica cls 150 LED-Lichtquelle
SaccharoseMerck107.651.000Saccharose für den mikrobiologischen Gebrauch (CAS-Nummer 57-50-1);
TrisAmersham Biosciences17-1321-01Tris (Hydroxymethyl)-aminomethan (CAS-Nummer 77-86-1); 99,8-100,1%; Molekulargewicht 121,14 g/mol
Pinzette/PinzetteStarkST08710Histologische Pinzette, gerade, runde Spitze, 12 cm, AISI-410 Edelstahl
w1118 FliegenschnurHowy Jacobs´ s lab, UniversitätDrosophila-Linie als genetische Hintergrundkontrolle für 3XtubAOX
>Holzplatte240 x 60 x 20 mm
Zip-Strumpfhose2 x 210 mm, jede Marke
Tampere Tampere

Referenzen

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